玄參藥材HPLC指紋圖譜研究[摘要]目的：建立30批不同產(chǎn)地玄參藥材的HPLC指紋圖譜，為玄參藥材等級(jí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供方法和依據(jù)。方法：采用HPLC-DAD法，ElipseXDB-C18(250mmx4.6mm,5μm)色譜柱，柱溫25℃，以乙腈（A）-0.03%磷酸水（B）為流動(dòng)相，流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)207nm。建立玄參HPLC指紋圖譜，并對(duì)不同產(chǎn)地進(jìn)行相似度比較及非共有峰占比。結(jié)果：采用“中位數(shù)”法進(jìn)行峰匹配之后，生成對(duì)照譜圖，得出七個(gè)共有峰。不同地方各等級(jí)藥材與對(duì)照藥材的相似度，多數(shù)地方藥材一等的相似度要偏高，二等三等相對(duì)偏低，各個(gè)道地藥材之間不同批次相似度差異大，從而體現(xiàn)了化學(xué)成分差異大。結(jié)論：該方法分離效果好，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，同時(shí)采用相似度法與非共有峰占比相結(jié)合可綜合分析玄參藥材質(zhì)量及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為控制玄參內(nèi)在質(zhì)量提供參考。[關(guān)鍵詞]玄參；HPLC-DAD；指紋圖譜；相似度；等級(jí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；《中國(guó)藥典》收載的玄參來(lái)源為玄參科的干燥根[1]。多年生高大草本；根粗大；莖四菱形，有腺毛；葉對(duì)生，脈明顯網(wǎng)結(jié)；\t"/item/%E7%8E%84%E5%8F%82%E7%A7%91/_blank"聚傘花序疏散開(kāi)展呈圓錐狀，花梗細(xì)長(zhǎng)，有腺毛；萼裂片頂端鈍圓；花小，暗紫色，花冠筒近球形，退化雄蕊大而近于圓形；蒴果卵圓形，端有喙。根供藥用，為傳統(tǒng)的中藥材,具有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)等功能?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究，玄參有輕度的強(qiáng)心作用；對(duì)促進(jìn)局部血液循環(huán)從而消除炎癥有一定作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)有降低血壓作用；對(duì)腎型高血壓降低作用更明顯。此外，玄參還具有在體外中和白喉毒素的作用作為一味常用中藥。由于其具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)適應(yīng)性,在全國(guó)多個(gè)地區(qū)均有栽培，如浙江、四川、等,帶來(lái)的問(wèn)題是藥材種質(zhì)不清、質(zhì)量不一,藥材質(zhì)量的可追溯性差等,使得“質(zhì)”和“量”均無(wú)法保證。市場(chǎng)上玄參藥材一般為統(tǒng)貨，不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量參差不齊?，F(xiàn)有的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)1984年部頒布《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》綜合分析玄參藥材質(zhì)量及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為控制玄參內(nèi)在質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[2]。1儀器與材料1.1儀器Agilent1260高效液相色譜儀(二級(jí)管陣列檢測(cè)器)，OpenLABCDS色譜工作站（美國(guó)安捷倫公司），YP1001N型電子分析天平（上海青海儀器有限公司）；SB-25-12DT超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），202型電熱恒溫干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）1.2試劑哈巴苷（批號(hào)B20481）、哈巴俄苷（批號(hào)B20480）、肉桂酸（批號(hào)B21082）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸為分析純，水為怡寶市售水。1.3不同地方玄參藥材的收集藥材的具體信息見(jiàn)表1。2016年至2017年期間共收集玄參藥材30批次，將各批次玄參藥材按照“七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行初步的等級(jí)劃分為一等品、二等品、三等品。