ICS67.140

CCSX55

34

安徽省地方標準

DB34/T4268—2022

發(fā)酵茶中B族和G族黃曲霉毒素的測定

DeterminationofaflatoxinBandGgroupsinfermentedtea

2022-08-31發(fā)布2022-09-30實施

安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB34/T4268—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。

本文件由安徽農業(yè)大學提出。

本文件由安徽省農業(yè)農村廳歸口。

本文件起草單位：安徽農業(yè)大學、安徽省茶業(yè)集團有限公司、肥西縣農業(yè)綜合服務中心、云南微生

物研究所。

本文件主要起草人：周育、管道健、張海柱、唐蜀昆、張梁、王希春。

I

DB34/T4268—2022

發(fā)酵茶中B族和G族黃曲霉毒素的測定

1范圍

本文件規(guī)定了發(fā)酵茶中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G（以下簡稱2AFB1、

AFB2、AFG1和AFG2）的測定方法。

本文件第一法為雙柱凈化-高效液相色譜柱后光化學衍生法，適用于發(fā)酵茶中黃曲霉毒素AFB1、AFB2、

AFG1和AFG2含量的測定。

本文件第二法為雙柱凈化-液相色譜柱串聯(lián)質譜法，適用于發(fā)酵茶中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2含量的

測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB5009.22食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定

3術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4第一法雙柱凈化-高效液相色譜柱后光化學衍生法

原理

試樣中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取，提取液經(jīng)多功能凈化柱和免

疫親和柱凈化和富集，凈化液經(jīng)濃縮、定容和過濾后，經(jīng)液相色譜分離，柱后光化學法衍生，熒光檢測

器檢測。外標法定量。

試劑及材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

4.2.1試劑

4.2.1.1甲醇（CH3OH，CAS：67-56-1）：色譜純。

4.2.1.2乙腈（CH3CN，CAS：75-05-8）：色譜純。

4.2.1.3氯化鈉（NaCl，CAS：7647-14-5）。

4.2.1.4磷酸氫二鈉（Na2HPO4，CAS：7558-79-4）。

4.2.1.5磷酸二氫鉀（KH2PO4，CAS：7778-77-0）。

4.2.1.6氯化鉀（KCl，CAS：7447-40-7）。

4.2.1.7鹽酸（HCl，CAS：7647-01-0）。

1

DB34/T4268—2022

4.2.1.8吐溫-20（C58H114O26，CAS：9005-64-5）。

4.2.1.9硫酸鎂（MgSO4，CAS：7487-88-9）。

4.2.1.10聚乙烯基吡絡烷酮（PVP，CAS：9003-39-8）。

4.2.1.11N-丙基乙二胺（PSA，CAS：111-39-7）。

4.2.2材料

4.2.2.1移液管：1mL和5mL規(guī)格。

4.2.2.2針筒式濾器：100mL規(guī)格，可連接于空氣壓力泵或手動加壓。

4.2.2.3玻璃纖維濾紙：快速、高載量、液體中顆粒保留1.6μm。

4.2.2.4真菌毒素多功能凈化柱（以下簡稱多功能凈化柱）。

4.2.2.5免疫親和柱：AFB1柱容量≥200ng，AFB1柱回收率≥80%，AFG2的交叉反應率≥80%。

4.2.2.6一次性針式過濾器：帶0.22μm有機相微孔濾膜。

4.2.3試劑配制

4.2.3.1乙腈-水溶液（84+16）：取840mL乙腈加入160mL水，混勻。

4.2.3.2甲醇-水溶液（70+30）：取700mL甲醇加入300mL水，混勻。

4.2.3.3磷酸鹽緩沖溶液（以下簡稱PBS）：稱取8.00g氯化鈉、1.20g磷酸氫二鈉、0.20g磷

酸二氫鉀、0.20g氯化鉀，用900mL水溶解，用鹽酸調節(jié)pH至7.4，用去離子水定容至1000mL。

4.2.3.4含1%吐溫-20的PBS：取10mL吐溫-20，用PBS定容至1000mL。

4.2.4標準品

4.2.4.1AFB1標準品（C17H12O6，CAS：1162-65-8）：純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的

標準物質。

4.2.4.2AFB2標準品（C17H14O6，CAS：7220-81-7）：純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的

標準物質。

4.2.4.3AFG1標準品（C17H12O7，CAS：1165-39-5）：純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的

標準物質。

4.2.4.4AFG2標準品（C17H14O7，CAS：7241-98-7）：純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的

標準物質。

4.2.5標準溶液配制

4.2.5.1標準儲備溶液

分別稱取AFB1、AFB2、AFG1和AFG2各1mg（精確至0.01mg），用乙腈溶解并定容至100mL。各溶

液濃度為10μg/mL，溶液轉移至試劑瓶中后，在-20℃下避光保存、備用，有效期三個月。臨用前，

參照GB5009.22進行濃度校準。

4.2.5.2混合標準工作液（AFB1和AFG1：各100μg/L，AFB2和AFG2：各25μg/L)

