上海市中醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)技術(shù)（如ELISA、分子生物學(xué)）操作考核一、選擇題（每題2分，共20題）1.ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板清洗的主要目的是什么？A.去除未結(jié)合的酶標(biāo)物B.增加結(jié)合的酶標(biāo)物C.增強(qiáng)抗體活性D.降低背景值2.在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，以下哪項(xiàng)是退火溫度設(shè)定的關(guān)鍵依據(jù)？A.引物長(zhǎng)度B.引物GC含量C.目標(biāo)片段大小D.以上都是3.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜后封閉的主要作用是什么？A.阻止抗體非特異性結(jié)合B.增強(qiáng)抗體結(jié)合C.去除SDSD.增加蛋白質(zhì)帶紋4.ELISA實(shí)驗(yàn)中，HRP標(biāo)記的二抗通常用于哪種檢測(cè)模式？A.直接法B.間接法C.競(jìng)爭(zhēng)法D.雙抗體夾心法5.PCR實(shí)驗(yàn)中，DMSO的作用是什么？A.提高退火溫度B.增強(qiáng)引物結(jié)合C.去除抑制劑D.增加擴(kuò)增效率6.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)凝膠電泳的目的是什么？A.分離蛋白質(zhì)B.激活蛋白質(zhì)C.去除雜質(zhì)D.增強(qiáng)蛋白質(zhì)表達(dá)7.ELISA實(shí)驗(yàn)中，TMB顯色液的顏色變化與什么成正比？A.抗原濃度B.抗體濃度C.酶活性D.以上都是8.PCR實(shí)驗(yàn)中，Mg2?濃度對(duì)擴(kuò)增效率的影響是什么？A.無(wú)影響B(tài).降低擴(kuò)增效率C.增高擴(kuò)增效率D.影響引物設(shè)計(jì)9.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，ECL發(fā)光液的使用步驟是什么？A.直接加在膜上B.需預(yù)冷C.曝光后顯影D.以上都是10.ELISA實(shí)驗(yàn)中，復(fù)孔平均值的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）計(jì)算公式是什么？A.SD=√(Σ(xi-x?)2/n)B.SD=(max-min)/2C.SD=√(Σ(xi)2/n)D.SD=(Σxi)/n二、填空題（每空1分，共10空）1.ELISA實(shí)驗(yàn)中，常用的酶標(biāo)記物有__________和__________。2.PCR實(shí)驗(yàn)中，引物退火溫度通常比Tm值低__________℃。3.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜常用的方法有__________和__________。4.ELISA實(shí)驗(yàn)中，背景值過高可能的原因包括__________、__________和__________。5.PCR實(shí)驗(yàn)中，PCR產(chǎn)物凝膠電泳的染色方法有__________和__________。6.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，抗體孵育前需用__________封閉非特異性位點(diǎn)。7.ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板清洗次數(shù)一般為__________次。8.PCR實(shí)驗(yàn)中，DMSO濃度過高可能導(dǎo)致__________。9.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，ECL發(fā)光信號(hào)的穩(wěn)定性受__________和__________影響。10.ELISA實(shí)驗(yàn)中，TMB顯色液的孵育時(shí)間一般為__________分鐘。三、簡(jiǎn)答題（每題5分，共4題）1.簡(jiǎn)述ELISA實(shí)驗(yàn)的基本步驟及其原理。2.解釋PCR實(shí)驗(yàn)中引物設(shè)計(jì)的要點(diǎn)及其對(duì)擴(kuò)增效率的影響。3.描述WesternBlot實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)膜的關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)。4.分析ELISA實(shí)驗(yàn)中常見的問題（如背景值高、信號(hào)弱）及其解決方法。四、操作題（每題10分，共2題）1.設(shè)計(jì)一個(gè)用于檢測(cè)上海市中醫(yī)院某科室患者血清中某病毒抗原的間接ELISA實(shí)驗(yàn)方案，包括主要試劑、步驟和結(jié)果判讀。