表1收集的玄參藥材的具體信息編號(hào)產(chǎn)地收集時(shí)間編號(hào)產(chǎn)地收集時(shí)間S1浙江磐安-12016-12S16湖北來(lái)鳳2016-12S2浙江磐安-22017-12S17貴州六盤(pán)水2016-12S3浙江磐安-32016-06S18四川雅安2016-12S4浙江磐安-42017-09S19四川綿陽(yáng)三臺(tái)2017-04S5湖南龍山-12016-12S20湖北蘄春市場(chǎng)2017-12S6湖南龍山-22016-12S21湖南廉橋市場(chǎng)2017-12S7湖北恩施2016-12S22河南南陽(yáng)-12017-12S8湖南邵東2016-12S23河南南陽(yáng)-22016-12S9湖南新邵-12016-12S24浙江磐安仁川2017-12S10湖南新邵-22016-12S25浙江磐安盤(pán)峰2017-12S11四川北川2016-12S26湖南新邵-32017-12S12安徽亳州-12016-12S27湖南龍溪鋪2017-12S13安徽亳州-22016-12S28湖南新邵-42017-12S14安徽亳州-32017-09S29湖南邵東-22017-12S15安徽亳州-42017-12S30云南大理2017-122.方法與結(jié)果2.1不同產(chǎn)地玄參的性狀分析及等級(jí)的劃分結(jié)果6~20cm，直徑1~3cm。表面灰黃色或灰褐色，有不規(guī)則的縱溝、橫長(zhǎng)皮孔樣突起及稀疏的橫裂紋和凹點(diǎn)狀須根痕。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，不易折斷，斷面黑色，微有光澤。氣特異似焦糖，味甘，微苦。以水浸泡，水呈墨黑色。藥材性狀：本品呈圓錐形，中間略粗或上粗下細(xì)，有的微彎似羊角狀，長(zhǎng)84年部頒布《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》【國(guó)藥聯(lián)材字（84）第72號(hào)文附件】對(duì)玄參藥材進(jìn)行初步等級(jí)劃分，標(biāo)準(zhǔn)如下：一等干貨。呈類紡錘形或長(zhǎng)條形。表面灰褐色，有縱紋及抽溝。質(zhì)堅(jiān)韌。斷面黑褐色或黃褐色。味甘、微苦成。每1000g36支以內(nèi)，支頭均勻。無(wú)蘆頭、空泡、雜質(zhì)、蟲(chóng)蛀、霉變。二等干貨。呈類紡錘形或長(zhǎng)條形。表面灰褐色，有縱紋及抽溝。質(zhì)堅(jiān)韌。斷面黑褐色或黃褐色。味甘、微苦成。每1000g72支以內(nèi)，支頭均勻。無(wú)蘆頭、空泡、雜質(zhì)、蟲(chóng)蛀、霉變。三等干貨。呈類紡錘形或長(zhǎng)條形。表面灰褐色，有縱紋及抽溝。質(zhì)堅(jiān)韌。斷面黑褐色或黃褐色。味甘、微苦咸。每1000g72支以外，個(gè)體最小在5g以上。間有破塊。無(wú)蘆頭、雜質(zhì)、蟲(chóng)蛀、霉變。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，將收集的所有批次玄參藥材分為一等、二等、三等，部分分級(jí)結(jié)果如圖1所示，藥材的長(zhǎng)度、斷面直徑等信息見(jiàn)表2。從中可以看出，根據(jù)傳統(tǒng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，藥材的重量、長(zhǎng)度及斷面直徑的大小均服從一等品優(yōu)于二等品、二等品優(yōu)于三等品的規(guī)律。四川三臺(tái)四川三臺(tái)安徽亳州安徽亳州磐安一號(hào)磐安一號(hào)磐安二號(hào)磐安二號(hào)安徽安徽湖北湖北云南大理云南大理圖1不同批次不同等級(jí)玄參藥材的性狀、長(zhǎng)度及斷面直徑圖（標(biāo)尺長(zhǎng)14cm）表2不同批次不同等級(jí)玄參藥材的長(zhǎng)度及斷面直徑（n=3，x±s）產(chǎn)地信息等級(jí)長(zhǎng)度（cm）直徑（cm）四川三臺(tái)縣一等二等三等16±1.213±0.85±0.62.2±0.22.0±0.31.5±0.3亳州一等二等三等20±0.816±1.112±0.52.0±0.31.5±0.31.5±0.2磐安一號(hào)一等二等三等10±0.79±0.97±0.42.8±0.32.2±0.41.8±0.1磐安二號(hào)一等二等三等16±0.615±0.410±0.72.0±0.21.8±0.31.5±0.2安徽一等二等三等15±0.610±0.58±0.52.0±0.31.8±0.31.5±0.2河南二等三等12±0.711±0.51.6±0.40.9±0.2湖北一等二等三等13±0.212±0.410±0.52.5±0.52.0±0.31.5±0.3云南大理一等二等三等12±0.410±0.46±0.22.8±0.31.8±0.21.5±0.32.2供試品溶液的制備分別考察了30%甲醇、50%甲醇和80%甲醇三種超聲提取方法，結(jié)果顯示50%甲醇提取液中，色譜峰數(shù)量最多，且哈巴苷與哈巴俄苷的色譜峰信號(hào)最強(qiáng)，故特征圖譜實(shí)驗(yàn)沿用藥典中哈巴苷和哈巴俄苷含量測(cè)定中的樣品提取方法[3]。