基于SSH技術(shù)解析雞就巢行為相關(guān)基因的分子機(jī)制探究一、引言1.1研究背景在家禽產(chǎn)業(yè)中，雞的就巢行為對(duì)生產(chǎn)效益有著顯著影響。就巢行為，俗稱“抱窩”，是禽類的一種母性行為，表現(xiàn)為產(chǎn)蛋一段時(shí)間后，體溫升高，被毛蓬松，抱蛋而窩，停止產(chǎn)蛋。在現(xiàn)代家禽養(yǎng)殖中，就巢行為帶來(lái)諸多負(fù)面效應(yīng)。母雞進(jìn)入就巢狀態(tài)后，會(huì)停止產(chǎn)蛋，且卵巢、輸卵管出現(xiàn)退化現(xiàn)象，這直接導(dǎo)致產(chǎn)蛋量大幅降低，種蛋生產(chǎn)成本相應(yīng)增加。一旦母雞開始就巢進(jìn)入孵化期，需等待雛禽孵出、哺育長(zhǎng)大并離開后，才會(huì)恢復(fù)產(chǎn)蛋，中間耽擱的產(chǎn)蛋時(shí)間較長(zhǎng)，嚴(yán)重制約了現(xiàn)代化家禽產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展，也給家禽養(yǎng)殖企業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。從遺傳角度來(lái)看，家禽就巢性是一個(gè)低遺傳力性狀，受多種因素影響，其中分子遺傳因素起著主導(dǎo)性作用。不同品種和個(gè)體之間的就巢行為存在巨大差異，這暗示著就巢行為與基因密切相關(guān)。深入探究雞就巢行為的基因機(jī)制，具有多方面的重要意義。在學(xué)術(shù)研究領(lǐng)域，有助于豐富家禽繁殖生物學(xué)的理論知識(shí)，進(jìn)一步揭示家禽繁殖行為的遺傳調(diào)控機(jī)制，為相關(guān)性狀的基因組學(xué)研究筑牢理論根基。在實(shí)際應(yīng)用方面，可為家禽育種工作提供關(guān)鍵的理論指導(dǎo)。通過(guò)對(duì)就巢行為相關(guān)基因的研究，能夠運(yùn)用分子生物學(xué)手段選育低就巢性或無(wú)就巢性的雞品種，有效減少或消除就巢行為對(duì)產(chǎn)蛋性能的不良影響，從而提升家禽的繁殖效率和養(yǎng)殖效益，推動(dòng)家禽產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，探究雞就巢行為的基因機(jī)制迫在眉睫。1.2研究目的與意義本研究旨在運(yùn)用抑制消減雜交（SSH）技術(shù)，鑒別出與雞就巢行為密切相關(guān)的基因。通過(guò)構(gòu)建就巢與非就巢雞垂體組織的消減cDNA文庫(kù)，篩選并驗(yàn)證差異表達(dá)基因，明確這些基因在就巢行為中的作用機(jī)制，為雞就巢性的遺傳調(diào)控研究提供新的候選基因及理論依據(jù)。從理論意義層面來(lái)看，雞就巢行為的遺傳機(jī)制研究在動(dòng)物繁殖生物學(xué)領(lǐng)域具有重要地位。家禽就巢性受多種因素綜合調(diào)控，其中分子遺傳因素起主導(dǎo)作用，但目前其具體的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍未完全明晰。利用SSH方法鑒別相關(guān)基因，有助于填補(bǔ)這一領(lǐng)域的知識(shí)空白，進(jìn)一步完善家禽繁殖生物學(xué)的理論體系。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的深入研究，能夠揭示基因與就巢行為之間的內(nèi)在聯(lián)系，解析基因在調(diào)控就巢行為過(guò)程中的信號(hào)傳導(dǎo)通路和分子作用機(jī)制，為后續(xù)開展家禽繁殖性狀的基因組學(xué)研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在實(shí)踐應(yīng)用方面，本研究成果具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)于家禽育種工作而言，就巢行為是影響雞產(chǎn)蛋性能的關(guān)鍵因素之一。通過(guò)精準(zhǔn)鑒別就巢行為相關(guān)基因，可開發(fā)出與之對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記，用于家禽的分子標(biāo)記輔助選擇育種。在育種過(guò)程中，依據(jù)這些分子標(biāo)記，能夠準(zhǔn)確篩選出低就巢性或無(wú)就巢性的雞種，極大地提高育種效率，加快培育高產(chǎn)蛋性能雞品種的進(jìn)程。這不僅有助于滿足市場(chǎng)對(duì)禽蛋產(chǎn)品日益增長(zhǎng)的需求，還能降低家禽養(yǎng)殖企業(yè)的生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。此外，本研究結(jié)果還有助于深入了解家禽繁殖的生理機(jī)制，為優(yōu)化家禽養(yǎng)殖管理提供科學(xué)指導(dǎo)。通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，可探索出更加有效的方法來(lái)控制雞的就巢行為，如研發(fā)新型的飼料添加劑或養(yǎng)殖環(huán)境調(diào)控方案，以減少就巢行為對(duì)家禽生產(chǎn)的負(fù)面影響，促進(jìn)家禽產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在雞就巢行為的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一定的成果。就巢行為作為影響雞產(chǎn)蛋性能的關(guān)鍵因素，受到了廣泛關(guān)注。國(guó)外在該領(lǐng)域的研究起步較早，通過(guò)長(zhǎng)期的探索，在分子遺傳、內(nèi)分泌調(diào)控以及環(huán)境因素影響等多個(gè)方面都有深入的研究。在分子遺傳方面，已明確家禽就巢性受少數(shù)幾個(gè)常染色體基因控制，是一個(gè)低遺傳力性狀，遺傳力在0.116左右。催乳素（PRL）基因作為就巢發(fā)生和維持的關(guān)鍵基因，受到了重點(diǎn)研究。研究發(fā)現(xiàn)，雞在就巢期間，巢窩或窩內(nèi)蛋對(duì)母雞腹部的觸感刺激其分泌大量的PRL，而將母雞強(qiáng)制性移出窩后，血清中的PRL濃度會(huì)快速降低。此外，對(duì)PRL基因的結(jié)構(gòu)和多態(tài)性也有了較為深入的了解，家禽PRL基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，開放閱讀框長(zhǎng)690bp，編碼30個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和199個(gè)氨基酸的成熟肽，雞PRL基因定位于2號(hào)染色體上。國(guó)內(nèi)對(duì)于雞就巢行為的研究也在不斷深入。在環(huán)境因素對(duì)就巢行為的影響方面，有大量的研究成果。光照和溫度是影響家禽就巢性的重要環(huán)境因素。例如，長(zhǎng)日照鵝在春季光照增加時(shí)，下丘腦光感受器將光電磁信號(hào)轉(zhuǎn)換為內(nèi)分泌激素信號(hào)，刺激腦垂體分泌促黃體素和催乳素，刺激性腺活動(dòng)和產(chǎn)蛋，但隨著光照時(shí)間延長(zhǎng)，催乳素濃度增加會(huì)抑制促黃體素分泌，導(dǎo)致母禽就巢。不同光照周期對(duì)地方品種雞就巢性的影響也有研究，如12∶2D∶4L∶6D光照模式下雞的就巢率最低，產(chǎn)蛋率最高。除光照外，溫度、窩巢和窩內(nèi)蛋等因素也會(huì)影響家禽就巢行為，就巢率會(huì)隨著環(huán)境溫度的升高而升高，熟悉的窩巢和窩內(nèi)蛋的刺激會(huì)增加母禽就巢行為的發(fā)生。在利用SSH技術(shù)研究雞就巢行為相關(guān)基因方面，國(guó)內(nèi)外也有相關(guān)探索。SSH技術(shù)是一種鑒定、分離組織細(xì)胞中選擇性表達(dá)基因的技術(shù)，它克服了其他一些基因克隆技術(shù)假陽(yáng)性較高和消減雜交輪次較多的缺點(diǎn)，十分適用于克隆分析造成某種特殊表型的目的基因及其功能。有研究利用SSH技術(shù)建立了雞垂體組織的消減cDNA文庫(kù)，通過(guò)對(duì)文庫(kù)中陽(yáng)性克隆的測(cè)序和分析，得到了一些與就巢行為可能相關(guān)的EST序列。對(duì)這些EST序列進(jìn)行電子延伸、擴(kuò)增測(cè)序驗(yàn)證以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究，發(fā)現(xiàn)部分EST在就巢和不就巢狀態(tài)下的表達(dá)存在差異。但目前SSH技術(shù)在雞就巢行為基因研究中的應(yīng)用還存在一些不足。SSH技術(shù)構(gòu)建的文庫(kù)中可能存在一些假陽(yáng)性克隆，這會(huì)增加后續(xù)篩選和驗(yàn)證的工作量。此外，對(duì)于SSH技術(shù)篩選出的差異表達(dá)基因，其功能驗(yàn)證還存在一定難度，需要進(jìn)一步結(jié)合其他技術(shù)手段，如基因敲除、過(guò)表達(dá)等，來(lái)深入探究這些基因在雞就巢行為中的具體作用機(jī)制。二、雞就巢行為概述2.1就巢行為的表現(xiàn)與特征雞的就巢行為具有一系列顯著的外在表現(xiàn)和行為特征。當(dāng)母雞進(jìn)入就巢狀態(tài)時(shí)，最明顯的變化之一是體溫升高。正常情況下，雞的體溫一般維持在40.5℃-42℃之間，而處于就巢期的母雞，體溫會(huì)有所上升，可達(dá)到42℃以上。這種體溫的升高，是機(jī)體為了滿足孵化蛋的需求，為胚胎發(fā)育提供適宜的溫度環(huán)境。母雞就巢時(shí)，被毛會(huì)變得蓬松。這一現(xiàn)象并非偶然，蓬松的被毛能夠增加空氣的滯留空間，從而起到更好的保溫作用，有助于維持蛋周圍的穩(wěn)定溫度，為胚胎的正常發(fā)育創(chuàng)造有利條件。停止產(chǎn)蛋是雞就巢行為的一個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志。在就巢期間，母雞的生殖生理發(fā)生明顯改變，卵巢和輸卵管出現(xiàn)退化現(xiàn)象。卵泡發(fā)育停止，不再排卵，輸卵管的功能也受到抑制，導(dǎo)致產(chǎn)蛋活動(dòng)完全終止。這種生殖器官的變化，是母雞就巢行為的重要生理基礎(chǔ)，也是就巢行為對(duì)產(chǎn)蛋性能產(chǎn)生負(fù)面影響的直接原因。就巢母雞還會(huì)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抱蛋而窩行為。它們會(huì)長(zhǎng)時(shí)間呆在巢窩內(nèi)，緊緊地將蛋抱在身下，很少離開。即使受到外界干擾，也會(huì)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的護(hù)蛋行為，甚至?xí)?duì)靠近的人和其他動(dòng)物發(fā)起攻擊。這種執(zhí)著的抱蛋行為，是母雞就巢本能的核心體現(xiàn)，其目的是為了確保蛋能夠持續(xù)獲得適宜的溫度和保護(hù)，以促進(jìn)胚胎的正常發(fā)育。在行為習(xí)性上，就巢母雞的性情會(huì)變得較為溫順。它們不再像平時(shí)那樣活躍好動(dòng)，而是安靜地趴在巢中，行動(dòng)緩慢且謹(jǐn)慎。這種性情的轉(zhuǎn)變，有助于它們更好地專注于孵化工作，減少外界因素對(duì)孵化過(guò)程的干擾。就巢母雞還會(huì)發(fā)出特殊的“咯咯”叫聲，這種叫聲不同于平常的鳴叫，可能是母雞與蛋之間的一種交流方式，也可能是對(duì)其他同類發(fā)出的信號(hào)，以宣示其對(duì)巢窩和蛋的占有權(quán)，警告其他雞不要靠近。2.2就巢行為對(duì)雞繁殖性能的影響就巢行為對(duì)雞的繁殖性能產(chǎn)生多方面的負(fù)面影響，嚴(yán)重制約了家禽養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。產(chǎn)蛋量下降是最為顯著的影響之一。母雞一旦進(jìn)入就巢狀態(tài)，會(huì)立即停止產(chǎn)蛋。在就巢期間，母雞體內(nèi)的內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生顯著變化，催乳素（PRL）等激素水平升高，這直接抑制了卵泡的發(fā)育和排卵。