小麥細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因TaRanGAP的克隆及表達(dá)分析摘要小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，但其產(chǎn)量受到干旱、鹽漬和病害等多種脅迫的影響。大量研究表明細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)參與調(diào)控植物脅迫應(yīng)答，本課題旨在克隆小麥細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控關(guān)鍵基因TaRanGAP，分析其分子進(jìn)化及受多種脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)水平，為解析小麥核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及抗逆遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。本課題將利用同源克隆在小麥品種山農(nóng)27和煙農(nóng)999中克隆小麥基因TaRanGAP；探究蛋白R(shí)anGAP在單子葉和雙子葉植物中的分子進(jìn)化；分析基因TaRanGAP在小麥不同組織及多種脅迫下的表達(dá)水平。結(jié)果表明：我們成功克隆出小麥基因TaRanGAP，發(fā)現(xiàn)蛋白R(shí)anGAP在單子葉和雙子葉植物中高度保守；基因TaRanGAP在小麥莖中表達(dá)量略高于葉，小麥葉片中TaRanGAP的表達(dá)受到水楊酸處理的誘導(dǎo)，受到PEG8000、NaCl和脫落酸處理的抑制。關(guān)鍵詞：小麥細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)TaRanGAP分子進(jìn)化表達(dá)分析CloningandexpressionanalysisofTaRanGAP,akeyregulatorinnucleartransport,incommonwheatAbstractCommonwheat(TriticumaestivumL.)isoneofthemostimportantcropsinChina.However,wheatproductionisnegativelyregulatedbyvariousstressesincludingdrought,salinityandplantdiseases.Increasingevidencerevealthatnucleartransportplaysanimportantroleinregulationofplantresponsestostresses.Inthisstudy,wewillisolatewheatTaRanGAP,akeyregulatorofnucleartransport,andanalyzeitsmolecularevolutionandexpressionprofiles.Theresultsofthisstudywillnotonlyenrichourknowledgeaboutthemechanisminregulationofwheatnucleartransport,butalsoprovidethetheoreticalguidanceforthewheatmolecularbreedingforresistanceagainstbioticandabioticstresses.Inthisstudy,wewillemploythehomology-basedcloningtechniquetoisolatethegeneTaRanGAPfromwheatcultivarsShannong17andYannong999.Furthermore,wewillstudythemolecularevolutionofRanGAPinmonocotanddicotplants.Moreover,wewillanalyzetheexpressionlevelsofTaRanGAPinplanttissuesorinresponsetomultipleabioticstresses.Here,weidentifiedthegeneTaRanGAPfromwheatcultivarsShannong17andYannong999andfoundthattheproteinsRanGAPwerehighlyconservedamongmonocotanddicotplants.Inaddition,theexpressionlevelofTaRanGAPinwheatstemswashigherthanthatinleaves.Atlast,wefoundthattheTaRanGAPtranscriptionwasslightlyactivatedbysalicylicacidtreatment,butsuppressedbyapplicationwithPEG8000,NaClandABA.Keywords:commonwheatnucleartransportTaRanGAPmolecularevolutionexpressionanalysis目錄TOC\o"1-4"\f\h\z\u第一章文獻(xiàn)綜述 第一章文獻(xiàn)綜述引言1.1細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制細(xì)胞核是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，是控制真核生物生命活動(dòng)的核心部位。真核細(xì)胞的DNA復(fù)制，RNA轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)翻譯都在特定區(qū)域完成。因此，細(xì)胞核內(nèi)外的RNA，蛋白質(zhì)等分子的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)細(xì)胞正常的生命活動(dòng)起著尤為重要的作用[1-3]。