2.針對(duì)上海市中醫(yī)院某研究項(xiàng)目，設(shè)計(jì)一個(gè)用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的PCR實(shí)驗(yàn)方案，包括引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件和產(chǎn)物驗(yàn)證方法。五、論述題（每題15分，共2題）1.比較ELISA和WesternBlot在科研實(shí)驗(yàn)中的優(yōu)缺點(diǎn)，并說明在上海市中醫(yī)院臨床研究中如何選擇合適的檢測(cè)方法。2.結(jié)合上海市中醫(yī)院的具體情況（如科室特點(diǎn)、樣本類型），論述PCR實(shí)驗(yàn)在臨床診斷和科研中的應(yīng)用價(jià)值及注意事項(xiàng)。答案與解析一、選擇題答案與解析1.D解析：ELISA實(shí)驗(yàn)中，清洗的主要目的是去除未結(jié)合的酶標(biāo)物和雜質(zhì)，降低背景值，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.D解析：引物長(zhǎng)度、GC含量和目標(biāo)片段大小都會(huì)影響退火溫度的設(shè)定，需綜合考慮。3.A解析：封閉步驟可以阻止抗體非特異性結(jié)合，提高實(shí)驗(yàn)特異性。4.B解析：間接法使用HRP標(biāo)記的二抗，先結(jié)合一抗，再結(jié)合HRP標(biāo)記的二抗，增強(qiáng)信號(hào)。5.C解析：DMSO可以去除樣本中的抑制劑，提高PCR擴(kuò)增效率。6.A解析：蛋白質(zhì)凝膠電泳的目的是根據(jù)分子量大小分離蛋白質(zhì)。7.A解析：TMB顯色液的顏色變化與抗原濃度成正比，可用于定量檢測(cè)。8.C解析：Mg2?是PCR反應(yīng)的必需離子，濃度合適時(shí)能提高擴(kuò)增效率。9.D解析：ECL發(fā)光液需預(yù)冷，加在膜上后需曝光顯影。10.A解析：標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算公式為√(Σ(xi-x?)2/n)，用于衡量數(shù)據(jù)離散程度。二、填空題答案與解析1.HRP、堿性磷酸酶解析：ELISA常用的酶標(biāo)記物有HRP和堿性磷酸酶，用于信號(hào)檢測(cè)。2.3-5解析：引物退火溫度通常比Tm低3-5℃，確保特異性結(jié)合。3.半干轉(zhuǎn)膜、濕轉(zhuǎn)膜解析：常用的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜方法有半干轉(zhuǎn)膜和濕轉(zhuǎn)膜。4.洗滌不徹底、封閉不充分、抗體濃度過高解析：背景值高可能由多種因素導(dǎo)致，需逐一排查。5.EB染色、銀染解析：PCR產(chǎn)物凝膠電泳常用EB染色或銀染檢測(cè)。6.封閉液（如TBS-T+BSA）解析：封閉液可封閉非特異性位點(diǎn)，提高抗體結(jié)合特異性。7.3-4解析：酶標(biāo)板清洗次數(shù)一般為3-4次，確保背景值低。8.非特異性擴(kuò)增解析：DMSO濃度過高可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，降低特異性。9.膜質(zhì)量、曝光時(shí)間解析：ECL發(fā)光信號(hào)的穩(wěn)定性受膜質(zhì)量和曝光時(shí)間影響。10.30-60解析：TMB顯色液孵育時(shí)間一般為30-60分鐘，確保信號(hào)穩(wěn)定。三、簡(jiǎn)答題答案與解析1.ELISA實(shí)驗(yàn)基本步驟及其原理步驟：（1）包被：將抗原或抗體包被在酶標(biāo)板上，4℃過夜。（2）洗滌：用洗滌液清洗酶標(biāo)板，去除未結(jié)合物。（3）封閉：用封閉液（如TBS-T+BSA）封閉非特異性位點(diǎn)，4℃過夜。（4）洗滌：再次清洗酶標(biāo)板。（5）加樣：加入待測(cè)樣本或?qū)φ?，室溫孵育。?）洗滌：清洗酶標(biāo)板。（7）加酶標(biāo)二抗：加入HRP或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育。（8）洗滌：清洗酶標(biāo)板。（9）顯色：加入TMB或OPD等顯色液，室溫孵育。（10）終止：加入終止液（如H?SO?），終止反應(yīng)。（11）檢測(cè)：用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。原理：通過抗原抗體反應(yīng)，結(jié)合物與酶標(biāo)二抗結(jié)合，酶催化底物顯色，顏色深淺與樣本濃度成正比。2.PCR實(shí)驗(yàn)中引物設(shè)計(jì)的要點(diǎn)及其對(duì)擴(kuò)增效率的影響要點(diǎn)：（1）特異性：引物需與目標(biāo)序列高度互補(bǔ)，避免非特異性結(jié)合。（2）GC含量：引物GC含量一般在40-60%，Tm值適中。