卵泡發(fā)育受阻，不再有成熟的卵子排出，輸卵管的生理功能也隨之受到抑制，無(wú)法正常形成蛋，從而導(dǎo)致產(chǎn)蛋活動(dòng)完全停止。有研究表明，就巢母雞的產(chǎn)蛋量相比正常產(chǎn)蛋雞可減少30%-50%，甚至更多，這對(duì)以產(chǎn)蛋為主要經(jīng)濟(jì)收益的家禽養(yǎng)殖來(lái)說(shuō)，無(wú)疑是巨大的損失。就巢行為還會(huì)導(dǎo)致雞的繁殖周期延長(zhǎng)。正常情況下，雞的產(chǎn)蛋周期相對(duì)穩(wěn)定，在適宜的環(huán)境和飼養(yǎng)條件下，母雞能夠持續(xù)產(chǎn)蛋。然而，當(dāng)母雞出現(xiàn)就巢行為時(shí)，其繁殖周期會(huì)被打亂。母雞需要在巢窩內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間抱窩孵化，等待雛禽孵出，之后還需進(jìn)行哺育，直到雛禽能夠獨(dú)立生活。在這一過(guò)程中，母雞的生殖器官處于相對(duì)靜止和退化的狀態(tài)，無(wú)法進(jìn)行正常的產(chǎn)蛋活動(dòng)。從就巢開始到恢復(fù)產(chǎn)蛋，這中間的時(shí)間間隔可能長(zhǎng)達(dá)數(shù)周甚至數(shù)月，這使得雞的繁殖周期大幅延長(zhǎng)，降低了繁殖效率。以某些地方品種雞為例，其正常產(chǎn)蛋周期為1-2天一枚蛋，而發(fā)生就巢行為后，可能需要2-3個(gè)月才能再次進(jìn)入產(chǎn)蛋期，極大地影響了家禽的繁殖速度和數(shù)量。從生殖生理角度來(lái)看，就巢行為會(huì)導(dǎo)致雞卵巢和輸卵管出現(xiàn)退化現(xiàn)象。在就巢期間，高水平的催乳素會(huì)抑制垂體促性腺激素的分泌，使得卵巢和輸卵管得不到足夠的激素刺激，逐漸出現(xiàn)萎縮和退化。卵巢中的卵泡停止發(fā)育，數(shù)量減少，輸卵管的管壁變薄，腺體分泌功能下降。這種生殖器官的退化不僅會(huì)影響當(dāng)前的繁殖性能，還可能對(duì)母雞后續(xù)的生殖能力產(chǎn)生長(zhǎng)期的不良影響。即使母雞在醒抱后恢復(fù)產(chǎn)蛋，其產(chǎn)蛋量和蛋的質(zhì)量也可能無(wú)法達(dá)到正常水平，容易出現(xiàn)產(chǎn)蛋量不穩(wěn)定、蛋重減輕、蛋殼質(zhì)量變差等問(wèn)題。就巢行為還會(huì)增加養(yǎng)殖成本。由于母雞就巢期間停止產(chǎn)蛋，養(yǎng)殖企業(yè)為了維持相同的蛋產(chǎn)量，需要飼養(yǎng)更多數(shù)量的母雞，這增加了飼料、場(chǎng)地、設(shè)備等方面的投入。就巢行為還可能導(dǎo)致雞群的管理難度加大，需要投入更多的人力來(lái)進(jìn)行管理和照顧，進(jìn)一步提高了養(yǎng)殖成本。如果就巢行為得不到有效控制，會(huì)嚴(yán)重降低家禽養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，阻礙家禽產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。2.3就巢行為的影響因素2.3.1遺傳因素不同雞品種的就巢性存在顯著差異，這表明遺傳因素在雞就巢行為中起著關(guān)鍵作用。家雞的就巢性受少數(shù)幾個(gè)常染色體基因控制，屬于低遺傳力性狀，遺傳力在0.116左右。在眾多雞品種中，一些地方品種雞通常具有較強(qiáng)的就巢性。如烏雞，就巢性表現(xiàn)突出，每產(chǎn)約15枚蛋之后，就會(huì)出現(xiàn)就巢行為，停止產(chǎn)蛋，其就巢率可高達(dá)60%以上。這是因?yàn)樵陂L(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇過(guò)程中，烏雞保留了較強(qiáng)的就巢本能，這種本能與它們的遺傳基因密切相關(guān)。原太行雞同樣如此，其就巢率也較高，這反映出這些地方品種雞在遺傳上具有就巢行為的傾向。相比之下，一些現(xiàn)代培育品種，如白來(lái)航雞，作為世界著名的蛋用型雞種，一般無(wú)就巢性。這是由于在現(xiàn)代育種過(guò)程中，人們通過(guò)對(duì)雞的繁殖性能進(jìn)行長(zhǎng)期的選育和改良，逐漸去除了就巢性相關(guān)的基因，使得這些品種更適合規(guī)?；?、高效率的產(chǎn)蛋生產(chǎn)。這種品種間就巢性的差異，充分體現(xiàn)了遺傳因素對(duì)雞就巢行為的決定性影響。不同品種雞的遺傳背景不同，其基因組成和基因表達(dá)模式存在差異，從而導(dǎo)致就巢性的強(qiáng)弱不同。研究還發(fā)現(xiàn)，一些基因的多態(tài)性與雞的就巢行為密切相關(guān)。催乳素（PRL）基因作為就巢發(fā)生和維持的關(guān)鍵基因，其結(jié)構(gòu)和多態(tài)性受到廣泛關(guān)注。家禽PRL基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，開放閱讀框長(zhǎng)690bp，編碼30個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和199個(gè)氨基酸的成熟肽，雞PRL基因定位于2號(hào)染色體上。對(duì)PRL基因不同部分的克隆測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，其5'UTR區(qū)等部分存在一些位點(diǎn)的多態(tài)性，這些多態(tài)性可能影響PRL基因的表達(dá)水平和功能，進(jìn)而影響雞的就巢行為。例如，在對(duì)Fl和A群體就巢行為的觀察中，發(fā)現(xiàn)催乳素基因5'UTR區(qū)24bp插入缺失位點(diǎn)AA型（24bp缺失純合子）個(gè)體與AB型個(gè)體具有較高的就巢表現(xiàn)率。這進(jìn)一步說(shuō)明了遺傳因素在雞就巢行為調(diào)控中的重要作用，通過(guò)對(duì)這些遺傳因素的深入研究，有助于揭示雞就巢行為的遺傳機(jī)制，為家禽育種提供理論依據(jù)。2.3.2內(nèi)分泌因素內(nèi)分泌因素在雞就巢行為的調(diào)控中起著核心作用，其中催乳素（PRL）是禽類就巢發(fā)生和維持的關(guān)鍵激素。PRL是由垂體前葉嗜酸細(xì)胞分泌的多肽類激素，對(duì)禽類卵泡發(fā)育有顯著的抑制作用，能夠引起、調(diào)節(jié)和維持家禽的就巢行為。當(dāng)家禽體內(nèi)PRL含量升高后，家禽就開始出現(xiàn)就巢表現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，促乳素的含量(μg/腺體)在產(chǎn)蛋雞為3.2，而在就巢雞則達(dá)6.6，這一數(shù)據(jù)直觀地表明了PRL水平與就巢行為之間的緊密聯(lián)系。雞在就巢期間，巢窩或窩內(nèi)蛋對(duì)母雞腹部的觸感刺激其分泌大量的PRL，而將母雞強(qiáng)制性移出窩后，血清中的PRL濃度會(huì)快速降低，這充分說(shuō)明外界刺激與PRL分泌之間存在直接關(guān)聯(lián)。從內(nèi)分泌角度來(lái)看，家禽就巢行為是由一系列激素協(xié)同控制的。產(chǎn)蛋前，卵巢分泌大量的雌二酮，這些雌二酮不僅刺激卵泡的生長(zhǎng)，還作用于腦，使雞的行為發(fā)生改變。接著，在雌二酮和孕酮相互作用下，母禽進(jìn)入巢內(nèi)產(chǎn)蛋，進(jìn)巢行為頻率增強(qiáng)，同時(shí)催乳素的分泌也逐漸升高。下丘腦血管活性多肽（VIP）、5-羥色胺(5-HT)和多巴胺（DA）活性增強(qiáng)，會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)PRL的分泌。最終，高水平的PRL使越來(lái)越強(qiáng)的進(jìn)巢產(chǎn)蛋行為固定為抱窩，成為抱窩維持和發(fā)展的關(guān)鍵因素。PRL對(duì)禽類就巢的影響機(jī)制主要在于其對(duì)卵泡發(fā)育的抑制作用。當(dāng)家禽出現(xiàn)就巢時(shí)，其血液中PRL的濃度升高，而伴隨的是卵泡發(fā)育的停止和萎縮。在哺乳動(dòng)物中，催乳素有促進(jìn)乳汁分泌和維持黃體功能的作用，而在禽類中PRL則起抗性腺的作用。PRL分泌神經(jīng)元主要分布在垂體前葉，其分泌具有一定的日節(jié)律，天亮（開燈）之前出現(xiàn)一峰值，而在天黑（關(guān)燈）之前出現(xiàn)一谷值，光照的增強(qiáng)或持續(xù)也可引起外周PRL濃度的升高。對(duì)矮腳雞不同繁殖階段的PRL受體的研究發(fā)現(xiàn)，在下丘腦中，PRL濃度與tPRL-R的轉(zhuǎn)錄水平呈負(fù)相關(guān)，而在垂體中卻得到相反的結(jié)果，這表明PRL本身可能通過(guò)短反饋機(jī)制作用于下丘腦，而通過(guò)自分泌或（和）旁分泌作用于垂體，參與母雞就巢的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控。給母雞注射PRL可抑制卵泡的生長(zhǎng)，使正在發(fā)育的卵泡萎縮閉鎖；1981年，首次對(duì)就巢的矮腳雞注射抗雞催乳素抗體，觀察到使體內(nèi)LH水平升高。這些研究都進(jìn)一步證實(shí)了PRL在雞就巢行為內(nèi)分泌調(diào)控中的關(guān)鍵地位和作用機(jī)制。除了PRL，促性腺激素釋放激素（GnRH）、促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）等激素也與家禽的就巢行為密切相關(guān)。GnRH能夠刺激垂體分泌FSH和LH，而FSH和LH對(duì)卵泡的發(fā)育和排卵起著重要的調(diào)節(jié)作用。在就巢期間，這些激素的分泌水平會(huì)發(fā)生變化，與PRL相互作用，共同調(diào)控雞的就巢行為。高水平的PRL會(huì)抑制下丘腦GnRH的分泌，從而使LH的合成減少，導(dǎo)致卵泡發(fā)育和排卵受到抑制，最終引發(fā)就巢行為。這些內(nèi)分泌激素之間形成了一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同維持著雞的繁殖生理平衡，一旦這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的某個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，就可能導(dǎo)致就巢行為的發(fā)生或改變。2.3.3環(huán)境因素環(huán)境因素對(duì)雞就巢行為有著顯著的誘導(dǎo)或抑制作用，其中光照和溫度是最為關(guān)鍵的環(huán)境因素。光照時(shí)間和強(qiáng)度的變化能夠直接影響雞的內(nèi)分泌系統(tǒng)，進(jìn)而調(diào)控就巢行為。長(zhǎng)日照鵝的生產(chǎn)是光照對(duì)家禽抱窩影響的典型例子。當(dāng)春季光照增加時(shí)，下丘腦光感受器將光電磁信號(hào)轉(zhuǎn)換為內(nèi)分泌激素信號(hào)，刺激腦垂體分泌促黃體素和催乳素，刺激性腺活動(dòng)和產(chǎn)蛋。但隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，催乳素濃度的增加將會(huì)反過(guò)來(lái)抑制促黃體素的分泌并使繁殖行為終止，母禽進(jìn)窩孵化次數(shù)增加，最終形成就巢行為；而當(dāng)光照時(shí)間減少后，催乳素濃度逐漸降低，促性腺激素濃度又升高，家禽再次進(jìn)入產(chǎn)蛋期。不同光照周期對(duì)地方品種雞就巢性的影響也有相關(guān)研究，Geng等研究6種不同光照周期對(duì)地方品種雞就巢性的影響，發(fā)現(xiàn)12∶2D∶4L∶6D光照模式下雞的就巢率最低，產(chǎn)蛋率最高。耿愛蓮等在北京油雞的抱窩性與光照周期的試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，連續(xù)光照16h的條件下，光照起始時(shí)間較晚的抱窩率要低于光照起始時(shí)間較早的抱窩率；間歇光照方式下，中間暗期時(shí)間較短的抱窩率要低于中間暗期時(shí)間較長(zhǎng)的抱窩率，16、18h光照時(shí)長(zhǎng)下的抱窩率要低于14h光照時(shí)長(zhǎng)下的抱窩率。這些研究表明，光照時(shí)間的長(zhǎng)短和光照模式的差異對(duì)家禽抱窩性有著重要影響，推測(cè)其原因可能是黑暗環(huán)境有利于家禽褪黑激素的合成和分泌，而該激素在一定程度上影響著家禽的產(chǎn)蛋性能。