細(xì)胞核由內(nèi)外兩層核膜包被，核膜上鑲嵌有核孔復(fù)合體(nuclearporecomplex，NPC)。大量研究表明，核內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)都需要經(jīng)過(guò)核孔復(fù)合體，分為主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)[4]。生物大分子如蛋白質(zhì)和核酸進(jìn)出細(xì)胞核為主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，必須借助轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白，以能量依賴(lài)的形式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。參與核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白主要有三種：分子接頭蛋白，Importinβ超家族為主的核轉(zhuǎn)運(yùn)受體和RanGTP酶系統(tǒng)[5,6]。Importinα在蛋白質(zhì)入核過(guò)程中起著接頭蛋白的作用，一端識(shí)別并連接貨物蛋白，另一端連接Importinβ或其同系物上。Importinβ識(shí)別核孔蛋白并與之結(jié)合，引導(dǎo)蛋白入核[7,8]。Ran是GTPaseras蛋白家族成員之一，進(jìn)化上十分保守。研究表明Ran蛋白通過(guò)在GTP和GDP兩種結(jié)合狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變來(lái)調(diào)控物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞核。其中，核膜兩側(cè)的RanGTP濃度差異是核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的能量代謝基礎(chǔ)。大量研究證實(shí)蛋白分子進(jìn)入細(xì)胞核是通過(guò)Importinα/β引導(dǎo)機(jī)制[9-12]。目前這種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制已研究的比較清楚，其主要過(guò)程為：首先，Importinβ-RanGTP復(fù)合體在胞質(zhì)一側(cè)與NPC結(jié)合；然后，含有核定位序列(nuclearnulocalizationsquence，NLS)的貨物蛋白通過(guò)importinα結(jié)合在importinβ上；在RanGTP酶活化因子、RanGAP（RanGTPase-activatingprotein）的作用下，形成轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體RanGDP-importinβ-importinα-貨物蛋白[13-15]。隨后，轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體通過(guò)核孔復(fù)合體進(jìn)入胞核內(nèi)；通過(guò)GTP鳥(niǎo)苷酸交換因子RCCl的作用，GDP轉(zhuǎn)換為GTP，使importinα和貨物蛋白從轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體中解離，完成入核轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。最后RanGTP-importinβ復(fù)合體返回細(xì)胞質(zhì)，importinα在核輸出受體exportin的幫助下返回細(xì)胞質(zhì)。1.2植物中細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)組分細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白在真核生物中高度保守，已有研究中表明，各類(lèi)真核細(xì)胞的核轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程大致相同。比如，植物和動(dòng)物之間核轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白呈現(xiàn)高度序列相似性，在人工構(gòu)建的半細(xì)胞體系中，目的蛋白可以由植物細(xì)胞質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)入動(dòng)物細(xì)胞核[16]。同時(shí)，在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因AtKPNB1，該基因是人類(lèi)的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白KPNB1(importinβ1)的同源基因，參與調(diào)控?cái)M南芥核蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[17]。但是，不同生物的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)又有獨(dú)特的調(diào)控方式，植物與動(dòng)物也呈現(xiàn)一定的特異分化[18-20]。在動(dòng)物中開(kāi)展的研究為植物核轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵蛋白的探究提供理論基礎(chǔ)。1.3RanGAP的調(diào)控組分Ran(Ras-relatednuclear)是一種Ras相關(guān)的GTPase，分子量為24kDa。