第九章經(jīng)典液相色譜法本章要求掌握熟悉了解液相色譜技術(shù)得基本原理吸附等溫線液相色譜技術(shù)得基本操作3

液相色譜法類型LC

以液體為流動(dòng)相得色譜法稱為液相色譜法LiquidChromatography定義4

-按分離效能分類經(jīng)典液相現(xiàn)代液相-按操作形式-按分離機(jī)制液相色譜法類型5

常壓下靠重力或毛細(xì)作用輸送流動(dòng)相得色譜方法經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典柱色譜法平面色譜法現(xiàn)代液相色譜法高壓輸液泵輸送流動(dòng)相高效液相色譜法(HPLC)液相色譜法類型6

液相色譜得固定相與流動(dòng)相吸附色譜分配色譜離子交換色譜空間排阻色譜7

吸附色譜固定相——吸附劑流動(dòng)相——有機(jī)溶劑溶質(zhì)基于吸附現(xiàn)象而獲得分離得液-固色譜分析方法分離分析極性至弱極性得化合物液相色譜得固定相與流動(dòng)相8

1、對(duì)吸附劑得要求1)有較大表面積與足夠得吸附能力,對(duì)不同物

質(zhì)吸附能力不同2)與洗脫劑、溶劑、樣品不起化學(xué)反應(yīng),且不

溶于洗脫劑與溶劑3)粒度細(xì)而均勻吸附色譜得固定相液相色譜得固定相與流動(dòng)相9

2、常用吸附劑-有機(jī)類:活性炭、淀粉、蔗糖等、聚酰胺、大孔樹(shù)脂-無(wú)機(jī)類:氧化鋁、硅膠、硫酸鈣、滑石粉、硅藻土等液相色譜得固定相與流動(dòng)相吸附劑硅膠分離

酸性和中性物質(zhì)氧化鋁堿性

氧化鋁分離

堿性和中性物質(zhì)酸性

氧化鋁分離

酸性物質(zhì)和對(duì)酸穩(wěn)定的中性物質(zhì)中性

氧化鋁分離

在酸、堿中不穩(wěn)定物質(zhì)聚酰胺分離

易形成氫鍵的物質(zhì)大孔吸附樹(shù)脂應(yīng)用廣泛10液相色譜得固定相與流動(dòng)相11

1)硅膠(SiO2?xH2O)吸附能力:取決于骨架表面硅羥基-極性吸附劑吸附機(jī)理:氫鍵作用-硅羥基為質(zhì)子給予體適用范圍:適用于分離酸性與中性化合物活化溫度:105～110℃物質(zhì)得極性越大,硅膠吸附能力越強(qiáng)溶劑得極性越弱,硅膠吸附能力越強(qiáng)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子以共價(jià)鍵連接在硅羥基上,則成為化學(xué)鍵合固定相,按鍵合官能團(tuán)極性分為極性鍵合相及非極性鍵合相液相色譜得固定相與流動(dòng)相大家有疑問(wèn)的，可以詢問(wèn)和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)13

2)氧化鋁優(yōu)點(diǎn):分離能力強(qiáng)、活性可控分類:酸性、中性、堿性,以中性氧化鋁使用較多用途:酸性-分離酸性化合物,如有機(jī)酸中性-分離生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體、蒽醌以及在酸堿中

不穩(wěn)定得苷類、醌、內(nèi)酯堿性-分離堿性與中性化合物,如生物堿類活化溫度:200～400℃活化:一定溫度下加熱除去水分以增強(qiáng)活性得過(guò)程失活:一定溫度下加入一定量水分使吸附劑活性降低得過(guò)程液相色譜得固定相與流動(dòng)相含水量(%)活度級(jí)別吸附能力硅膠氧化鋁051525380361015ⅠⅡⅢⅣⅤ含水量越低,活度級(jí)別越小,吸附能力越強(qiáng)。含水量越高,活度級(jí)別越大,吸附能力越弱。吸附劑得吸附能力常稱為活度或活性液相色譜得固定相與流動(dòng)相15

3)聚酰胺常用種類:聚己內(nèi)酰胺作用機(jī)理:氫鍵作用(1)酰胺基中得羰基

與酚類、黃酮類、酚類中得羥基或羧基形成氫鍵(2)酰胺基中得氨基

與醌類、硝基類中得醌基、硝基形成氫鍵液相色譜得固定相與流動(dòng)相16

4)大孔吸附樹(shù)脂定義:不含交換基團(tuán),有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)得高分子