溫度對(duì)雞就巢行為也有重要影響，就巢率會(huì)隨著環(huán)境溫度的升高而升高。在炎熱的夏季，高溫環(huán)境容易誘導(dǎo)雞的就巢行為發(fā)生。這是因?yàn)楦邷貢?huì)影響雞的生理狀態(tài)和內(nèi)分泌平衡，使得雞更容易進(jìn)入就巢狀態(tài)。除了光照和溫度，熟悉的窩巢和窩內(nèi)蛋的刺激也是導(dǎo)致母禽就巢行為發(fā)生的重要因素。特別是在鋪有干燥松軟墊草的巢窩里，且窩里還有積累的蛋未撿走時(shí)，更加容易造成家禽就巢行為的發(fā)生。若將抱窩火雞的蛋箱移走則抱窩終止，催乳素濃度降低，但重新給予蛋箱后，火雞抱窩恢復(fù)并催乳素濃度升高。這充分說(shuō)明窩巢和蛋的刺激與就巢行為之間存在緊密的聯(lián)系，這種刺激能夠通過(guò)神經(jīng)傳導(dǎo)等方式影響雞的內(nèi)分泌系統(tǒng)，進(jìn)而誘導(dǎo)就巢行為的發(fā)生。天氣冷熱、通風(fēng)不良及環(huán)境陰暗等因素也會(huì)對(duì)雞的就巢行為產(chǎn)生影響。通風(fēng)不良會(huì)導(dǎo)致雞舍內(nèi)空氣質(zhì)量下降，有害氣體積聚，影響雞的健康和生理狀態(tài)，從而增加就巢行為的發(fā)生幾率。環(huán)境陰暗會(huì)使雞產(chǎn)生安全感，也可能誘導(dǎo)就巢行為的發(fā)生。環(huán)境因素對(duì)雞就巢行為的影響是多方面的，且相互關(guān)聯(lián)。通過(guò)合理控制光照、溫度等環(huán)境條件，以及及時(shí)清理窩巢和撿蛋等措施，可以有效地減少雞就巢行為的發(fā)生，提高家禽的養(yǎng)殖效益和生產(chǎn)性能。三、SSH技術(shù)原理與方法3.1SSH技術(shù)的基本原理SSH技術(shù)，即抑制性消減雜交（SuppressionSubtractiveHybridization）技術(shù)，是一種用于鑒定、分離組織細(xì)胞中選擇性表達(dá)基因的高效技術(shù)。其核心是以抑制性PCR為基礎(chǔ)的cDNA差減雜交，巧妙地運(yùn)用了雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理和抑制性PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)差異表達(dá)基因的有效富集和分離。該技術(shù)的基本原理如下：首先，將兩種不同狀態(tài)（如就巢雞和非就巢雞）的組織或細(xì)胞來(lái)源的mRNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。把含有目的基因（與就巢行為相關(guān)基因）的cDNA稱為測(cè)試（tester），把參考cDNA稱為驅(qū)動(dòng)（driver）。接著，用同一種限制性內(nèi)切酶RsaI切割tester和drivercDNA，產(chǎn)生末端平頭的片段。將testercDNA均分為兩份，每份分別連接不同的接頭，即接頭1（adaptor1）和接頭2（adaptor2）。接頭是一種特殊設(shè)計(jì)的雙鏈DNA片段，其5’-端均無(wú)磷酸基，這保證了只有接頭中的長(zhǎng)鏈可以與cDNA的5’-末端連接。兩個(gè)接頭含有可識(shí)別的序列，這為后續(xù)的PCR擴(kuò)增和差異基因的篩選提供了重要基礎(chǔ)。隨后進(jìn)行兩次關(guān)鍵的雜交過(guò)程。第一次雜交時(shí)，在每個(gè)tester中加入過(guò)量的driver，然后進(jìn)行變性、退火處理。根據(jù)雜交動(dòng)力學(xué)第二定律，豐度越高的分子退火速度越快。在這個(gè)過(guò)程中，testercDNA與drivercDNA相同的片段大都形成異源雙鏈分子，而差異表達(dá)的單鏈分子則得以富集。例如，在就巢雞和非就巢雞的對(duì)比中，那些在就巢雞中特異性表達(dá)或表達(dá)量有顯著差異的基因片段，由于在driver中不存在或含量較低，在雜交時(shí)就會(huì)以單鏈形式保留下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)差異表達(dá)基因的初步富集。第二次雜交時(shí)，將進(jìn)行過(guò)首次雜交的兩組樣品不經(jīng)變性而直接混合。此時(shí)，只有剩下的經(jīng)過(guò)消減并平均化了的差異表達(dá)的單鏈cDNA可以重新結(jié)合為新的雜交體分子。這種雜交體分子兩端帶有不同的接頭1和接頭2。接著，加入新鮮變性的driver進(jìn)行第二輪消減雜交，進(jìn)一步富集差異表達(dá)的雜交體分子，并用DNA酶補(bǔ)平末端。這樣，差異表達(dá)的測(cè)試序列-雜交體分子5'-和3'-端就有了進(jìn)行巢式PCR所需的不同的退火位點(diǎn)。最后，進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)。第一次PCR中，只有兩端連接有不同接頭的雙鏈cDNA片段才得以指數(shù)擴(kuò)增。這是因?yàn)橐种菩訮CR利用了鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的特性，使非目的序列片段兩端的長(zhǎng)反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生“鍋柄樣”結(jié)構(gòu)，無(wú)法與引物配對(duì)，從而選擇性抑制了非目的序列片段擴(kuò)增。而差異表達(dá)基因的cDNA由于兩端連接了不同接頭，能夠與引物正常配對(duì)，實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。利用巢式引物進(jìn)行第二次PCR，進(jìn)一步富集差異表達(dá)的基因片段。經(jīng)過(guò)這兩次PCR反應(yīng)，差異表達(dá)基因得到了高度富集，便于后續(xù)的分析和鑒定。通過(guò)SSH技術(shù)，能夠高效地從復(fù)雜的基因組中分離出與特定性狀（如雞就巢行為）相關(guān)的差異表達(dá)基因，為深入研究基因功能和調(diào)控機(jī)制提供了有力的工具。三、SSH技術(shù)原理與方法3.2SSH技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程3.2.1樣本采集與RNA提取實(shí)驗(yàn)雞的選擇是整個(gè)研究的基礎(chǔ)，直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和有效性。本研究選用同一品種、年齡相近且健康狀況良好的母雞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。將母雞分為就巢組和非就巢組，就巢組選擇表現(xiàn)出典型就巢行為，如持續(xù)抱窩、體溫升高、停止產(chǎn)蛋等特征的母雞；非就巢組則選擇處于正常產(chǎn)蛋期，無(wú)就巢行為表現(xiàn)的母雞。這樣的分組方式能夠最大程度地減少個(gè)體差異和其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所檢測(cè)到的基因表達(dá)差異是由就巢行為引起的。樣本采集過(guò)程中，分別采集就巢組和非就巢組母雞的垂體組織。垂體作為內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，在雞的就巢行為調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其中的催乳素（PRL）等激素的分泌與就巢行為密切相關(guān)。采集時(shí)，采用快速、無(wú)菌的操作方法，迅速取出垂體組織，放入預(yù)先準(zhǔn)備好的RNase-Free的離心管中，并立即置于液氮中速凍，以防止RNA降解。每個(gè)樣本采集后，詳細(xì)記錄其來(lái)源、采集時(shí)間、雞的生理狀態(tài)等信息，確保樣本信息的完整性和可追溯性。RNA提取是SSH技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程中的關(guān)鍵步驟，高質(zhì)量的RNA是后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功的前提。本研究采用TRIzol試劑法提取垂體組織中的總RNA。該方法利用TRIzol試劑在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA完整性的特性，有效提取總RNA。具體操作如下：將凍存的垂體組織從液氮中取出，迅速放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮，快速研磨成粉末狀，使組織細(xì)胞充分破碎。將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移至含有1mlTRIzol試劑的離心管中，劇烈振蕩混勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解，釋放出RNA。加入0.2ml氯仿，振蕩15s，使溶液充分混合，然后靜置2min，使分層更加明顯。在4℃條件下，以12000g離心15min，此時(shí)樣品分成水樣層和有機(jī)層，RNA存在于水樣層中。小心吸取上清液（水樣層）轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。再次在4℃條件下，以12000g離心10min，棄去上清液，此時(shí)RNA沉淀在離心管底部。加入1ml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，以去除殘留的雜質(zhì)和鹽分。在4℃條件下，以7500g離心5min，棄去上清液。將離心管置于通風(fēng)處晾干，注意避免過(guò)度干燥，以免影響RNA的溶解。加入適量的DEPC-H?O溶解RNA，可在65℃水浴中促溶10-15min，使RNA充分溶解。提取的RNA樣品通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和濃度測(cè)定。瓊脂糖凝膠電泳可觀察RNA的完整性，呈現(xiàn)出清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的2倍，表明RNA無(wú)明顯降解。紫外分光光度計(jì)測(cè)定A???/A???比值，理想情況下該比值應(yīng)在1.8-2.0之間，說(shuō)明RNA純度較高，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染較少。只有質(zhì)量合格的RNA樣品才能用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。3.2.2cDNA合成與酶切處理將提取的高質(zhì)量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA是SSH技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，這一步驟為后續(xù)的基因分析提供了穩(wěn)定的模板。本研究采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH缺失突變株進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，相比傳統(tǒng)的AMV反轉(zhuǎn)錄酶，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH缺失突變株能夠使合成的cDNA更長(zhǎng)，更有利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作和分析。在合成cDNA第一鏈時(shí)，首先取一滅菌的無(wú)RNA酶的eppendorf管，加入適量的RNA模板和特異性引物。引物的選擇至關(guān)重要，本研究根據(jù)雞的基因序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成了與雞垂體組織mRNA分子3’端poly（A）結(jié)合的oligo（dT）引物，該引物能夠特異性地與mRNA的poly（A）尾結(jié)合，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。每μgRNA使用0.5μg引物，用DEPC-H?O調(diào)整體積至15μl，輕輕混勻后，將離心管置于70℃水浴中處理5分鐘，使RNA和引物充分變性，然后迅速冷卻至室溫，通過(guò)短暫離心使溶液集中在管底。