在真核細(xì)胞一系列生命活動(dòng)中，例如DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和加工、RNA和蛋白質(zhì)的核質(zhì)運(yùn)輸、有絲分裂和減數(shù)分裂的調(diào)控，包括紡錘體的組裝、染色體正確分配、核膜破裂與重組等過(guò)程，都有Ran的參與[18-20]。Ran在真核生物中從酵母到人類(lèi)都高度保守[21,22]。在細(xì)胞中狀態(tài)分為有活性的RanGTP和無(wú)活性的RanGDP，細(xì)胞核兩側(cè)較高的RanGTP濃度梯度決定了核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的方向。RanGTP與RanGTP的濃度受Ran的調(diào)節(jié)蛋白GEF(guaninenucleotideexchangefactor)和RanGAP(RanGTPaseactivatingprotein)的精密調(diào)控。在細(xì)胞質(zhì)中RanGAP能激活RanGTPases的活性，RanGTP輸出復(fù)合物的向核外轉(zhuǎn)運(yùn)不需要水解Ran結(jié)合的GTP。最近研究證實(shí)，擬南芥RanGAP1(AtRanGAP1)缺乏哺乳動(dòng)物RanGAP的SUMO化的C-末端區(qū)，但卻含有一種植物所特有的N-末端區(qū)，該區(qū)域使RanGAPl能在間期核膜上定位[23,24]。AtRanGAPl獨(dú)特的有絲分裂運(yùn)輸方式（如定位于向外擴(kuò)展的細(xì)胞板邊緣），與脊椎動(dòng)物不同。在此過(guò)程中，N-末端區(qū)決定了AtRanGAP1的作用方向。與此同時(shí)，擬南芥中已經(jīng)證明存在一種新型的植物特異性核孔相關(guān)蛋白，是在根分生組織中RanGAP錨定到擬南芥的核膜所必需的[25,26]。這些研究揭示了RanGAP錨定核孔這一過(guò)程在動(dòng)植物中是通過(guò)兩種不同的方式完成的。1.4植物細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)與抗逆性在生物大分子進(jìn)出細(xì)胞核的運(yùn)輸過(guò)程中，核孔蛋白（nucleo-porin，Nup）、載體蛋白(karyopherin)和小G蛋白R(shí)an行使著重要功能。井然有序的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)的精密調(diào)控是必不可少的，也是植物響應(yīng)外界刺激的重要環(huán)節(jié)。當(dāng)溫度、光、營(yíng)養(yǎng)狀況等外界因素改變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)激素水平的變化，從而影響植物的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[27]。因此，核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的深入研究，對(duì)提高植物抗逆性及物種的改良具有重要意義[28,29]。例如，在植物系統(tǒng)性獲得抗性（systemicacquiredresistance,SAR）的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)擬南芥中至少有7種Importin和NUP與其抗病性有關(guān)[30]。除此之外，特定基因的表達(dá)可能受多種激素的共同影響，進(jìn)而說(shuō)明分子核轉(zhuǎn)運(yùn)的競(jìng)爭(zhēng)或協(xié)同作用或許是信號(hào)交叉調(diào)控的重要機(jī)制。1.5小麥的研究前景小麥（Triticumaestivum），小麥屬植物的總稱(chēng)，單子葉，禾本科植物，是我國(guó)重要的糧食作物。因此小麥的生產(chǎn)質(zhì)量和優(yōu)質(zhì)育種與人類(lèi)的生產(chǎn)生活息息相關(guān)。但是，小麥的產(chǎn)量受到干旱、鹽漬和病害等多種脅迫的影響。目前小麥的基因組測(cè)序已完成，2017年，中國(guó)農(nóng)科院作物科學(xué)研究所完成了D基因組精細(xì)圖譜的繪制，并首次得到了小麥D基因組的完整圖譜。為研究小麥中各種基因的功能與抗性的提高打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)是細(xì)胞生命活動(dòng)、表達(dá)調(diào)控與信號(hào)傳遞的關(guān)鍵，該過(guò)程在小麥當(dāng)中的研究甚少，通過(guò)研究核質(zhì)運(yùn)輸關(guān)鍵蛋白相關(guān)的作用機(jī)制，從而尋求小麥品質(zhì)提升與抗性提高的方法。第二章實(shí)驗(yàn)部分2.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器2.1.1實(shí)驗(yàn)材料小麥品種山農(nóng)27（sn27）和煙農(nóng)999（yn999）2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑（1）TRIzol（青島海螺生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：#HA0201）（2）TAE緩沖液（50x）：稱(chēng)量Tris24.2g、Na2EDTA·2H2O3.72g、冰醋酸5.71mL，加水至100mL。（使用前稀釋50倍，得到TAE緩沖液（1x），常溫保存?zhèn)溆茫?）2×TaqPlusPCRMasterMix（北京睿博興科生物技術(shù)有限公司）（4）瓊脂糖（BIOWEST）（5）DuRed（FANBOBIOCHEMICALS，貨號(hào)：#009-500ul）（6）Murashige&SkoogBasalMediumwithVitamins(PhytoTechnologyLaboratories，貨號(hào)：#M519)（7）水楊酸（Salicylicacid，索萊寶生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：69-72-7）（8）PEG8000（索萊寶生物技術(shù)有限公司）（9）PrimeScriptTMⅡ1ststrandcDNASynthesisKit（TAKARABIOINC.