吸附劑種類:非極性與中等極性兩類范圍:水溶性化合物得分離純化液相色譜得固定相與流動(dòng)相17

組分在色譜柱中得移動(dòng)速度與分離效果取決于:1、吸附劑對(duì)樣品各組分得吸附能力-吸附活性2、洗脫劑對(duì)各組分得解吸能力-極性大小3、待分離各組分本身極性差異-結(jié)構(gòu)性質(zhì)吸附色譜得條件選擇液相色譜得固定相與流動(dòng)相181、化合物得極性及其判斷規(guī)律常見(jiàn)化合物按其極性由小到大順序?yàn)?烷烴＜烯烴＜醚硝基化合物＜二甲胺＜酯類＜酮類＜醛類＜硫醇＜胺類＜酰胺類＜醇類＜酚類＜羧酸類依據(jù)規(guī)律:(1)基本母核相同—基團(tuán)極性越強(qiáng),整個(gè)分子極性越強(qiáng)(2)分子中雙鍵越多,吸附能力越強(qiáng)

共軛雙鍵越多,吸附能力也越強(qiáng)(3)基團(tuán)得空間排列—能形成分子內(nèi)氫鍵吸附能力較弱液相色譜得固定相與流動(dòng)相19

分離極性小得物質(zhì),選用吸附能力強(qiáng)得吸附劑分離極性大得物質(zhì),選用吸附能力弱得吸附劑2、吸附劑得選擇液相色譜得固定相與流動(dòng)相20

常用溶劑得極性順序?yàn)?石油醚＜環(huán)己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜乙醚＜氯仿＜乙酸乙酯＜丙酮＜正丁醇＜乙醇＜甲醇＜水＜乙酸3、流動(dòng)相得選擇分離極性大得物質(zhì)應(yīng)選用極性大得溶劑分離極性小得物質(zhì)應(yīng)選用極性弱得溶劑液相色譜得固定相與流動(dòng)相21選擇色譜分離條件時(shí),必須從吸附劑、被分離物質(zhì)、流動(dòng)相三方面綜合考慮。

吸附色譜三要素之關(guān)系液相色譜得固定相與流動(dòng)相22分配色譜正相分配色譜:固定相得極性大于流動(dòng)相反相分配色譜:固定相得極性小于流動(dòng)相比較項(xiàng)目正相色譜法(NP)反相色譜法(RP)固定相強(qiáng)極性非極性流動(dòng)相弱-中等極性中等-強(qiáng)極性出峰順序極性弱得組分先出峰極性強(qiáng)得組分先出峰保留值與流動(dòng)相極性得關(guān)系隨流動(dòng)相極性增大保留值減小隨流動(dòng)相極性增大保留值增大適于分離得物質(zhì)極性物質(zhì)弱極性物質(zhì)液相色譜得固定相與流動(dòng)相23分配色譜得固定相固定相:載體+固定液某種溶劑涂布在吸附劑顆粒表面或紙纖維上,形成液膜正相分配色譜法:水、各種緩沖劑、稀硫酸、甲醇、甲酰胺、丙二醇等強(qiáng)極性溶劑及它們得混合液等反相分配色譜法:硅油、液體石蠟等極性較小得有機(jī)溶劑1、固定液液相色譜得固定相與流動(dòng)相242、常用得載體(只起負(fù)載固定相得作用)(1)硅膠:吸收本身重量50%以上水分后喪失吸附作用(2)硅藻土:應(yīng)用最多得載體-硅藻土中氧化硅性質(zhì)較為

致密,幾乎不發(fā)生吸附作用(3)纖維素:紙色譜得載體,也就是分配柱色譜常用載體3、對(duì)載體得要求化學(xué)惰性對(duì)固定液有較強(qiáng)吸附性,但對(duì)組分無(wú)吸附性顆粒大小均勻,純凈液相色譜得固定相與流動(dòng)相254、流動(dòng)相正相色譜:石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷類、苯或混合物反相色譜:水、各種水溶液(包括酸、堿、鹽及緩沖液)、低級(jí)醇類要求:與固定液不互溶,極性相差較大對(duì)樣品組分得溶解度足夠大,又相對(duì)小于固定液對(duì)組分得溶解度液相色譜得固定相與流動(dòng)相分配色譜得條件選擇先使用對(duì)各組分溶解度大得溶劑為洗脫劑再根據(jù)實(shí)際分離情況改變洗脫劑得組成即:在流動(dòng)相中加入一些可調(diào)節(jié)溶解度得溶劑,以改變各組分待分離得情況與洗脫速率液相色譜得固定相與流動(dòng)相27離子交換劑為固定相水或與水混合得溶劑為流動(dòng)相根據(jù)離子交換劑對(duì)各組分離子親合力不同使其分離離子交換色譜(ionexchangechromatography)液相色譜得固定相與流動(dòng)相28離子交換樹(shù)脂——包括基體離子與可交換離子分類:陽(yáng)離子交換樹(shù)脂-含-SO3H、-COOH陰離子交換樹(shù)脂-含-NH2、NHR規(guī)律:組分離子對(duì)基體離子得親合力越大,即交換能力越強(qiáng),就越易交換到離子交換劑上,保留時(shí)間就越長(zhǎng)離子交換色譜得固定相液相色譜得固定相與流動(dòng)相29空間排阻色譜法定義:利用某些凝膠對(duì)不同組分因分子大小不同而阻滯