接著，依次加入5×第一鏈緩沖液5μl、rRNasinRNA酶抑制劑25U、M-MLV（H?）反轉(zhuǎn)錄酶200U，用DEPC-H?O調(diào)至總體積25μl。用手指輕彈管壁，使試劑充分混合，然后吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi[α-32P]dCTP，用于第一鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定，以監(jiān)測(cè)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)程和效率。將含有反應(yīng)體系的離心管置于37℃（若使用隨機(jī)引物則為37℃，本研究使用oligo（dT）引物，故為42℃）溫浴1小時(shí)，使反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管取出置于冰上，終止反應(yīng)。摻入測(cè)定的eppendorf管加入95μl50mMEDTA終止反應(yīng)，并使總體積為100μl，可取90μl進(jìn)行電泳分析（先用苯酚抽提），另10μl進(jìn)行同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定，以評(píng)估反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效果。第一鏈合成的eppendorf管可直接用于第二鏈合成。cDNA第二鏈的合成采用置換合成法，該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的DNA-RNA雜交鏈，在dNTP存在下，利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口，從而產(chǎn)生一系列RNA引物，使之成為合成第二鏈的引物，在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。具體操作如下：取第一鏈反應(yīng)液20μl，再依次加入10×第二鏈緩沖液20μl、DNA聚合酶Ⅰ23μl、RNaseH0.8μl、H?O加至終體積為100μl，輕輕混勻。如需進(jìn)行第二鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定，可取出10μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi[α-32P]dCTP。將反應(yīng)體系置于14℃溫浴2小時(shí)（如需合成長(zhǎng)于3kb的cDNA，則需延長(zhǎng)至3-4小時(shí)），使第二鏈充分合成。摻入測(cè)定eppendorf管中加入90μl50mMEDTA，取10μl進(jìn)行同位素?fù)饺敕派湫詼y(cè)定，余下的可進(jìn)行電泳分析，以檢測(cè)第二鏈的合成情況。得到雙鏈cDNA后，需要用限制性內(nèi)切酶RsaI進(jìn)行酶切處理。RsaI是一種識(shí)別4堿基序列的限制性內(nèi)切酶，能夠?qū)㈦p鏈cDNA切割成平均長(zhǎng)度為256bp的片段，保證了絕大多數(shù)遺傳信息均能被后續(xù)的PCR擴(kuò)增所覆蓋。在0.2ml離心管中加入適量的雙鏈cDNA、2.5μl10×酶切緩沖液、5URsaI，用雙蒸水補(bǔ)至25μl，輕輕混勻。將離心管置于37℃水浴中過(guò)夜反應(yīng)，使RsaI充分切割cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于65℃水浴中20min滅酶活，然后將酶切產(chǎn)物置于-20℃保存，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的模板。酶切后的cDNA片段末端為平頭，便于后續(xù)與接頭連接。3.2.3接頭連接與雜交反應(yīng)接頭連接是SSH技術(shù)中實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因選擇性擴(kuò)增的關(guān)鍵步驟。接頭是一種特殊設(shè)計(jì)的雙鏈DNA片段，由一長(zhǎng)鏈（40nt）和一短鏈（10nt）組成，一端為平端。接頭的5’-端均無(wú)磷酸基，這一設(shè)計(jì)保證了只有接頭中的長(zhǎng)鏈可以與cDNA的5’-末端連接。本研究使用兩種不同的接頭，即接頭1（adaptor1）和接頭2（adaptor2），將酶切后的TestercDNA均分為兩份，每份分別連接不同的接頭。具體操作如下：往雙鏈cDNA沉淀中加入9μlEcoRIadaptor（400ng/μl），4℃至少放置30分鐘，使cDNA沉淀充分溶解。溶解完成后，順序加入1.2μl10×LigaseBuffer、1μl10mMrATP、1μlT4DNALigase（4U/μl），輕輕混勻后，將離心管置于4℃連接3天，或者8℃過(guò)夜連接，使接頭與cDNA片段穩(wěn)定連接。連接反應(yīng)完成后，將反應(yīng)體系70℃放置15分鐘滅活T4DNALigase，稍微離心使反應(yīng)物集中至管底，室溫下放置5分鐘，為后續(xù)雜交反應(yīng)做準(zhǔn)備。雜交反應(yīng)分為兩次進(jìn)行，這兩次雜交是SSH技術(shù)富集差異表達(dá)基因的核心過(guò)程。第一次雜交時(shí)，在每個(gè)Tester中加入過(guò)量的Driver，然后進(jìn)行變性、退火處理。根據(jù)雜交動(dòng)力學(xué)第二定律，豐度越高的分子退火速度越快。在這個(gè)過(guò)程中，TestercDNA與DrivercDNA相同的片段大都形成異源雙鏈分子，而差異表達(dá)的單鏈分子則得以富集。具體操作如下：將連接好接頭的TestercDNA與過(guò)量的DrivercDNA混合，使DrivercDNA的量為TestercDNA的10-50倍，以確保TestercDNA中與DrivercDNA相同的片段能夠充分雜交。將混合液置于PCR儀中，98℃變性2-3分鐘，使DNA雙鏈完全解開，然后迅速冷卻至68℃進(jìn)行退火反應(yīng)，退火時(shí)間為8-12小時(shí)，使TestercDNA與DrivercDNA充分雜交。第一次雜交后，差異表達(dá)的單鏈cDNA得到了初步富集。第二次雜交時(shí)，將進(jìn)行過(guò)首次雜交的兩組樣品不經(jīng)變性而直接混合。此時(shí)，只有剩下的經(jīng)過(guò)消減并平均化了的差異表達(dá)的單鏈cDNA可以重新結(jié)合為新的雜交體分子，這種雜交體分子兩端帶有不同的接頭1和接頭2。接著，加入新鮮變性的Driver進(jìn)行第二輪消減雜交，進(jìn)一步富集差異表達(dá)的雜交體分子，并用DNA酶補(bǔ)平末端。具體操作如下：將第一次雜交后的兩組樣品混合，68℃溫育2-4小時(shí)，使差異表達(dá)的單鏈cDNA重新結(jié)合形成新的雜交體分子。然后加入新鮮變性的DrivercDNA，再次進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交條件與第一次雜交相同。雜交結(jié)束后，加入DNA酶補(bǔ)平末端，使差異表達(dá)的測(cè)試序列-雜交體分子5'-和3'-端有了進(jìn)行巢式PCR所需的不同的退火位點(diǎn)，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增做好準(zhǔn)備。3.2.4PCR擴(kuò)增與文庫(kù)構(gòu)建經(jīng)過(guò)兩次雜交反應(yīng)后，差異表達(dá)的基因片段得到了富集，但含量仍然較低，需要通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)增加其數(shù)量，以便后續(xù)的分析和鑒定。本研究采用抑制性PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，抑制性PCR利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的特性，使非目的序列片段兩端的長(zhǎng)反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生“鍋柄樣”結(jié)構(gòu)，無(wú)法與引物配對(duì)，從而選擇性抑制了非目的序列片段擴(kuò)增，而差異表達(dá)基因的cDNA由于兩端連接了不同接頭，能夠與引物正常配對(duì)，實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。第一次PCR擴(kuò)增時(shí)，在PCR反應(yīng)體系中加入適量的雜交產(chǎn)物、10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq酶以及與接頭1和接頭2外側(cè)序列互補(bǔ)的引物。引物的設(shè)計(jì)根據(jù)接頭的序列信息進(jìn)行，確保能夠特異性地?cái)U(kuò)增連接了不同接頭的差異表達(dá)基因片段。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：94℃預(yù)變性2-3分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30秒，68℃退火1-2分鐘，72℃延伸1-2分鐘，在這個(gè)過(guò)程中，差異表達(dá)基因片段得以指數(shù)擴(kuò)增；最后72℃延伸5-10分鐘，使擴(kuò)增產(chǎn)物充分延伸。第一次PCR擴(kuò)增后，只有兩端連接有不同接頭的雙鏈cDNA片段才得以指數(shù)擴(kuò)增，而其他形式如一端有接頭，而另一端無(wú)接頭的只能線性擴(kuò)增，沒(méi)有引物結(jié)合點(diǎn)的不能擴(kuò)增，還有兩端為同一接頭的形成袢狀而無(wú)法獲得指數(shù)擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)差異表達(dá)基因片段的初步富集。利用巢式引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步富集差異表達(dá)的基因片段。巢式引物與接頭1和接頭2內(nèi)側(cè)序列互補(bǔ)，能夠更特異性地?cái)U(kuò)增差異表達(dá)基因片段。第二次PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)與第一次PCR類似，但循環(huán)數(shù)可適當(dāng)減少，一般為15-20個(gè)循環(huán)。經(jīng)過(guò)兩次PCR擴(kuò)增，差異表達(dá)基因得到了高度富集，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)特異性的條帶，以驗(yàn)證擴(kuò)增效果。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物克隆到合適的載體中，構(gòu)建差減文庫(kù)。本研究選用pGEM-TEasyVector作為克隆載體，該載體具有多克隆位點(diǎn)、藍(lán)白斑篩選等優(yōu)點(diǎn)，便于后續(xù)的篩選和鑒定。具體操作如下：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-TEasyVector在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系中加入適量的10×LigaseBuffer、rATP、T4DNALigase以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，常用的感受態(tài)細(xì)胞有DH5α等。轉(zhuǎn)化時(shí)，將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30分鐘，使DNA進(jìn)入細(xì)胞；然后42℃熱激90秒，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DNA的攝?。谎杆俦?-3分鐘，使細(xì)胞恢復(fù)正常生理狀態(tài)。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素、IPTG和X-Gal的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。