高效液相色譜是一種高效的分離和分析技術(shù)，它能夠?qū)⒏鞣N樣品中各個(gè)不

同的組分迅速分離，然后逐一加以定性和定量分析。

一、高效液相色譜分離原理

色譜法是利用物質(zhì)在兩相中吸附或分配系數(shù)的微小差異達(dá)到分離的目的。

色譜過(guò)程中不同組分在相對(duì)運(yùn)動(dòng)、不相混溶的兩相間交換，其中相對(duì)靜止的一

相為固定相，相對(duì)運(yùn)動(dòng)的相為流動(dòng)相。

不同組分在兩相間的吸附、分配、離子交換、親和力或分子尺寸等性質(zhì)存

在微小差別，經(jīng)過(guò)連續(xù)多次在兩相間的質(zhì)量交換，這種性質(zhì)微小差別是色譜分

離的根本，即必要條件；性質(zhì)上微小差別的組分之所以能得以分離是因?yàn)樗鼈?/p>

在兩相之間進(jìn)行了上千次甚至上百萬(wàn)次的質(zhì)量交換，這是色譜分離的充分條件。

二、高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)(以HP1100高效液相色譜儀為例)

包括四元泵、進(jìn)樣器、柱溫箱和檢測(cè)器等幾部分。

?HPLC的日常操作條件：

⑴溫度：1()—30℃；

⑵相對(duì)濕度:<80%；

⑶最好是恒溫、恒濕，遠(yuǎn)離高電干擾、高振動(dòng)設(shè)備。

1.由于高效液相色譜柱填料顆粒較小，通過(guò)柱子的流動(dòng)相受到的流動(dòng)阻力較大，

因此需要用高壓泵向柱子提供流量穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的流動(dòng)相。在HP1100高效液

相色譜儀中使用的是四元泵。

⑴四元泵包括一個(gè)溶劑柜、一個(gè)真空脫氣器和一個(gè)四通道的梯度泵。

a.溶劑柜內(nèi)可放4個(gè)1L的溶劑瓶，用于存儲(chǔ)足夠量的、符合高效液相要求的流

動(dòng)相。

b.真空脫氣器對(duì)進(jìn)入四元泵前的流動(dòng)相進(jìn)行脫氣，否則流動(dòng)相流經(jīng)柱子到檢測(cè)器

時(shí)，會(huì)因有氣泡而造成基線不穩(wěn)，檢測(cè)器噪聲增大等現(xiàn)象，使儀器不能正常工

作。

C.四通道的梯度泵包括一個(gè)高速配置閥和一個(gè)泵部件，溶劑混合是通過(guò)高速配置

閥在低壓區(qū)產(chǎn)生的。

⑵四元泵是一個(gè)雙通道、雙活塞串聯(lián)的設(shè)計(jì)，這種設(shè)計(jì)能滿足泵輸送溶劑的全

部功能。通過(guò)一個(gè)可產(chǎn)生高至4（）0bar壓力的泵部件，對(duì)溶劑進(jìn)行測(cè)量并將溶劑

傳輸至高壓位置。

⑶泵部件包括泵頭、一個(gè)阻尼器和一個(gè)沖洗閥。泵頭帶有一個(gè)含可替換濾芯的

入口主動(dòng)閥和一個(gè)出口閥；阻尼器連接兩個(gè)泵腔；沖洗閥裝在泵的出口處，帶

有PTFE濾芯。

*四元泵常見(jiàn)故障的維修

⑴泵的狀態(tài)指示燈

a.當(dāng)狀態(tài)指示燈為OFF（且電源指示燈亮?xí)r），四元泵處于一個(gè)預(yù)運(yùn)行狀態(tài)，做

好開(kāi)始分析的準(zhǔn)備。

b.狀態(tài)指示燈為綠色時(shí)，說(shuō)明四元泵正在進(jìn)行分析（運(yùn)行模式）。

c.狀態(tài)指示燈為黃色時(shí)，說(shuō)明泵處于未就緒狀態(tài)。當(dāng)四元泵等待達(dá)到或完成一個(gè)

特殊條件（如：在改變一個(gè)選點(diǎn)的瞬間）或正在運(yùn)行自檢程序時(shí)，處于未就緒

狀態(tài)。

d.當(dāng)狀態(tài)指示燈為紅色時(shí)，說(shuō)明泵處于故障狀態(tài)。一個(gè)故障狀態(tài)說(shuō)明四元泵已經(jīng)