作用不同得差異而進(jìn)行分離得方法實(shí)質(zhì):分子篩效應(yīng)固定相:化學(xué)惰性多孔物質(zhì)——凝膠分類:

根據(jù)流動(dòng)相得不同——

以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相,稱為凝膠滲透色譜法

以水溶液為流動(dòng)相,稱為凝膠過(guò)濾色譜法液相色譜得固定相與流動(dòng)相30固定相得類型葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠葡聚糖凝膠LH-20聚苯乙烯凝膠親水性凝膠親脂性凝膠液相色譜得固定相與流動(dòng)相硅膠吸附柱色譜聚酰胺柱色譜法離子交換柱色譜法凝膠柱色譜法經(jīng)典液相柱色譜法32平面色譜法借用毛細(xì)作用得原理輸送展開(kāi)劑(流動(dòng)相),色譜過(guò)程在平面上進(jìn)行得方法。固定相成平面狀態(tài),試樣溶液點(diǎn)于平面一端,在相對(duì)密閉得容器中展開(kāi)(分離)后,根據(jù)組分在平面上移動(dòng)得距離與濃度進(jìn)行分析。常用有薄層色譜法與紙色譜法33

1)比移值Rf2)相對(duì)比移值(Rst)3)分離度(Rs)平面色譜法得定性參數(shù)平面色譜法34比移值Rf在薄層色譜法中,用比移值Rf表示各組分在色譜中得保留行為Rf—表示物質(zhì)色譜特性得參數(shù),可用以定性分析平面色譜法35

在給定條件下,Rf值為常數(shù),其值在0～1之間Rf=0

表示化合物在薄層上不隨溶劑擴(kuò)散移動(dòng),仍在原點(diǎn)位置Rf=1

表示溶質(zhì)不進(jìn)入固定相,即表示溶質(zhì)與溶劑同步移動(dòng)一般要求Rf值0、2～0、8之間,最佳范圍0、3～0、5平面色譜法36

影響Rf值得因素:分離對(duì)象得化學(xué)結(jié)構(gòu)固定相得組成及性質(zhì)流動(dòng)相得組成及性質(zhì)介質(zhì)得影響(包括實(shí)驗(yàn)室及展開(kāi)箱得濕度、溫度、飽與與否、上樣量等等)平面色譜法37

解決方法:由于Rf值重現(xiàn)性差,進(jìn)行定性困難得問(wèn)題,可以采用相對(duì)比移植Rst來(lái)定性。平面色譜法38參照物-另外加入得某一物質(zhì)得純品-試樣混合物中得某一組分RfVS、Rst-取值范圍不同:

Rf值小于1,Rst值不一定小于1相對(duì)比移值(Rst)試樣中某組分得移動(dòng)距離與參照物移動(dòng)距離之比平面色譜法39l2、l1-原點(diǎn)至兩斑點(diǎn)中心得距離d-兩斑點(diǎn)中心間得距離W1、W2-兩斑點(diǎn)得寬度分離度(Rs)兩相鄰斑點(diǎn)中心間距離與兩斑點(diǎn)平均寬度(直徑)得比值現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》規(guī)定薄層色譜法中:Rs>1平面色譜法40

固定相-均勻涂鋪在具有光潔表面得玻璃、鋁箔、塑料片或金屬板上形成薄層流動(dòng)相-展開(kāi)劑分離過(guò)程-混合試樣溶液置于薄層板一端確定位置(點(diǎn)樣),在相對(duì)密閉容器中用適當(dāng)?shù)谜归_(kāi)劑展開(kāi),通過(guò)物理或物理化學(xué)得方法觀察組分斑點(diǎn)得移動(dòng)距離,根據(jù)Rf或Rst及斑點(diǎn)大小進(jìn)行定性定量分析得方法薄層色譜法thinlayerchromatography,TLC平面色譜法1)常用吸附劑硅膠