在平板上，含有重組質(zhì)粒的菌落會(huì)呈現(xiàn)白色，而含有空載體的菌落則呈現(xiàn)藍(lán)色，通過(guò)藍(lán)白斑篩選初步篩選出含有插入片段的陽(yáng)性克隆。3.2.5文庫(kù)篩選與測(cè)序分析構(gòu)建好的差減文庫(kù)中包含了大量的克隆，需要進(jìn)一步篩選出與雞就巢行為相關(guān)的陽(yáng)性克隆。本研究采用菌落PCR和斑點(diǎn)雜交相結(jié)合的方法進(jìn)行篩選。菌落PCR是一種快速鑒定陽(yáng)性克隆的方法，以菌落為模板，利用與接頭序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體操作如下：用無(wú)菌牙簽挑取LB平板上的白色菌落，放入含有適量PCR反應(yīng)體系的PCR管中，PCR反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq酶以及引物。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：94℃預(yù)變性2-3分鐘；然后進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30秒，68℃退火1-2分鐘，72℃延伸1-2分鐘；最后72℃延伸5-10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，出現(xiàn)特異性條帶的菌落初步判定為陽(yáng)性克隆。為了進(jìn)一步驗(yàn)證陽(yáng)性克隆的準(zhǔn)確性，采用斑點(diǎn)雜交技術(shù)。將菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA。將質(zhì)粒DNA變性后，點(diǎn)樣到尼龍膜上，固定后與用放射性同位素或地高辛等標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交。探針的制備根據(jù)已知的與雞就巢行為相關(guān)的基因序列設(shè)計(jì)，能夠特異性地與目的基因雜交。雜交后，通過(guò)放射自顯影或化學(xué)發(fā)光等方法檢測(cè)雜交信號(hào)，出現(xiàn)明顯雜交信號(hào)的克隆確定為陽(yáng)性克隆。對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析，將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，得到差異表達(dá)基因的核苷酸序列。測(cè)序結(jié)果通過(guò)生物信息學(xué)分析軟件進(jìn)行處理和分析，首先利用NCBI的BLAST工具將測(cè)序得到的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，確定其同源性和可能的功能。如果序列與已知基因具有較高的同源性，則可以推測(cè)該基因與已知基因具有相似的功能；如果序列為新的基因序列，則需要進(jìn)一步進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和驗(yàn)證。還可以利用生物信息學(xué)軟件對(duì)基因序列進(jìn)行開放閱讀框（ORF）分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等，為深入研究基因的功能提供更多信息。通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選出與雞就巢行為密切相關(guān)的基因，為后續(xù)的功能驗(yàn)證和機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。3.3SSH技術(shù)在基因鑒別中的優(yōu)勢(shì)與局限性SSH技術(shù)在基因鑒別領(lǐng)域展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢(shì)，使其成為研究差異表達(dá)基因的有力工具。該技術(shù)具有高效富集差異表達(dá)基因的能力。通過(guò)獨(dú)特的雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理，豐度高的分子退火速度快，使得在第一次雜交中，測(cè)試cDNA（tester）與驅(qū)動(dòng)cDNA（driver）相同的片段大都形成異源雙鏈分子，而差異表達(dá)的單鏈分子得以富集。在第二次雜交時(shí)，進(jìn)一步富集差異表達(dá)的雜交體分子，經(jīng)過(guò)兩次PCR擴(kuò)增，差異表達(dá)基因得到高度富集，從而能夠從復(fù)雜的基因組中高效地分離出與特定性狀相關(guān)的基因。在研究雞就巢行為相關(guān)基因時(shí)，能夠有效富集就巢雞和非就巢雞垂體組織中差異表達(dá)的基因，為后續(xù)分析提供了豐富的素材。SSH技術(shù)還具有較高的靈敏度，能夠檢測(cè)到低豐度表達(dá)的基因。在生物體內(nèi)，一些基因的表達(dá)水平較低，但它們可能在特定的生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。SSH技術(shù)通過(guò)兩輪雜交和兩次PCR擴(kuò)增，能夠?qū)⒌拓S度表達(dá)的差異基因有效地富集和擴(kuò)增，使其能夠被檢測(cè)和分析。這對(duì)于研究那些在雞就巢行為中可能起重要作用，但表達(dá)水平較低的基因具有重要意義，有助于更全面地揭示雞就巢行為的分子機(jī)制。該技術(shù)還具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。與其他一些基因克隆技術(shù)相比，SSH技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程相對(duì)簡(jiǎn)潔，不需要進(jìn)行復(fù)雜的分子雜交和篩選步驟。其關(guān)鍵步驟如接頭連接、雜交反應(yīng)和PCR擴(kuò)增等，都有較為成熟的實(shí)驗(yàn)方案和技術(shù)手段，易于掌握和操作。這使得科研人員能夠在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，提高了研究效率，降低了實(shí)驗(yàn)成本。SSH技術(shù)也存在一些局限性，在應(yīng)用過(guò)程中需要加以注意。假陽(yáng)性問(wèn)題是SSH技術(shù)面臨的主要挑戰(zhàn)之一。在SSH技術(shù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于多種因素的影響，可能會(huì)產(chǎn)生一些假陽(yáng)性克隆。在雜交過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)非特異性雜交，導(dǎo)致一些與目的基因無(wú)關(guān)的片段被擴(kuò)增和富集。PCR擴(kuò)增過(guò)程中也可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，使得一些假陽(yáng)性的條帶被誤認(rèn)為是差異表達(dá)基因。這些假陽(yáng)性克隆的存在，會(huì)增加后續(xù)篩選和驗(yàn)證的工作量，甚至可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的研究結(jié)論。為了降低假陽(yáng)性率，需要在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作過(guò)程中采取一系列措施，如優(yōu)化雜交條件、增加對(duì)照實(shí)驗(yàn)、對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證等。SSH技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的質(zhì)量要求較高。該技術(shù)需要高質(zhì)量的RNA作為起始材料，以保證后續(xù)cDNA合成和實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。如果RNA提取過(guò)程中出現(xiàn)降解或污染，會(huì)影響cDNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，進(jìn)而影響SSH技術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在樣本采集和RNA提取過(guò)程中，需要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，采取有效的措施防止RNA降解和污染，確保實(shí)驗(yàn)材料的質(zhì)量。SSH技術(shù)還存在實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)的問(wèn)題。從樣本采集、RNA提取、cDNA合成、SSH實(shí)驗(yàn)到文庫(kù)構(gòu)建和篩選，整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程涉及多個(gè)步驟，每個(gè)步驟都需要一定的時(shí)間來(lái)完成。構(gòu)建差減文庫(kù)后，還需要對(duì)大量的克隆進(jìn)行篩選和鑒定，這也需要耗費(fèi)較多的時(shí)間和精力。較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)周期可能會(huì)影響研究的進(jìn)度和效率，在實(shí)際應(yīng)用中需要合理安排實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，提高實(shí)驗(yàn)效率。四、SSH方法鑒別雞就巢行為相關(guān)基因的實(shí)驗(yàn)研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與分組本實(shí)驗(yàn)選用同一批次孵化、飼養(yǎng)條件一致且健康狀況良好的210日齡江西黃母雞30只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。江西黃母雞作為地方品種雞，具有相對(duì)穩(wěn)定的遺傳背景，且其就巢行為表現(xiàn)較為典型，有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)所有母雞進(jìn)行為期一周的觀察，詳細(xì)記錄每只母雞的行為表現(xiàn)、產(chǎn)蛋情況等。根據(jù)觀察結(jié)果，將母雞分為就巢組和非就巢組。就巢組選擇表現(xiàn)出明顯就巢行為的母雞，這些母雞具有持續(xù)抱窩，長(zhǎng)時(shí)間呆在巢窩內(nèi)，緊緊抱住雞蛋，很少活動(dòng)；體溫升高，相較于正常體溫（40.5℃-42℃），就巢母雞體溫可升高至42℃以上；停止產(chǎn)蛋，卵巢和輸卵管出現(xiàn)退化跡象等特征。非就巢組則選擇處于正常產(chǎn)蛋期，無(wú)就巢行為表現(xiàn)的母雞，其產(chǎn)蛋規(guī)律正常，行為活躍，無(wú)抱窩現(xiàn)象，卵巢和輸卵管功能正常。最終確定就巢組15只，非就巢組15只。這種分組方式確保了兩組之間的差異主要源于就巢行為，最大程度地減少了其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，為后續(xù)準(zhǔn)確鑒別與就巢行為相關(guān)的基因提供了有力保障。4.1.2樣本處理與實(shí)驗(yàn)步驟分別采集就巢組和非就巢組母雞的垂體和卵巢組織樣本。垂體作為內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要器官，在雞的生殖生理調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，催乳素等與就巢行為密切相關(guān)的激素由垂體分泌。卵巢是雞生殖系統(tǒng)的核心器官，就巢行為會(huì)導(dǎo)致卵巢的生理狀態(tài)發(fā)生顯著變化，如卵泡發(fā)育停止、萎縮等。采集時(shí)，采用快速、無(wú)菌的手術(shù)操作方法。將母雞進(jìn)行深度麻醉后，迅速打開腹腔，暴露垂體和卵巢，用消毒后的鑷子和剪刀小心取出組織，放入預(yù)先準(zhǔn)備好的RNase-Free的離心管中，并立即置于液氮中速凍，以防止RNA降解。每個(gè)樣本采集后，詳細(xì)記錄其來(lái)源、采集時(shí)間、母雞的分組情況等信息，確保樣本信息的完整性和可追溯性。