，貨號(hào)：#6210A/B）（10）GelExtractionKit快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)：#CW2302）（11）液氮（12）三氯甲烷（13）3MNaAcpH5.2(RNase-free),（14）ddH2O(RNase-free)（15）無(wú)水乙醇（16）0.1MNaCl（17）30mM脫落酸母液（abscisicacid，ABA）2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器（1）QUANTUM-ST5自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（2）JY300C型電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）（3）HW?SY21-KP4型電熱恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司）（4）HC-2518高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）（5）TGL16M高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）（6）BCD-236WM(E)電冰箱（合肥美的電冰箱有限公司）（7）RXZ-500E智能人工氣候箱（寧波江南儀器廠）（8）EppendorfAG22331PCR儀（9）WD900SL23-2格蘭仕微波爐（10）CP413電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）（11）PHS-3CPH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）（12）微量移液器（2.5μL，10μL，200μL，1000μL）（13）研缽（14）Eppendorf管2.1.4檢索網(wǎng)站及處理軟件TAIR(TheArabidopsisInformationResource)：/NCBI（NationalCenterofBiotechnologyInformation）：/URGI

（UnitédeRechercheGénomiqueInfo）：https://urgi.versailles.inra.fr/blast/EditseqMegAlignMEGA7.02.1.5引物RanGAPF1：5'-TGAAGTGCCACGTGTCCAC-3'RanGAPR1：5'-TAAACCGAACCGCCAGACC-3'RanGAPF2：5'-CGAGCCTGACGCTGAAGC-3'RanGAPR2：5'-AAAGGGTCCAGGCTTGAC-3'oligodT：5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'RT-PCRF1：5'-CGGCGGTCGCGAAGTCTCTG-3'RT-PCRR1：5'-CCCTCGGGCTCGTTCTCGTC-3'RT-PCRF2：5'-AACGCGAACTACATCCCAGACG-3'RT-PCRR2：5'-CGAGCCGAGACCAGCATCC-3'TaGAPDH-F：5'-TTAGACTTGCGAAGCCAGCA-3'TaGAPDH-R：5'-AAATGCCCTTGAGGTTTCCC-3'2.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程2.2.1小麥的培養(yǎng)取一潔凈培養(yǎng)皿，底層鋪上一層濾紙將小麥種臍朝下平鋪于濾紙上，再蓋上一層濾紙，用水潤(rùn)濕，最后蓋上培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)（溫度為20℃，濕度為60%）3天。待根生長(zhǎng)良好，將培養(yǎng)皿的蓋去除，揭掉上層濾紙，蓋一層脫脂棉，配置濃度為1%的Murashige&Skoog營(yíng)養(yǎng)液50mL置于培養(yǎng)箱（溫度為20℃，濕度為60%，18h光照+6h黑暗/24h），培育7天左右，培養(yǎng)至苗的葉片微微展開(kāi)。2.2.2獲取cDNA提取mRNA剪取新鮮小麥葉片，置于研缽（事先用酒精灼燒過(guò)，冷卻至室溫）中，倒入液氮，迅速用力研磨。在液氮尚未揮發(fā)完之前，將得到的粉末狀組織0.11g加入到RNase-free的1.5mL的EP管中。向EP管中加入1.1mL的Trizol（1mLTrizol對(duì)應(yīng)0.1g材料），室溫靜置5min，離心1200rpm，10min，取上清約950μL移至新的2mL的EP管中。向EP管中加入氯仿110μL（氯仿體積應(yīng)為T(mén)rizol體積的1/5），用手劇烈晃動(dòng)20s，室溫靜置約5min，直至EP管內(nèi)液體分成較為明顯三層，離心10000g，15min，取出EP管，可觀察到EP管內(nèi)分成明顯三層。吸取360μL頂層上清液體移入一個(gè)新的1.5mL的EP管，加入36μL3MNaAc溶液（即上清液體積的1/10），再加入900μL乙醇（上清液體積的2.5倍）。-20℃存放約1h至RNA析出。12000rpm，4℃，15min，離心沉淀，小心倒出上清，加入70%乙醇1mL，輕輕吹打。12000rpm，2min，去除上清，向沉淀中再次加入無(wú)水乙醇，放入離心機(jī)離心約30s，去除上清并小心將剩余乙醇吸干。將沉淀放入超凈工作臺(tái)吹干約5min，加入ddH2O(RNase-free)60μL至80μL，用移液槍輕輕吹打使RNA溶解，室溫放置10～20min至RNA完全溶解，得到mRNA溶液。逆轉(zhuǎn)錄使用試劑盒PrimeScriptTMⅡ1ststrandcDNASynthesisKit，具體操作如下：（1）向引物oligodT干粉中加入ddH2O(RNase-free)，至終濃度為50μM。