（3）長(zhǎng)度：引物長(zhǎng)度一般為18-25bp。（4）避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)：可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。影響擴(kuò)增效率的因素：-引物特異性：特異性高則擴(kuò)增效率高。-Tm值：Tm值接近則擴(kuò)增效率高。-引物濃度：濃度過高可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。3.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)膜的關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)蛋白質(zhì)電泳：（1）凝膠制備：SDS凝膠制備，濃度根據(jù)蛋白分子量選擇。（2）樣品加載：加入蛋白樣品和LoadingBuffer，上樣。（3）電泳：恒壓或恒流電泳，分離蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)膜：（1）轉(zhuǎn)膜條件：設(shè)置合適的電壓和時(shí)間，確保蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至膜上。（2）封閉：用封閉液封閉膜，防止非特異性結(jié)合。注意事項(xiàng)：-電泳時(shí)避免電壓過高導(dǎo)致凝膠變形。-轉(zhuǎn)膜時(shí)確保膜平整，避免氣泡。4.ELISA實(shí)驗(yàn)中常見問題及其解決方法問題1：背景值高解決方法：-加強(qiáng)洗滌，使用高純度洗滌液。-充分封閉，使用足量封閉液。-降低抗體濃度，優(yōu)化抗體稀釋比例。問題2：信號(hào)弱解決方法：-增加樣本濃度或優(yōu)化提取方法。-延長(zhǎng)孵育時(shí)間，確保充分結(jié)合。-檢查酶標(biāo)二抗活性，必要時(shí)重新標(biāo)記。四、操作題答案與解析1.間接ELISA實(shí)驗(yàn)方案試劑：-酶標(biāo)板、洗滌液（TBS-T）、封閉液（TBS-T+5%BSA）、HRP標(biāo)記的二抗、TMB顯色液、終止液（H?SO?）、血清樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。步驟：（1）包被：將病毒抗原包被在酶標(biāo)板上，4℃過夜。（2）洗滌：用洗滌液清洗3次。（3）封閉：用封閉液封閉1小時(shí)，室溫。（4）洗滌：用洗滌液清洗3次。（5）加樣本：加入患者血清樣本，室溫孵育1小時(shí)。（6）洗滌：用洗滌液清洗3次。（7）加二抗：加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。（8）洗滌：用洗滌液清洗3次。（9）顯色：加入TMB顯色液，室溫孵育30分鐘。（10）終止：加入終止液，終止反應(yīng)。（11）檢測(cè)：用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。結(jié)果判讀：-陽(yáng)性對(duì)照吸光度值高于閾值，陰性對(duì)照吸光度值低于閾值，則結(jié)果有效。-患者樣本吸光度值高于閾值，判為陽(yáng)性；低于閾值，判為陰性。2.PCR實(shí)驗(yàn)方案引物設(shè)計(jì)：-根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物，如上游引物5'-AGCTTGCCAACTGCTAG-3'，下游引物5'-CTGCACTCGGATCGGT-3'。反應(yīng)體系：-10×PCRBuffer5μl、dNTPs2.5μl、MgCl?3μl、上游引物1μl、下游引物1μl、Taq酶0.5μl、模板DNA5μl、ddH?O36μl。擴(kuò)增條件：-95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，退火（根據(jù)引物Tm值設(shè)定）30秒，延伸（72℃）1分鐘，重復(fù)35次；72℃延伸10分鐘；4℃保存。產(chǎn)物驗(yàn)證：-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈觀察。-與預(yù)期片段大?。ㄈ?00bp）一致，則結(jié)果有效。五、論述題答案與解析1.ELISA和WesternBlot的優(yōu)缺點(diǎn)及選擇方法ELISA優(yōu)點(diǎn)：-操作簡(jiǎn)單、快速、成本低。-適合大批量樣本檢測(cè)。缺點(diǎn)：-靈敏度相對(duì)較低。WesternBlot優(yōu)點(diǎn)：-靈敏度高、特異性強(qiáng)。-可進(jìn)行蛋白定量和驗(yàn)證。缺點(diǎn)：-操作復(fù)雜、耗時(shí)、成本高。選擇方法：-上海市中醫(yī)院臨床研究中，若需快速大批量檢測(cè)（如病毒篩查），選擇ELISA；若需高靈敏度驗(yàn)證（如蛋白表達(dá)研究），選擇WesternBlot。2.PC