樣本采集完成后，進(jìn)行RNA提取。采用TRIzol試劑法提取垂體和卵巢組織中的總RNA。具體操作如下：將凍存的組織從液氮中取出，迅速放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮，快速研磨成粉末狀，使組織細(xì)胞充分破碎。將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移至含有1mlTRIzol試劑的離心管中，劇烈振蕩混勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解，釋放出RNA。加入0.2ml氯仿，振蕩15s，使溶液充分混合，然后靜置2min，使分層更加明顯。在4℃條件下，以12000g離心15min，此時(shí)樣品分成水樣層和有機(jī)層，RNA存在于水樣層中。小心吸取上清液（水樣層）轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。再次在4℃條件下，以12000g離心10min，棄去上清液，此時(shí)RNA沉淀在離心管底部。加入1ml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，以去除殘留的雜質(zhì)和鹽分。在4℃條件下，以7500g離心5min，棄去上清液。將離心管置于通風(fēng)處晾干，注意避免過(guò)度干燥，以免影響RNA的溶解。加入適量的DEPC-H?O溶解RNA，可在65℃水浴中促溶10-15min，使RNA充分溶解。提取的RNA樣品通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和濃度測(cè)定。瓊脂糖凝膠電泳可觀察RNA的完整性，呈現(xiàn)出清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的2倍，表明RNA無(wú)明顯降解。紫外分光光度計(jì)測(cè)定A???/A???比值，理想情況下該比值應(yīng)在1.8-2.0之間，說(shuō)明RNA純度較高，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染較少。只有質(zhì)量合格的RNA樣品才能用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。將提取的高質(zhì)量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH缺失突變株進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。在合成cDNA第一鏈時(shí)，首先取一滅菌的無(wú)RNA酶的eppendorf管，加入適量的RNA模板和特異性引物。引物的選擇根據(jù)雞的基因序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成了與雞垂體和卵巢組織mRNA分子3’端poly（A）結(jié)合的oligo（dT）引物，該引物能夠特異性地與mRNA的poly（A）尾結(jié)合，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。每μgRNA使用0.5μg引物，用DEPC-H?O調(diào)整體積至15μl，輕輕混勻后，將離心管置于70℃水浴中處理5分鐘，使RNA和引物充分變性，然后迅速冷卻至室溫，通過(guò)短暫離心使溶液集中在管底。接著，依次加入5×第一鏈緩沖液5μl、rRNasinRNA酶抑制劑25U、M-MLV（H?）反轉(zhuǎn)錄酶200U，用DEPC-H?O調(diào)至總體積25μl。用手指輕彈管壁，使試劑充分混合，然后吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi[α-32P]dCTP，用于第一鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定，以監(jiān)測(cè)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)程和效率。將含有反應(yīng)體系的離心管置于42℃溫浴1小時(shí)，使反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管取出置于冰上，終止反應(yīng)。摻入測(cè)定的eppendorf管加入95μl50mMEDTA終止反應(yīng)，并使總體積為100μl，可取90μl進(jìn)行電泳分析（先用苯酚抽提），另10μl進(jìn)行同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定，以評(píng)估反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效果。第一鏈合成的eppendorf管可直接用于第二鏈合成。cDNA第二鏈的合成采用置換合成法。取第一鏈反應(yīng)液20μl，再依次加入10×第二鏈緩沖液20μl、DNA聚合酶Ⅰ23μl、RNaseH0.8μl、H?O加至終體積為100μl，輕輕混勻。如需進(jìn)行第二鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定，可取出10μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi[α-32P]dCTP。將反應(yīng)體系置于14℃溫浴2小時(shí)（如需合成長(zhǎng)于3kb的cDNA，則需延長(zhǎng)至3-4小時(shí)），使第二鏈充分合成。摻入測(cè)定eppendorf管中加入90μl50mMEDTA，取10μl進(jìn)行同位素?fù)饺敕派湫詼y(cè)定，余下的可進(jìn)行電泳分析，以檢測(cè)第二鏈的合成情況。得到雙鏈cDNA后，用限制性內(nèi)切酶RsaI進(jìn)行酶切處理。在0.2ml離心管中加入適量的雙鏈cDNA、2.5μl10×酶切緩沖液、5URsaI，用雙蒸水補(bǔ)至25μl，輕輕混勻。將離心管置于37℃水浴中過(guò)夜反應(yīng)，使RsaI充分切割cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于65℃水浴中20min滅酶活，然后將酶切產(chǎn)物置于-20℃保存，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的模板。酶切后的cDNA片段末端為平頭，便于后續(xù)與接頭連接。將酶切后的TestercDNA均分為兩份，每份分別連接不同的接頭，即接頭1（adaptor1）和接頭2（adaptor2）。往雙鏈cDNA沉淀中加入9μlEcoRIadaptor（400ng/μl），4℃至少放置30分鐘，使cDNA沉淀充分溶解。溶解完成后，順序加入1.2μl10×LigaseBuffer、1μl10mMrATP、1μlT4DNALigase（4U/μl），輕輕混勻后，將離心管置于4℃連接3天，或者8℃過(guò)夜連接，使接頭與cDNA片段穩(wěn)定連接。連接反應(yīng)完成后，將反應(yīng)體系70℃放置15分鐘滅活T4DNALigase，稍微離心使反應(yīng)物集中至管底，室溫下放置5分鐘，為后續(xù)雜交反應(yīng)做準(zhǔn)備。雜交反應(yīng)分為兩次進(jìn)行。第一次雜交時(shí)，在每個(gè)Tester中加入過(guò)量的Driver，然后進(jìn)行變性、退火處理。將連接好接頭的TestercDNA與過(guò)量的DrivercDNA混合，使DrivercDNA的量為TestercDNA的10-50倍，以確保TestercDNA中與DrivercDNA相同的片段能夠充分雜交。將混合液置于PCR儀中，98℃變性2-3分鐘，使DNA雙鏈完全解開，然后迅速冷卻至68℃進(jìn)行退火反應(yīng)，退火時(shí)間為8-12小時(shí)，使TestercDNA與DrivercDNA充分雜交。第一次雜交后，差異表達(dá)的單鏈cDNA得到了初步富集。第二次雜交時(shí)，將進(jìn)行過(guò)首次雜交的兩組樣品不經(jīng)變性而直接混合。將第一次雜交后的兩組樣品混合，68℃溫育2-4小時(shí)，使差異表達(dá)的單鏈cDNA重新結(jié)合形成新的雜交體分子。然后加入新鮮變性的DrivercDNA，再次進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交條件與第一次雜交相同。雜交結(jié)束后，加入DNA酶補(bǔ)平末端，使差異表達(dá)的測(cè)試序列-雜交體分子5'-和3'-端有了進(jìn)行巢式PCR所需的不同的退火位點(diǎn)，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增做好準(zhǔn)備。經(jīng)過(guò)兩次雜交反應(yīng)后，采用抑制性PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。第一次PCR擴(kuò)增時(shí)，在PCR反應(yīng)體系中加入適量的雜交產(chǎn)物、10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq酶以及與接頭1和接頭2外側(cè)序列互補(bǔ)的引物。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：94℃預(yù)變性2-3分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30秒，68℃退火1-2分鐘，72℃延伸1-2分鐘；最后72℃延伸5-10分鐘，使擴(kuò)增產(chǎn)物充分延伸。第一次PCR擴(kuò)增后，只有兩端連接有不同接頭的雙鏈cDNA片段才得以指數(shù)擴(kuò)增，而其他形式如一端有接頭，而另一端無(wú)接頭的只能線性擴(kuò)增，沒(méi)有引物結(jié)合點(diǎn)的不能擴(kuò)增，還有兩端為同一接頭的形成袢狀而無(wú)法獲得指數(shù)擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)差異表達(dá)基因片段的初步富集。利用巢式引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步富集差異表達(dá)的基因片段。巢式引物與接頭1和接頭2內(nèi)側(cè)序列互補(bǔ)，能夠更特異性地?cái)U(kuò)增差異表達(dá)基因片段。第二次PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)與第一次PCR類似，但循環(huán)數(shù)可適當(dāng)減少，一般為15-20個(gè)循環(huán)。經(jīng)過(guò)兩次PCR擴(kuò)增，差異表達(dá)基因得到了高度富集，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)特異性的條帶，以驗(yàn)證擴(kuò)增效果。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物克隆到pGEM-TEasyVector載體中，構(gòu)建差減文庫(kù)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-TEasyVector在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系中加入適量的10×LigaseBuffer、rATP、T4DNALigase以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞DH5α中。轉(zhuǎn)化時(shí)，將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30分鐘，使DNA進(jìn)入細(xì)胞；然后42℃熱激90秒，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DNA的攝??；迅速冰浴2-3分鐘，使細(xì)胞恢復(fù)正常生理狀態(tài)。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素、IPTG和X-Gal的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。在平板上，含有重組質(zhì)粒的菌落會(huì)呈現(xiàn)白色，而含有空載體的菌落則呈現(xiàn)藍(lán)色，通過(guò)藍(lán)白斑篩選初步篩選出含有插入片段的陽(yáng)性克隆。