（2）取一新的200μL的EP管，依次加入：8μLRNA溶液（中提取得到）1μL50μMoligodT1μL10mMdNTPMixture（10mMdATP，dTTP，dCTP，dGTPatneutralpH）配置成10μL體系。（3）將該體系在65℃水浴鍋中放置5min，再迅速放入冰盒中冷卻10min。（4）向上述體系中依次加入4.5μLddH2O（RNase-free）4μL5XPrimeScriptⅡBuffer0.5μLRNaseInhibitor（40U/μL）1μLPrimeScriptⅡRTase（200U/μL）將上述配置好的20μL體系放置于42℃水浴鍋中溫育1h，拿出后放置于95℃水浴鍋5min滅活，得到逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。2.2.3目的基因的克隆及測(cè)序引物設(shè)計(jì)登錄網(wǎng)站TAIR（/）檢索“RanGAP”，在檢索結(jié)果中找到擬南芥AtRanGAP（Accession:AT3G63130）的蛋白序列。（2）根據(jù)AtRanGAP蛋白序列在網(wǎng)站NCBI（/）檢索得到粗山羊草序列（Accession:XM_020300924.1）cDNA序列，其相似序列位置為287-1951。（3）根據(jù)（2）中cDNA序列在小麥中檢索相似序列，得到小麥候選基因（Accession:AK451218.1）的cDNA序列。（4）根據(jù)（3）中得到的cDNA序列設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1），以進(jìn)行后續(xù)特異性擴(kuò)增。表1引物設(shè)計(jì)引物名稱(chēng)引物序列引物位置引物長(zhǎng)度（bp）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度（bp）RanGAPF1TGAAGTGCCACGTGTCCAC219-237191841RanGAPR1TAAACCGAACCGCCAGACC2042-206019RanGAPF1CGAGCCTGACGCTGAAGC133-150182020RanGAPR2AAAGGGTCCAGGCTTGAC2136-2153PCR擴(kuò)增（1）取8個(gè)新的200μLEP管，做好標(biāo)記，根據(jù)表2分別配成20μL反應(yīng)體系，每管依次加入ddH2O，2×TaqPlusPCRMasterMix（2×Mix），引物與模板。表2PCR反應(yīng)體系編號(hào)模板（2μL）引物（0.3μL，0.3μL）ddH2O（7μL）2×Mix（10μL）s1sn27（cDNA母液）RanGAP-F1，RanGAP-R1√√s2RanGAP-F2，RanGAP-R2y1yn999（cDNA母液）RanGAP-F1，RanGAP-R1y2RanGAP-F2，RanGAP-R2s/101sn27（cDNA母液稀釋十倍）RanGAP-F1，RanGAP-R1s/102RanGAP-F2，RanGAP-R2y/101yn999（cDNA母液稀釋十倍）RanGAP-F1，RanGAP-R1y/102RanGAP-F2，RanGAP-R2（2）設(shè)置PCR儀：表3PCR反應(yīng)程序反應(yīng)溫度反應(yīng)時(shí)間95℃4min95℃30s53℃30s32個(gè)循環(huán)72℃2min72℃5min16℃5min瓊脂糖凝膠電泳稱(chēng)取0.2g瓊脂糖置于一潔凈錐形瓶，加入20mLTAE緩沖液（1×），配置成終濃度為1%的瓊脂糖凝膠懸濁液。置于微波爐中加熱至沸騰，取出錐形瓶晃動(dòng)并觀察瓊脂狀態(tài)，重復(fù)加熱煮沸三次，至瓊脂糖完全溶解，不再有凝膠顆粒。移至室溫，向溶液中加入2μL染色劑DuRed，輕輕晃動(dòng)錐形瓶至瓶中溶液完全混合均勻。趁熱將凝膠懸濁液倒入制板槽，插入樣品梳，約過(guò)20分鐘，待瓊脂糖凝膠完全冷卻凝固，輕輕拔出梳子。將制板槽與凝膠一并放入電泳槽，加入足量電泳緩沖液TAE（1×）至沒(méi)過(guò)凝膠表面（高出凝膠表面約1mm）。向載樣孔中分別加入marker和以上PCR擴(kuò)增的DNA溶液。接通電源，調(diào)整電壓為100V，電泳約30分鐘，關(guān)閉電源，取出凝膠，移至自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。瓊脂糖凝膠中提取DNA使用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（GelExtractionKit），具體操作如下：按上述PCR體系比例配置成50μL反應(yīng)體系，PCR特異性擴(kuò)增目的片段。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，得到目的DNA條帶，在UV燈下將單一目的DNA條帶從凝膠中切下，分裝到1.5mL的EP管中，稱(chēng)取凝膠重量。向EP管中加入BufferPG（每100mg凝膠加100μL），50℃水浴溫育，每2-3分鐘輕輕上下顛倒EP管，待溶膠完全溶解，溶液呈黃色。柱平衡：向吸附柱（SpinColumsDM）中加入200μLBufferPS，離心13000rpm，1min，棄掉收集管中的廢液。將（3）中溶膠懸濁液加入到吸附柱中，室溫靜置2min后，13000rpm，1min，棄掉收集管中廢液。吸附柱中加入450μLBufferPW，13000rpm，1min，棄掉收集管中廢液。重復(fù)一遍（6）。13000rpm，1min。取出吸附柱，放入一個(gè)新的1.5mLEP管中，向吸附膜懸空滴加50μLddH2O，室溫放置2min，離心13000rpm，1min，將EP管中離心得到的溶液吸出，再次懸空滴加到吸附膜上，離心13000rpm，1min，得到目的DNA溶液。2.2.3序列分析測(cè)序?qū)⒌玫降腄NA溶液送至睿博興科（青島）生物技術(shù)有限公司，進(jìn)行測(cè)序?；虻亩ㄎ粚y(cè)序結(jié)果輸入小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://urgi.versailles.inra.fr/blast/）進(jìn)行檢索，進(jìn)行染色體定位。