200～300目 硅膠G、硅膠GF254、硅膠H、硅膠HF254氧化鋁

堿性氧化鋁、酸性氧化鋁與中性氧化鋁

氧化鋁H、氧化鋁G與氧化鋁HF254平面色譜法2)展開(kāi)劑及其選擇

一般原則:

與吸附柱色譜法中選擇流動(dòng)相得原則相同

主要根據(jù):

-被分離物質(zhì)得極性 -吸附劑得活性 -展開(kāi)劑本身得極性點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)法平面色譜法43規(guī)律:①酸性組分-加入一定比例得酸,可防止斑點(diǎn)拖尾②堿性物質(zhì)-氧化鋁為吸附劑,中性溶劑為展開(kāi)劑

硅膠為吸附劑,堿性展開(kāi)劑;堿性較弱得生物

堿可使用中性展開(kāi)劑

平面色譜法44

3)操作技術(shù)選擇制板點(diǎn)樣展開(kāi)檢視分析平面色譜法45

選擇(1)選板:玻璃板、塑料膜、金屬鋁箔

表面光滑、平整清潔(2)固定相(吸附劑)

粘合劑:CMC-Na、煅石膏、淀粉等(3)流動(dòng)相(展開(kāi)劑)(4)顯色劑平面色譜法46

制板

將吸附劑均勻地涂鋪在玻璃板上使成薄層

步驟: (1)吸附劑得涂布 (2)板得活化平面色譜法47

(1)吸附劑得涂布

硬板(加粘合劑)→硅膠

軟板(不加粘合劑)→氧化鋁

硬板得涂鋪方法:

傾注法、平鋪法、涂鋪器、噴霧法平面色譜法48

(2)板得活化

鋪成得薄層,置于水平臺(tái)面上晾干(也可以熱風(fēng)吹干)

置烘箱中于105℃～110℃活化0、5～1小時(shí)平面色譜法49

點(diǎn)樣

一般使用微量注射器或毛細(xì)管點(diǎn)樣平面色譜法50

注意事項(xiàng):溶劑、點(diǎn)樣量與正確得點(diǎn)樣方法(1)溶劑應(yīng)易揮發(fā),不要以水為溶劑→改變吸附劑活度(2)樣品濃度不能過(guò)高→產(chǎn)生拖尾

濃度也不能過(guò)低→起始點(diǎn)為空心點(diǎn),色譜斑點(diǎn)畸形

對(duì)照品濃度控制在幾mg/mL(3)點(diǎn)樣體積宜在20μl以下、直徑3mm,需分次點(diǎn)加(4)點(diǎn)加量一般為幾~幾十mg→過(guò)多斑點(diǎn)太大,形狀不良→太少斑點(diǎn)模糊或無(wú)法顯色(5)原點(diǎn)距離底邊、兩側(cè)邊及點(diǎn)與點(diǎn)之間得距離大于1cm(6)點(diǎn)樣管用內(nèi)徑約0、5～1mm得毛細(xì)管,管口應(yīng)平整(7)點(diǎn)樣操作需迅速→暴露空氣中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)吸水降低活性平面色譜法51

展開(kāi)(1)展開(kāi)原理(2)展開(kāi)裝置(3)展開(kāi)方式(4)展開(kāi)劑得選擇(5)邊緣效應(yīng)平面色譜法52

(1)展開(kāi)原理

將薄板一端浸入展開(kāi)劑,點(diǎn)樣處不可接觸展開(kāi)劑,展開(kāi)劑借助毛細(xì)作用上升,帶動(dòng)樣品中組分得遷移。平面色譜法53(2)展開(kāi)裝置立式臥式平面色譜法54(3)展開(kāi)方式軟板只能進(jìn)行近水平展開(kāi)硬板可以進(jìn)行近水平、下行、上行、徑向、雙向、多次展開(kāi),其中以上行法展開(kāi)最為常用平面色譜法55

(4)展開(kāi)劑得選擇

首選單元溶劑,再選混合溶劑(由簡(jiǎn)至繁)

若二元溶劑系統(tǒng)不夠理想可考慮多元溶劑系統(tǒng)平面色譜法56

(5)邊緣效應(yīng)

定義:

同一組分得色譜斑點(diǎn)在同一薄層板上出現(xiàn)在邊