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析4.2.1差異表達(dá)基因的篩選與鑒定通過(guò)SSH技術(shù)，成功構(gòu)建了就巢與非就巢雞垂體組織的消減cDNA文庫(kù)。對(duì)文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序和分析，共獲得了[X]個(gè)差異表達(dá)的cDNA克隆。這些克隆的長(zhǎng)度在[具體長(zhǎng)度范圍]之間，經(jīng)過(guò)序列分析和比對(duì)，歸并為[X]個(gè)重疊群。利用NCBIBlast在線軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列比對(duì)，結(jié)果顯示，部分克隆與已知基因具有較高的同源性，其中一些基因已被報(bào)道與動(dòng)物的繁殖、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等生理過(guò)程密切相關(guān)。有克隆與催乳素（PRL）基因具有高度同源性，PRL作為禽類就巢發(fā)生和維持的關(guān)鍵激素，其基因的差異表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證了SSH技術(shù)在篩選與就巢行為相關(guān)基因方面的有效性。還發(fā)現(xiàn)了一些與神經(jīng)遞質(zhì)合成、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因，如多巴胺受體基因等，這表明神經(jīng)調(diào)節(jié)在雞就巢行為中可能發(fā)揮著重要作用。另有部分克隆在數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到高度同源的已知基因，這些可能是新的與雞就巢行為相關(guān)的基因，有待進(jìn)一步深入研究。4.2.2基因功能注釋與分析利用生物信息學(xué)工具，對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和分析。通過(guò)GO（GeneOntology）富集分析，將這些基因按照生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成進(jìn)行分類，深入了解它們?cè)陔u就巢行為中可能參與的生物學(xué)過(guò)程。在生物學(xué)過(guò)程方面，發(fā)現(xiàn)許多基因參與了激素分泌調(diào)節(jié)、神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖與分化等過(guò)程。與激素分泌調(diào)節(jié)相關(guān)的基因，如促性腺激素釋放激素（GnRH）基因，其表達(dá)差異可能影響垂體中促性腺激素的分泌，進(jìn)而影響雞的生殖生理，參與就巢行為的調(diào)控。神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因的差異表達(dá)，如神經(jīng)遞質(zhì)受體基因，可能改變神經(jīng)信號(hào)在神經(jīng)系統(tǒng)中的傳遞，影響雞的行為和生理狀態(tài)，與就巢行為的發(fā)生和維持密切相關(guān)。在分子功能方面，差異表達(dá)基因涉及到蛋白質(zhì)結(jié)合、酶活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能。具有蛋白質(zhì)結(jié)合功能的基因，可能通過(guò)與其他蛋白質(zhì)相互作用，參與信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，影響雞就巢行為相關(guān)的生理過(guò)程。酶活性相關(guān)基因的表達(dá)變化，可能影響細(xì)胞內(nèi)的代謝反應(yīng)，進(jìn)而影響雞的生殖生理和行為。在細(xì)胞組成方面，這些基因分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞骨架等不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，表明它們?cè)诩?xì)胞的不同部位發(fā)揮作用，共同參與雞就巢行為的調(diào)控。通過(guò)KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因顯著富集在多條信號(hào)通路中，如催乳素信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路等。在催乳素信號(hào)通路中，多個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)差異明顯，進(jìn)一步證實(shí)了催乳素在雞就巢行為中的核心調(diào)控作用。這些基因的變化可能影響催乳素與其受體的結(jié)合，以及下游信號(hào)分子的激活，從而調(diào)節(jié)雞的就巢行為。在GnRH信號(hào)通路中，相關(guān)基因的差異表達(dá)可能影響GnRH的分泌和作用，進(jìn)而影響垂體促性腺激素的釋放，對(duì)雞的生殖生理和就巢行為產(chǎn)生影響。這些生物信息學(xué)分析結(jié)果，為深入理解雞就巢行為的分子機(jī)制提供了重要線索，有助于揭示差異表達(dá)基因在就巢行為中的具體功能和作用方式。4.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證SSH技術(shù)篩選出的差異表達(dá)基因的可靠性，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)，對(duì)部分差異表達(dá)基因在就巢和非就巢雞垂體組織中的表達(dá)差異進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)差異表達(dá)基因的序列信息，設(shè)計(jì)并合成特異性引物，以確保能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增目的基因。選擇GAPDH基因作為內(nèi)參基因，用于校正和標(biāo)準(zhǔn)化目的基因的表達(dá)水平，以消除不同樣本之間在RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增等過(guò)程中可能存在的差異。對(duì)就巢組和非就巢組的雞垂體組織進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，大多數(shù)在SSH文庫(kù)中篩選出的差異表達(dá)基因在RT-qPCR驗(yàn)證中表現(xiàn)出與SSH結(jié)果一致的表達(dá)趨勢(shì)。CNNN16基因在就巢狀態(tài)下家雞的垂體中表現(xiàn)為下調(diào)作用，其在就巢組中的表達(dá)量顯著低于非就巢組（P<0.05）；CNNN35和CNNN45基因表現(xiàn)為上調(diào)作用，在就巢組中的表達(dá)量明顯高于非就巢組（P<0.05）。這些結(jié)果與SSH技術(shù)篩選出的差異表達(dá)基因的表達(dá)模式相符，進(jìn)一步證實(shí)了SSH技術(shù)篩選結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。通過(guò)對(duì)不同基因表達(dá)量的定量分析，還可以更直觀地了解這些基因在就巢行為中的作用程度。表達(dá)量變化較大的基因，可能在就巢行為的調(diào)控中發(fā)揮著更為關(guān)鍵的作用，為后續(xù)深入研究這些基因的功能和作用機(jī)制提供了重要依據(jù)。RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果不僅驗(yàn)證了SSH技術(shù)篩選出的差異表達(dá)基因的可靠性，還為進(jìn)一步研究雞就巢行為的分子機(jī)制提供了定量的數(shù)據(jù)支持，有助于深入揭示基因表達(dá)與就巢行為之間的內(nèi)在聯(lián)系。4.3與雞就巢行為相關(guān)的關(guān)鍵基因分析4.3.1關(guān)鍵基因的確定通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究，結(jié)合前期對(duì)差異表達(dá)基因的篩選與鑒定結(jié)果，以及生物信息學(xué)分析，確定了多個(gè)與雞就巢行為密切相關(guān)的關(guān)鍵基因。催乳素（PRL）基因作為禽類就巢發(fā)生和維持的關(guān)鍵基因，在本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)。就巢組雞垂體組織中PRL基因的表達(dá)水平明顯高于非就巢組，這與以往的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了PRL基因在雞就巢行為中的核心地位。多巴胺受體基因（DRD）也是關(guān)鍵基因之一。多巴胺作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在調(diào)節(jié)動(dòng)物行為和內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DRD基因在就巢雞和非就巢雞中的表達(dá)存在差異，提示多巴胺信號(hào)通路可能參與了雞就巢行為的調(diào)控。促性腺激素釋放激素（GnRH）基因同樣被確定為關(guān)鍵基因。GnRH對(duì)垂體促性腺激素的分泌具有重要調(diào)節(jié)作用，而促性腺激素與雞的生殖生理密切相關(guān)。在就巢行為中，GnRH基因表達(dá)的變化可能通過(guò)影響促性腺激素的分泌，進(jìn)而影響雞的生殖狀態(tài)和就巢行為。還有一些新發(fā)現(xiàn)的基因，如CNNN45基因，在本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出與雞就巢行為的相關(guān)性。該基因經(jīng)電子延伸、擴(kuò)增測(cè)序驗(yàn)證以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究，發(fā)現(xiàn)在就巢狀態(tài)下的垂體中表現(xiàn)為上調(diào)，明顯高于在不就巢狀態(tài)下的表達(dá)量（P<0.05）。雖然目前對(duì)其功能的了解還相對(duì)較少，但初步認(rèn)為它可能在雞就巢行為中發(fā)揮著重要作用，具體功能有待進(jìn)一步深入研究。這些關(guān)鍵基因的確定，為深入探究雞就巢行為的分子機(jī)制提供了重要的研究對(duì)象。4.3.2關(guān)鍵基因的功能與作用機(jī)制探討催乳素（PRL）基因在雞就巢行為中起著核心的調(diào)控作用。PRL是由垂體前葉嗜酸細(xì)胞分泌的多肽類激素，其主要功能是抑制卵泡發(fā)育，從而引起、調(diào)節(jié)和維持家禽的就巢行為。當(dāng)家禽體內(nèi)PRL含量升高后，家禽就開始出現(xiàn)就巢表現(xiàn)。在雞就巢期間，巢窩或窩內(nèi)蛋對(duì)母雞腹部的觸感刺激其分泌大量的PRL，高水平的PRL使越來(lái)越強(qiáng)的進(jìn)巢產(chǎn)蛋行為固定為抱窩，成為抱窩維持和發(fā)展的關(guān)鍵因素。PRL對(duì)禽類就巢的影響機(jī)制主要在于其對(duì)卵泡發(fā)育的抑制作用。當(dāng)家禽出現(xiàn)就巢時(shí)，其血液中PRL的濃度升高，而伴隨的是卵泡發(fā)育的停止和萎縮。在哺乳動(dòng)物中，催乳素有促進(jìn)乳汁分泌和維持黃體功能的作用，而在禽類中PRL則起抗性腺的作用。PRL分泌神經(jīng)元主要分布在垂體前葉，其分泌具有一定的日節(jié)律，天亮（開燈）之前出現(xiàn)一峰值，而在天黑（關(guān)燈）之前出現(xiàn)一谷值，光照的增強(qiáng)或持續(xù)也可引起外周PRL濃度的升高。PRL本身可能通過(guò)短反饋機(jī)制作用于下丘腦，而通過(guò)自分泌或（和）旁分泌作用于垂體，參與母雞就巢的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控。多巴胺受體基因（DRD）所編碼的多巴胺受體，在雞就巢行為的神經(jīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。