序列比對(duì)（1）利用軟件MegAlign將測(cè)序得到的山農(nóng)27和煙農(nóng)999的序列與基因庫(kù)檢索得到的TaRanGAP候選序列進(jìn)行基因序列比對(duì)。（2）利用軟件Editseq將測(cè)序結(jié)果的DNA序列翻譯成蛋白序列，利用軟件MegAlign與檢索得到的多個(gè)物種的RanGAP蛋白序列（見(jiàn)表4）進(jìn)行比對(duì)。表4RanGAP蛋白檢索表蛋白名稱(chēng)物種來(lái)源中文名稱(chēng)SequenceIDLength\o"Sortbyident"IdentHvRanGAPHordeumvulgare大麥\o"ShowreportforBAJ91557.1"BAJ91557.155292%BdRanGAPBrachypodiumdistachyon短柄草\o"ShowreportforXP_003574505.1"XP_003574505.155186%OsRanGAPOryzasativa粳稻\o"ShowreportforXP_015640153.1"XP_015640153.154487%SiRanGAP\o"GotoalignmentforRANGTPase-activatingprotein2[Setariaitalica]"Setariaitalica谷子\o"ShowreportforXP_004962108.1"XP_004962108.154886%SbRanGAP\o"GotoalignmentforRANGTPase-activatingprotein2[Sorghumbicolor]>ref|XP_021316013.1|RANGTPase-activatingprotein2[Sorghumbicolor]>gb|EES05435.1|hypotheticalproteinSORBI_3004G216400[Sorghumbicolor]"Sorghumbicolor高粱XP_021315697.154386%ZmRanGAP\o"GotoalignmentforranGTPaseactivatingprotein[Zeamays]"Zeamays玉米\o"ShowreportforACG32377.1"ACG32377.154185%BnRanGAPBrassicanapus甘藍(lán)型油菜\o"ShowreportforXP_013711932.1"XP_013711932.153585%MtRanGAPMedicagotruncatula蒺藜苜蓿\o"ShowreportforXP_003590647.1"XP_003590647.153367%2.2.4構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)利用軟件MEGA7.0，將山農(nóng)27的蛋白序列與表4中各個(gè)物種的RanGAP蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。2.2.5表達(dá)分析小麥的培養(yǎng)與對(duì)照處理取一潔凈培養(yǎng)皿，底層鋪上一層濾紙將小麥（sn27）種臍朝下平鋪于濾紙上，再蓋上一層濾紙，用水潤(rùn)濕，最后蓋上培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)（溫度為20℃，濕度為60%）3天。將根生長(zhǎng)良好的小麥取出，播到土壤中，再撒上一層薄土，繼續(xù)培養(yǎng)7天。將生長(zhǎng)10天的麥苗小心取出（保持根部完整），將根部的泥土清洗干凈，分成每20株為一組，共5組。取5個(gè)潔凈錐形瓶，分別配制表5溶液各50mL。表5溶液配制編號(hào)成分名稱(chēng)濃度名稱(chēng)濃度0無(wú)0Murashige&Skoog0.5%1PEG80005%2Salicylicacid5mM3NaCl0.1M4ABA30μM將（3）中處理好的5組小麥放入各個(gè)錐形瓶中，室溫培養(yǎng)72h。剪取1-4組小麥的葉分別提取mRNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。cDNA的獲?。?）將小麥苗取出，根部清洗干凈，吸干水分（2）根據(jù)表6剪取不同材料，分別進(jìn)行mRNA提取與反轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA（詳細(xì)步驟見(jiàn)2.2.2）。表6取材來(lái)源編號(hào)處理方式取材部位0-2無(wú)莖0-1葉1PEG80002Salicylicacid3NaCl4ABA半定量RT-PCR（1）引物設(shè)計(jì)：根據(jù)已測(cè)得TaRanGAP山農(nóng)27的DNA序列設(shè)計(jì)引物表6引物設(shè)計(jì)引物名稱(chēng)序列位置引物長(zhǎng)度（bp）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度（bp）RT-PCRF1CGGCGGTCGCGAAGTCTCTG275-29420249RT-PCRR1CCCTCGGGCTCGTTCTCGTC505-52420RT-PCRF2AACGCGAACTACATCCCAGACG415-43622197RT-PCRR2CGAGCCGAGACCAGCATCC594-61219引物檢測(cè)：以山農(nóng)27和煙農(nóng)999反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA溶液為模板，按表7配置20μL體系，經(jīng)瓊脂糖濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表6中設(shè)計(jì)的引物是否可用。