檢測(cè)到一個(gè)內(nèi)部故障，該故障影響了四元泵的正確操作。通常，故障狀態(tài)應(yīng)引

起重視（如：泄漏、內(nèi)部元件損壞）。故障狀態(tài)總是會(huì)使分析中斷。

e.狀態(tài)指示燈為黃燈閃爍時(shí)，說(shuō)明儀器處于駐留模式。在此情況下即需維修。

￡?duì)顟B(tài)指示燈為紅燈閃爍時(shí)，說(shuō)明泵在啟動(dòng)時(shí)有嚴(yán)重故障。需及時(shí)維修。

⑵故障信息

當(dāng)出現(xiàn)電路、機(jī)械和液壓（流路）故障時(shí)，在用戶(hù)界面上就會(huì)出現(xiàn)故障信

息，在用戶(hù)繼續(xù)進(jìn)行分析前應(yīng)引起必要注意（如：修理、更換濾芯或更換必要

的消耗品）。出現(xiàn)此類(lèi)故障時(shí)，四元泵前面板上的紅色狀態(tài)指示燈亮起，并在儀

器的日志上寫(xiě)下一條記錄。

⑶泄漏

從兩個(gè)溫度傳感器發(fā)出的信號(hào)（泄漏傳感器和面板式溫度補(bǔ)償傳感器）被

泄漏算法用來(lái)確認(rèn)泄漏是否發(fā)生。當(dāng)出現(xiàn)一個(gè)泄漏時(shí)，泄漏傳感器將被溶劑冷

卻。這將改變泄漏傳感器的電阻，該信號(hào)被LPM板上的泄漏傳感器電路獲得。

*可能的原因（解決辦法）

a.接頭松動(dòng)；（擰緊）

b.毛細(xì)管破裂：（更換）

c.沖洗閥、入口主動(dòng)閥或出口球閥松動(dòng)或泄漏；（確保泵體各構(gòu)件位置正確。若

仍泄漏，更換適當(dāng)?shù)拿芊馊?，如：沖洗閥、入口主動(dòng)閥、出口球閥）

d.泵密封圈損壞。（更換泵密封圈）

e.泄漏傳感器斷路或短路

通過(guò)泄漏傳感器的電流大小取決于溫度。當(dāng)出現(xiàn)泄漏時(shí)'溶劑使泄漏傳感器冷

卻，使傳感器電流在設(shè)定限度內(nèi)變化。如果電流值低于電流下限（斷路）或高

于電流上限（短路），就會(huì)產(chǎn)生故障信息。

*常見(jiàn)故障現(xiàn)象

⑴輸液不穩(wěn)，并且壓力波動(dòng)較大

b.氣泡從輸液入口進(jìn)入泵頭

c.單向閥粘連或損壞

清洗或更換單向閥。

⑶實(shí)際流速低于設(shè)定值

a.單向閥不正常

清洗或更換單向閥。

b.過(guò)濾頭有污物

清洗或更換過(guò)濾頭。

⑷壓力升不高

a.放空閥未關(guān)緊

旋緊放空閥。

b.管路漏液

1）上緊漏液處連接部件;

2）更換失效部件。

c.密封圈處漏液

清洗或更換密封圈。

⑸壓力上升過(guò)高

a.管路阻塞

找出阻塞部分并處理。

b.色譜柱阻塞

更換色譜柱。

⑹泵流速變小

a.泵內(nèi)聚集氣泡

打開(kāi)放空閥，讓泵在高流速下運(yùn)行，排除氣泡。

b.溶劑過(guò)濾器阻塞

清洗或更換。

C.柱塞密封泄漏

更換柱塞密封。

⑺開(kāi)泵后有柱壓，但沒(méi)有流動(dòng)相從檢測(cè)器中流出

a.系統(tǒng)嚴(yán)重泄漏

檢查并修理進(jìn)樣閥或泵與檢測(cè)器之間的管路和緊固件。

b.流路堵塞

清除進(jìn)樣器口、進(jìn)樣閥或柱與檢測(cè)器之間的連接毛細(xì)管或檢測(cè)池內(nèi)的污物。

梯度洗脫是采用兩種（或多種）不同極性的溶劑，在分離過(guò)程中按一定程序連

續(xù)改變流動(dòng)相的濃度配比和極性的一種洗脫模式。梯度洗脫通過(guò)流動(dòng)相極性的

變化來(lái)調(diào)整被分離樣品的選擇因子和保留時(shí)間，以使柱系統(tǒng)具有最好的選擇性

和最大的峰容量。梯度洗脫技術(shù)能夠提高分離度，縮短分析時(shí)間，降低最小檢

測(cè)量并提高分析精度。

*泵的保養(yǎng)

1）使用流動(dòng)相盡量要清潔；

2）進(jìn)液處的過(guò)濾頭要經(jīng)常清洗；

3）流動(dòng)相交換時(shí)要防止沉淀；

4）避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡。

2.進(jìn)樣系統(tǒng)是將待分析樣品引入色譜柱的裝置，實(shí)現(xiàn)這一功能又有手動(dòng)和自動(dòng)兩

種方式。即手動(dòng)進(jìn)樣器和自動(dòng)進(jìn)樣器。

?手動(dòng)進(jìn)樣器

?六通閥進(jìn)樣器是高效液相色譜系統(tǒng)中最理想的進(jìn)樣器，HP110。系列手動(dòng)