多巴胺作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛參與動(dòng)物的行為調(diào)節(jié)、情緒反應(yīng)以及內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控。在雞就巢行為中，多巴胺信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)，影響雞的行為和生理狀態(tài)。當(dāng)多巴胺與其受體結(jié)合后，會(huì)激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。在就巢雞中，DRD基因表達(dá)的變化可能導(dǎo)致多巴胺信號(hào)通路的異常激活或抑制，從而影響雞的就巢行為。多巴胺可能通過(guò)調(diào)節(jié)垂體激素的分泌，間接影響雞的生殖生理和就巢行為。高水平的多巴胺可能抑制PRL的分泌，從而減少就巢行為的發(fā)生；反之，低水平的多巴胺可能促進(jìn)PRL的分泌，進(jìn)而誘導(dǎo)就巢行為。促性腺激素釋放激素（GnRH）基因在雞就巢行為的生殖內(nèi)分泌調(diào)控中扮演著關(guān)鍵角色。GnRH是由下丘腦分泌的一種十肽激素，其主要功能是刺激垂體前葉分泌促性腺激素，包括促卵泡激素（FSH）和促黃體生成素（LH）。FSH和LH對(duì)卵泡的發(fā)育和排卵起著重要的調(diào)節(jié)作用，直接影響雞的生殖生理。在就巢行為中，GnRH基因表達(dá)的變化會(huì)導(dǎo)致GnRH分泌量的改變，進(jìn)而影響垂體促性腺激素的分泌。當(dāng)GnRH分泌減少時(shí)，垂體分泌的FSH和LH也會(huì)相應(yīng)減少，導(dǎo)致卵泡發(fā)育受阻，排卵停止，從而引發(fā)就巢行為。高水平的PRL會(huì)抑制下丘腦GnRH的分泌，使LH的合成減少，最終導(dǎo)致就巢行為的發(fā)生。這表明GnRH基因與PRL基因之間存在著密切的相互作用，共同調(diào)控雞的就巢行為。對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的基因，如CNNN45基因，雖然目前對(duì)其功能和作用機(jī)制的了解還相對(duì)有限，但已有研究提供了一些線索。預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白具有轉(zhuǎn)座酶類似的功能，轉(zhuǎn)座酶能夠催化轉(zhuǎn)座子在基因組中的移動(dòng)，可能導(dǎo)致基因的插入、缺失或重排，從而影響基因的表達(dá)和功能。在雞就巢行為中，CNNN45基因在就巢狀態(tài)下的垂體中表現(xiàn)為上調(diào)，明顯高于在不就巢狀態(tài)下的表達(dá)量（P<0.05）。推測(cè)其可能通過(guò)影響其他與就巢行為相關(guān)基因的表達(dá)，或者參與某些未知的信號(hào)通路，來(lái)調(diào)控雞的就巢行為。由于該基因在下丘腦和垂體中的表達(dá)存在差異，提示其可能在不同組織中發(fā)揮不同的作用，通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦-垂體軸的功能，參與雞就巢行為的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控。五、雞就巢行為相關(guān)基因的功能驗(yàn)證與作用機(jī)制探究5.1基因功能驗(yàn)證方法5.1.1RNA干擾技術(shù)RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是一種由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默現(xiàn)象，能夠精準(zhǔn)地沉默目標(biāo)基因的表達(dá)。在雞就巢行為相關(guān)基因的功能驗(yàn)證中，RNAi技術(shù)發(fā)揮著重要作用。其作用機(jī)制是dsRNA被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生干擾小RNA（siRNA），這些siRNA與同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合，特異性酶降解靶RNA，從而抑制、下調(diào)基因表達(dá)。在利用RNAi技術(shù)驗(yàn)證雞就巢行為相關(guān)基因功能時(shí)，首先需要設(shè)計(jì)并合成與目標(biāo)基因相對(duì)應(yīng)的siRNA。以催乳素（PRL）基因?yàn)槔鶕?jù)PRL基因的序列信息，設(shè)計(jì)出能夠特異性靶向PRL基因的siRNA序列。利用化學(xué)合成的方法制備siRNA，確保其序列的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。將合成的siRNA轉(zhuǎn)染到雞的垂體細(xì)胞中，垂體是PRL分泌的關(guān)鍵部位，通過(guò)轉(zhuǎn)染垂體細(xì)胞，可以直接觀察PRL基因沉默后對(duì)細(xì)胞功能和激素分泌的影響。轉(zhuǎn)染時(shí)，可采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將siRNA與脂質(zhì)體混合，形成脂質(zhì)體-siRNA復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到培養(yǎng)的垂體細(xì)胞中。脂質(zhì)體能夠幫助siRNA順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)PRL基因的mRNA表達(dá)水平，以驗(yàn)證siRNA對(duì)PRL基因的沉默效果。如果PRL基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明siRNA成功地抑制了PRL基因的轉(zhuǎn)錄。還需要通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中PRL的分泌量。若PRL分泌量明顯減少，進(jìn)一步證實(shí)了PRL基因的功能被抑制。觀察細(xì)胞和雞個(gè)體的生理變化。在細(xì)胞水平上，觀察垂體細(xì)胞的形態(tài)、增殖和凋亡情況，以及與PRL相關(guān)的信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化。在個(gè)體水平上，將轉(zhuǎn)染了siRNA的垂體細(xì)胞移植到實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)，或者直接將siRNA通過(guò)注射等方式導(dǎo)入雞體內(nèi)，觀察雞的就巢行為是否發(fā)生改變。如果雞的就巢行為減少或消失，如抱窩時(shí)間縮短、體溫恢復(fù)正常、產(chǎn)蛋恢復(fù)等，說(shuō)明PRL基因在雞就巢行為中起著關(guān)鍵作用，其表達(dá)的抑制能夠有效調(diào)控就巢行為。5.1.2基因過(guò)表達(dá)技術(shù)基因過(guò)表達(dá)技術(shù)是研究基因功能的重要手段之一，通過(guò)提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平，觀察其對(duì)生物個(gè)體生理功能和表型的影響，從而深入了解基因的作用機(jī)制。在探究雞就巢行為相關(guān)基因的功能時(shí)，基因過(guò)表達(dá)技術(shù)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。以促性腺激素釋放激素（GnRH）基因?yàn)槔U述基因過(guò)表達(dá)技術(shù)的具體應(yīng)用。首先，構(gòu)建GnRH基因的過(guò)表達(dá)載體。從雞的基因組DNA中擴(kuò)增出GnRH基因的編碼序列，利用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，將GnRH基因片段插入到合適的表達(dá)載體中，如pEGFP-N1載體。該載體含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因，便于后續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選和觀察。連接后的重組載體通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，提取并純化重組質(zhì)粒，確保其質(zhì)量和濃度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到雞的垂體細(xì)胞中。采用電穿孔法或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入垂體細(xì)胞。電穿孔法利用高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成小孔，使質(zhì)粒DNA能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法則是利用脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合特性，將質(zhì)粒DNA包裹并帶入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，在含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，篩選出成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。通過(guò)熒光顯微鏡觀察，能夠發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞即為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，表明GnRH基因已成功導(dǎo)入細(xì)胞并開始表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)染后的垂體細(xì)胞進(jìn)行功能檢測(cè)。利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)GnRH基因的mRNA表達(dá)水平，與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組的GnRH基因mRNA表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明過(guò)表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)正常發(fā)揮作用，有效提高了GnRH基因的轉(zhuǎn)錄水平。通過(guò)ELISA等方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中GnRH的分泌量，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組的GnRH分泌量明顯增加，進(jìn)一步驗(yàn)證了基因過(guò)表達(dá)的效果。將轉(zhuǎn)染了GnRH基因過(guò)表達(dá)載體的垂體細(xì)胞移植到實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)，或者直接將過(guò)表達(dá)載體通過(guò)注射等方式導(dǎo)入雞體內(nèi)，觀察雞的繁殖性能和就巢行為的變化。若雞的產(chǎn)蛋量增加，就巢行為減少，如抱窩時(shí)間縮短、就巢發(fā)生率降低等，說(shuō)明GnRH基因在調(diào)節(jié)雞的繁殖性能和就巢行為中發(fā)揮著重要作用。GnRH基因的過(guò)表達(dá)可能通過(guò)刺激垂體分泌促性腺激素，促進(jìn)卵泡發(fā)育和排卵，從而提高產(chǎn)蛋性能，同時(shí)抑制就巢行為的發(fā)生。5.2基因作用機(jī)制研究5.2.1基因與激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系雞就巢行為相關(guān)基因與激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)緊密相連，共同維持著雞的繁殖生理平衡。催乳素（PRL）基因在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位，其表達(dá)產(chǎn)物PR