表7PCR體系編號(hào)模板（2μL）引物（0.3μL，0.3μL）2×TaqPlusPCRMasterMix（10μL）ddH2O（7μL）s1山農(nóng)27RT-PCRF1，RT-PCRR1√√s2RT-PCRF2，RT-PCRR2y1煙農(nóng)999RT-PCRF1，RT-PCRR1y2RT-PCRF2，RT-PCRR2表8PCR反應(yīng)程序反應(yīng)溫度反應(yīng)時(shí)間95℃4min95℃30s53℃30s23個(gè)循環(huán)72℃30s72℃5min16℃5min校準(zhǔn)：用不同稀釋倍數(shù)的cDNA溶液為模板，選擇擴(kuò)增內(nèi)參基因TaGAPDH，以之為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)，最終分別將cDNA原溶液稀釋以下倍數(shù)，并重新標(biāo)記（見(jiàn)表9），以得到條帶亮度相同的模板。表9稀釋倍數(shù)模板編號(hào)處理-取樣稀釋倍數(shù)cDNA原溶液（μL）ddH2O（μL）0-1空白-葉11000-2空白-莖4281PEG-葉101102SA-葉4283NaCl-葉4284ABA-葉919（4）PCR：按照表10標(biāo)記個(gè)EP管并配制成20μL體系，以表8的PCR程序進(jìn)行反應(yīng)。表10PCR體系編號(hào)模板（2μL）引物（0.3μL，0.3μL）2×TaqPlusPCRMasterMix（10μL）ddH2O（7μL）0-20-2TaGAPDH-F，TaGAPDH-R√√0-10-1112233440-20-2RT-PCRF1，RT-PCRR10-10-111223344第三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1TaRanGAP的克隆為了從小麥中克隆TaRanGAP基因，我們以小麥品種山農(nóng)27和煙農(nóng)999為材料提取mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并利用表1中引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖1所示：表1中的引物擴(kuò)增得到了長(zhǎng)度約1.8kbp的DNA片段，即成功克隆得到TaRanGAP基因。隨后為了得到TaRanGAP的基因序列，我們選擇引物RanGAPF1和RanGAPR1進(jìn)行了PCR擴(kuò)增（50μL×2）。結(jié)果如圖2所示：得到了大量目的DNA片段。圖1目的基因擴(kuò)增結(jié)果圖2瓊脂糖凝膠提取DNA3.2DNA序列比對(duì)為了分析TaRanGAP基因的序列差異，我們將山農(nóng)27和煙農(nóng)999的測(cè)序結(jié)果與在NCBI（/）中檢索得到的候選基因序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果如圖3所示：TaRanGAP基因在701和823兩處存在SNP（SingleNucleotidePolymorphism）位點(diǎn)。圖3DNA序列比對(duì)結(jié)果3.3TaRanGAP在染色體上的位置為了確定TaRanGAP基因在染色體上的位置，我們將測(cè)序結(jié)果輸入小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://urgi.versailles.inra.fr/blast/）進(jìn)行檢索。結(jié)果如圖4所示：TaRanGAP分布在A、B和D同源群的3號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，且基因內(nèi)部有一個(gè)內(nèi)含子。1125982200820092011120583459211685382內(nèi)含子mRNA653241165220665528205641592218262182內(nèi)含子mRNADNADNA1141744220521165476206858358763內(nèi)含子mRNADNA3DL3BL3AL圖4TaRanGAP在染色體上的位置3.4蛋白序列比對(duì)為了分析不同物種間RanGAP蛋白序列的差異，我們分別選取了9種單子葉和雙子葉植物與小麥進(jìn)行蛋白序列的比對(duì)。結(jié)果如圖5所示：在小麥與單子葉植物（大麥、短柄草、粳稻、谷子、高粱和玉米）的序列比對(duì)中Identity=76.2%，在小麥與雙子葉植物（甘藍(lán)型油菜、苜蓿和擬南芥）的序列比對(duì)中Identity=62.3%。圖5蛋白序列比對(duì)結(jié)果3.5進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建為了分析植物中RanGAP的進(jìn)化關(guān)系，我們選取了包括小麥在內(nèi)的10中不同植物，將RanGAP蛋白序列進(jìn)行比對(duì)后，利用軟件MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖6所示：小麥與單子葉植物親緣關(guān)系相對(duì)較近，與雙子葉植物的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)；其中，在單子葉植物中與大麥的親緣關(guān)系最為相近，與短柄草和水稻的親緣關(guān)系較近。圖6RanGAP蛋白進(jìn)化樹(shù)3.6半定量RT-PCR結(jié)果分析為了檢測(cè)表6中設(shè)計(jì)的引物是否可用于本次半定量RT-PCR，我們進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，即以山農(nóng)27和煙農(nóng)999的cDNA原溶液為模板，利用表6中的引物進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果如圖7所示：表6設(shè)計(jì)的引物能有效的擴(kuò)增出長(zhǎng)度約200bp的目的片段，可以用于本次半定量RT-PCR。為了分析基因TaRanGAP在小麥不同組織和多種脅迫環(huán)境中表達(dá)水平，我們以TaGAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行半定量RT-PCR。結(jié)果如圖8所示：左側(cè)是TaGAPDH擴(kuò)增結(jié)果，右側(cè)是TaRanGAP擴(kuò)增結(jié)果。