具體操作為：取不同批次、不同等級(jí)的玄參藥材，打粉，過(guò)3號(hào)篩，精密稱定玄參粉末約1.0g于具塞錐形瓶，加50%甲醇50mL，浸泡1h，超聲45min，精密稱重，用50%甲醇補(bǔ)足損失重量，搖勻，過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜即得。2.3色譜條件的確定2.3.1流動(dòng)相洗脫梯度的優(yōu)化首先以乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）為流動(dòng)相，采用線性梯度洗脫（A：0min，5%；50min，70%），結(jié)果如圖2所示。采用手動(dòng)積分方法，將最小峰面積設(shè)為100，共積分出29個(gè)色譜峰，且25min之后采集的信號(hào)較少，說(shuō)明提取液中極性小的成分較少，考慮將圖2中前25min的洗脫時(shí)間條件延長(zhǎng)時(shí)間，故色譜條件設(shè)為梯度洗脫，以乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）為流動(dòng)（A：0min，5%；25min，35%；35min，70%；40min，5%），結(jié)果見(jiàn)圖3，共積分38個(gè)色譜峰，除了3min前有3個(gè)明顯的溶劑峰外，其余色譜峰基本能達(dá)到基線分離，且峰型好，說(shuō)明該梯度洗脫條件較佳。圖2浙江一等玄參樣品在207nm波長(zhǎng)下的特征圖譜（線性梯度）圖3浙江一等玄參樣品在207nm波長(zhǎng)下的特征圖譜（非線性梯度）2.3.2.測(cè)定波長(zhǎng)的選擇采用DAD檢測(cè)器，同時(shí)獲取8種不同波長(zhǎng)下玄參的特征圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于其他波長(zhǎng)，207nm下玄參藥材的特征圖譜峰數(shù)量最多，且鋒形較佳，故采用選擇207nm作為獲取特征圖譜的測(cè)定波長(zhǎng)[4]。綜上，色譜條件確定為：C18(250mmx4.6mm,5μm)色譜柱，柱溫為室溫，以乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（A：0min，5%；25min，35%；35min，70%；40min，5%），流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為207nm。理論塔板數(shù)按哈巴俄苷峰計(jì)應(yīng)不低于5000。2.3.3方法學(xué)考察（1）精密度實(shí)驗(yàn)取浙江磐安（批號(hào)S1）的玄參供試液1份，照“色譜條件”下方法連續(xù)進(jìn)樣5次獲取特征圖譜[5]，采用“中藥色譜特征圖譜相似度分析”軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示5次分析獲得的特征圖譜相似度達(dá)到0.9995，特征圖譜見(jiàn)圖5，主要色譜峰的保留時(shí)間RSD值小于2.0%，而主要色譜峰峰面積RSD值在3.0%左右，具體信息見(jiàn)表3。說(shuō)明該方法精密度較好。表3玄參方法學(xué)考察精密度實(shí)驗(yàn)（n=5）1號(hào)峰2號(hào)峰3號(hào)峰4號(hào)峰5號(hào)峰6號(hào)峰樣品tAtAtAtAtAtA15.5516856.91163318.03118520.14204824.63318528.6792725.6017696.97167017.73120719.78213224.83323128.84101735.5917226.94176217.61117919.74209824.37325928.39101445.6117496.93173517.25116519.31214424.01332828.17101655.5717536.86172717.16110919.19207423.94312228.07994RSD%0.431.890.593.082.033.151.951.901.5802.401.1461.40圖4精密度實(shí)驗(yàn)特征圖譜（2）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取浙江磐安（批號(hào)S1）的玄參5份，照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備待測(cè)液，照“色譜條件”下方法獲取特征圖譜，采用“中藥色譜特征圖譜相似度分析”軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示5份玄參樣品的相似度達(dá)到0.9591，特征圖譜見(jiàn)圖5，主要色譜峰的保留時(shí)間均小于2.0%，主要色譜峰峰面積RSD值在4.0%以內(nèi)，具體信息見(jiàn)表4。說(shuō)明該方法重復(fù)性較好。