進(jìn)樣器使用美國(guó)Rheodyne公司的7725i六通進(jìn)樣閥。

*工作原理

樣品經(jīng)閥前部進(jìn)樣口打入外接于閥的20uL進(jìn)樣環(huán)。閥內(nèi)有固定片和進(jìn)樣

密封。當(dāng)閥在進(jìn)樣和充樣位置之間來(lái)回切換時(shí)，固定片上的先合后開(kāi)通路確保

流量不被中斷。

a.手柄位于進(jìn)樣(Load)位置時(shí)，泵直接和柱聯(lián)接，并且針口和進(jìn)樣環(huán)聯(lián)接。至少

2到3倍進(jìn)樣環(huán)體積的樣品經(jīng)微量進(jìn)樣針從針口注射進(jìn)定量環(huán)，定量環(huán)充滿樣品

后，過(guò)量的樣品通過(guò)和孔6聯(lián)接的排放管排出；

b.將手柄轉(zhuǎn)動(dòng)至進(jìn)樣(Inject)位置時(shí)，泵和進(jìn)樣環(huán)聯(lián)接(孔1和孔2聯(lián)接)。閥與

液相流路接通，由泵輸送的流動(dòng)相沖洗定量環(huán)，將全部樣品從環(huán)推動(dòng)進(jìn)入色譜

柱進(jìn)行分析。針口和排泄管(孔5)聯(lián)接。

*六通閥進(jìn)樣器的使用及保養(yǎng)

六通閥進(jìn)樣器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、壽命長(zhǎng)、日常無(wú)需維修等特點(diǎn)，但正

確的使用和維護(hù)將能增加使用壽命，保護(hù)周邊設(shè)備，同時(shí)增加分析準(zhǔn)確度。如

使用得當(dāng)?shù)脑?，六通閥進(jìn)樣器一般可連續(xù)進(jìn)樣3萬(wàn)次而無(wú)需維修。

手柄處于Load和Inject之間時(shí)，由于暫時(shí)堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉(zhuǎn)

到進(jìn)樣位，過(guò)高的壓力在柱頭上引起損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動(dòng)閥，不能停留在中

途。在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方

面，針頭外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另

一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。

c.紫外檢測(cè)器

UV通過(guò)測(cè)定樣品在檢測(cè)池中吸收紫外一可見(jiàn)光的強(qiáng)度來(lái)確定樣品含量，屬

于吸收光譜類(lèi)型的分析儀器。其工作原理是基于Beer定律。當(dāng)由光源產(chǎn)生的單

色光通過(guò)樣品池中的溶液時(shí)，如果溶劑不吸收光，則檢測(cè)池中被測(cè)物的濃度c

與吸收值A(chǔ)、被測(cè)物摩爾吸收系數(shù)￡和檢測(cè)池長(zhǎng)度L的關(guān)系符合Beer定律：A=

c8Lo

由于吸光度與吸光系數(shù)、溶質(zhì)濃度和光路長(zhǎng)度成正比例關(guān)系，因此對(duì)于給

定的檢測(cè)池，在固定的波長(zhǎng)下，UV的輸出信號(hào)強(qiáng)度與樣品濃度成正比。這是

UV進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)。

"僉測(cè)器（UV）的保養(yǎng)：

1）紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時(shí)，打開(kāi)檢測(cè)器；在分析完成后，

馬上關(guān)閉檢測(cè)器。

2）樣品池要保養(yǎng)。

*管路的常見(jiàn)故障及預(yù)防

阻塞是管路的主要故障。系統(tǒng)中管路阻塞的現(xiàn)象較少見(jiàn)，常見(jiàn)到是濾芯阻

塞或柱頭污染。管路完全或部分阻塞是由下列原因引起的：

1）沒(méi)有很好地過(guò)濾流動(dòng)相；

2）樣品中有顆粒；

3）流動(dòng)相中的鹽結(jié)晶；

4）微生物；

5）系統(tǒng)中進(jìn)入了其他顆粒性雜質(zhì)。

管路完全阻塞，壓力會(huì)突然升高，超壓。部分阻塞開(kāi)始時(shí)不明顯，不斷滯

留在管路中的微粒會(huì)使壓力慢慢升高，最后完全阻塞。管路阻塞同時(shí)會(huì)看到接

頭或墊圈滲漏，低壓好一些，高壓滲漏明顯。一旦發(fā)現(xiàn)壓力降低應(yīng)及時(shí)檢查滲

漏情況。壓力升高可能管路不暢，應(yīng)及時(shí)排除異物，否則會(huì)很快阻死。

維修過(guò)程中，因電路板對(duì)靜電放電（ESD）敏感。為了避免損壞儀器，在處

理電路板和電子部件時(shí)，一