左側(cè)各條帶亮度一致前提下，在組織表達(dá)分析中，0-2條帶亮度明顯高于0-1，即TaRanGAP在莖中的表達(dá)量高于葉；在多種脅迫環(huán)境的表達(dá)分析中，2的條帶亮度略微高于0-1，1、3和4條帶的亮度明顯低于0-1，即水楊酸處理誘導(dǎo)了TaRanGAP的表達(dá)，而PEG-8000、NaCl和脫落酸處理則抑制了TaRanGAP的表達(dá)。此結(jié)果暗示了TaRanGAP能對(duì)不同的脅迫環(huán)境做出應(yīng)答，為今后相關(guān)研究指明了方向。圖7RT-PCR引物檢測(cè)0-20-110-20-112340-20-11234圖8半定量RT-PCR結(jié)果結(jié)論本次研究以候選基因?yàn)閰⒄赵O(shè)計(jì)引物，從小麥品種山農(nóng)27和煙農(nóng)999中成功克隆出TaRanGAP，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了基因序列比對(duì)和蛋白序列比對(duì)，并構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)以上工作得出結(jié)論：TaRanGAP基因中存在少量SNP；該基因分布在小麥A、B和D同源群3號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，且基因內(nèi)部有一內(nèi)含子；不同物種間RanGAP蛋白序列相對(duì)比較保守，但單子葉植物與雙子葉植物間RanGAP的進(jìn)化方向有所不同。此外，本次研究還進(jìn)行了基因TaRanGAP的時(shí)空表達(dá)分析。組織差異表達(dá)分析顯示，TaRanGAP在莖中的表達(dá)量高于葉。不同脅迫環(huán)境下的差異表達(dá)分析顯示，SA處理能略微激活TaRanGAP表達(dá)，而PEG8000、NaCl和ABA處理則抑制了TaRanGAP表達(dá)。前景與展望核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)是細(xì)胞生命活動(dòng)、表達(dá)調(diào)控與信號(hào)傳遞的關(guān)鍵。大量研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控關(guān)鍵因子Ran（Ras-relatednuclear）作為一種GTPase，在細(xì)胞中以?xún)煞N狀態(tài)（RanGTP和RanGDP）存在，二者在核內(nèi)外存在不均勻分布，對(duì)生物大分子穿越核孔復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)非常重要。調(diào)控蛋白R(shí)anGAP參與了RanGTP和RanGDP的相互轉(zhuǎn)換，并起到了至關(guān)重要的作用。當(dāng)前的RanGAP蛋白的相關(guān)研究大多開(kāi)展于動(dòng)物領(lǐng)域，在植物領(lǐng)域特別是小麥中研究甚少。小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，因此小麥的生產(chǎn)質(zhì)量和優(yōu)質(zhì)育種與人類(lèi)的生產(chǎn)生活息息相關(guān)。但是，小麥的產(chǎn)量受到干旱、鹽漬和病害等多種脅迫的影響。因此我們希望通過(guò)研究核質(zhì)運(yùn)輸關(guān)鍵蛋白相關(guān)的作用機(jī)制，從而尋求小麥品質(zhì)提升與抗性提高的方法。目前小麥的基因組測(cè)序已完成，2017年，中國(guó)農(nóng)科院作物科學(xué)研究所完成了D基因組精細(xì)圖譜的繪制，并首次得到了小麥D基因組的完整圖譜。為研究小麥中各種基因的功能與抗性的提高打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究克隆了小麥細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaRanGAP，并對(duì)TaRanGAP在小麥不同組織及多種脅迫應(yīng)答中的表達(dá)水平進(jìn)行了研究，對(duì)深入認(rèn)識(shí)小麥核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及小麥遺傳改良具有重要意義。致謝本次實(shí)驗(yàn)首先要鄭重感謝指導(dǎo)老師常誠(chéng)老師，感謝常誠(chéng)老師在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中盡心盡力的指導(dǎo)與幫助。常誠(chéng)老師不僅為我提供了大量的理論知識(shí)，更是在百忙之中抽出時(shí)間來(lái)親自指導(dǎo)軟件應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)操作，他這種敬業(yè)精神與嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真的科研態(tài)度深深的影響了我，為我以后的生活與科研工作都提供了強(qiáng)大的榜樣的力量。感激之情無(wú)以言表，在此為常誠(chéng)老師送上最真誠(chéng)的祝福與最深沉的感謝。此外，還要感謝208和211的各位師兄師姐與老師，為我提供的幫助和輕松愉快的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，感謝實(shí)驗(yàn)室各位同學(xué)的陪伴與鼓勵(lì)。同時(shí)，也要感謝廣大學(xué)術(shù)論文作者，為此次研究提供的大量理論基礎(chǔ)。最后，要感謝父母這二十多年的養(yǎng)育之恩，感謝青島大學(xué)為我這大學(xué)四年提供的優(yōu)美的學(xué)習(xí)生活環(huán)境。參考文獻(xiàn)：[1]

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