表4玄參方法學(xué)考察重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（n=5）1號(hào)峰2號(hào)峰3號(hào)峰4號(hào)峰5號(hào)峰6號(hào)峰樣品tAtAtAtAtAtA15.74217266.818185216.76121318.88217523.76332627.94102225.68618396.922181317.19123219.19220224.09345728.14102335.56317036.872195217.17117919.36222223.91331428.07100645.68416716.959191117.32117919.26211723.97322628.2498255.70816816.956189117.39115019.33209723.90317128.22959RSD%1.193.920.872.841.432.681.012.490.493.310.432.76圖5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)特征圖譜（3）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取浙江磐安（批號(hào)S1）的玄參供試液1份，照“色譜條件”下方法進(jìn)行日間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和日內(nèi)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，日間分別在0h、2h、4h、6h、8h、12h獲取特征圖譜，日內(nèi)分別于第1、2、3、4、5天獲取特征圖譜，采用“中藥色譜特征圖譜相似度分析”軟件進(jìn)行分析。日內(nèi)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示12h內(nèi)玄參特征圖譜的相似度達(dá)到0.989，特征圖譜見(jiàn)圖6；主要色譜峰的保留時(shí)間RSD值均小于2.0%，主要色譜峰峰面積的RSD值均低于4.0%，具體信息見(jiàn)表5，說(shuō)明該方法12h以內(nèi)基本穩(wěn)定。日間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5d內(nèi)玄參特征圖譜的相似度達(dá)到0.993，特征圖譜見(jiàn)圖7；主要色譜峰的保留時(shí)間RSD值均小于2.0%，主要色譜峰峰面積RSD值與日內(nèi)穩(wěn)定性相比呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，3號(hào)峰的RSD值最大，達(dá)到5.48%，具體信息見(jiàn)表6，說(shuō)明該方法5日內(nèi)穩(wěn)定性稍有下降。表5玄參方法學(xué)考察穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（n=6）日內(nèi)穩(wěn)定性1號(hào)峰2號(hào)峰3號(hào)峰4號(hào)峰5號(hào)峰6號(hào)峰時(shí)間（h）tAtAtAtAtAtA05.6816517.099148718.37106220.58204825.36315229.2091925.6016337.025141218.35105320.59201325.41313929.2091745.6115947.026139518.29104220.51200325.29310629.1390365.6115827.02138618.27103520.50198625.28309329.1290085.6117307.019148818.26108720.49208525.27326029.11947125.617177.016148218.25108520.47208325.25325729.10945RSD%0.553.70.453.390.262.040.242.080.242.310.162.19圖6日間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)特征圖譜表6玄參方法學(xué)考察日間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（n=6）日間穩(wěn)定性1號(hào)峰2號(hào)峰3號(hào)峰4號(hào)峰5號(hào)峰6號(hào)峰時(shí)間（d）tAtAtAtAtAtA15.5117296.92151518.17106020.39205025.17320429.0196025.4816506.90142918.1599520.38192425.16299428.9989835.6218267.01152917.61115419.77211424.41334028.4593345.5717786.99149218.24105420.47201025.27327229.1097955.6216927.02147618.27103820.51195225.29324