移液管準確移取AFB1和AFG1標準儲備溶液各1mL，AFB2和AFG2標準儲備溶液各250μL至100mL

容量瓶中，乙腈定容。密封后避光-20℃下保存，一個月內有效。

4.2.5.3標準系列工作溶液稀釋

2

DB34/T4268—2022

準確移取混合標準工作液，按照樣品檢測需求，以乙腈為溶劑作適度的梯度稀釋，以符合分析檢測

要求。

儀器和設備

4.3.1高速粉碎機。

4.3.2渦旋振蕩器或搖床。

4.3.3天平：感量0.01g和0.00001g。

4.3.4渦旋混合器。

4.3.5離心機：轉速≥6000×g。

4.3.6固相萃取裝置：配15mL-50mL免疫親和層析針筒。

4.3.7空氣壓力泵。

4.3.8氮吹儀。

4.3.9液相色譜儀：配熒光檢測器。

4.3.10液相色譜柱。

4.3.11黃曲霉毒素光化學柱后衍生器。

4.3.12篩網(wǎng):1mm～2mm試驗篩孔徑。

分析步驟

4.4.1取樣

4.4.1.1茶湯

采樣量需大于1L，將所有液體樣品在一個容器中混勻后，取其中任意的100mL樣品，供檢測

用。

4.4.1.2干茶

采樣量需大于1.0kg，用高速粉碎機將其粉碎，過篩，使其粒徑小于2mm，混合均勻后，以四分

法縮分至100g，儲存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。

4.4.2提取

4.4.2.1茶湯

取50mL試樣（精確至0.01mL），然后加入50mL乙腈（精確至0.01mL），7.5g氯化鈉

（精確至0.01g），渦旋1min，6000×g離心10min，取上清液，再加入50mL乙腈重復提取，

然后合并兩次上清液，并加入2g氯化鈉（精確至0.01g），2g硫酸鎂（精確至0.01g），5g

PVP（精確至0.01g），2gPSA（精確至0.01g），6000×g離心10min，上清液用玻璃纖維濾紙過

濾，收取慮液備用。

4.4.2.2干茶

稱取5g試樣（精確至0.01g）于50mL離心管中，加入25mL乙腈-水溶液（4.2.3.1）或甲

醇-水溶液（4.2.3.2），渦旋混勻，置于渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min，將茶葉及取提液全部轉移

至針筒式濾器，真空抽濾（或手動加壓過濾）。收集全部提取液于離心管中，在6000×g下離心10

min，上清液用玻璃纖維濾紙過濾，收取慮液備用。

4.4.3凈化

3

DB34/T4268—2022

4.4.3.1多功能凈化柱凈化

移取適量上清液，按多功能凈化柱的操作說明進行凈化，收集全部凈化液，并確保凈化液多于4

mL。

4.4.3.2免疫親和柱凈化

4.4.3.2.1上樣液的準備

用刻度移液管準確吸取上步的凈化液4mL（茶湯樣品20mL或依據(jù)濃度適當調整），加入46

mL含1%吐溫-20的PBS（使用甲醇-水溶液作為黃曲霉毒素提取溶劑時，加入含1%吐溫-20的

PBS可減半加入），混勻。

4.4.3.2.2免疫親和柱準備

將2℃～6℃條件下保存的免疫親和柱從冷藏條件下取出，恢復至室溫連接于固相萃取裝置。

4.4.3.2.3親和層析凈化

待免疫親和柱內原有液體流盡后，將上述樣液（4.4.3.2.1）移至50mL注射器筒中（或按照批

次分批次移入10mL-20mL注射器筒），調節(jié)下滴速度，控制樣液以每秒一滴的速度穩(wěn)定流過免疫親

和柱。樣液流完后，向注射器筒內加入10mL含1%吐溫-20的PBS，以每秒2滴的流速淋洗免疫

親和柱，并重復一次凈化步驟。待清洗液流完后，用空氣壓力泵吹干免疫親和柱。脫離真空系統(tǒng)，在親

和柱下部放置5mL刻度試管，加入2mL甲醇，以每秒1滴的速度洗脫免疫親和柱，再用空氣壓力泵

吹干免疫親和柱，收集全部洗脫液至試管中。在50℃條件下，用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，加入

1.0mL甲醇-水溶液（45:55，V/V），渦旋30秒溶解殘留物，過0.22μm有機濾膜過濾，收集濾液

待測。

4.4.4液相色譜參考條件

高效液相色譜參考條件如下：

a)流動相：A相：水；B相：甲醇；

b)等梯度洗脫條件：A相：55%；B相：45%；

c)色譜柱：C18柱（柱長250mm或150mm，柱內徑4.6mm，填料粒徑5μm)，或相當者；

d)流速：0.8mL/min；

e)柱溫：40℃；

f)進樣量：10μL；

g)光化學柱后衍生器；

h)激發(fā)波長：360nm；發(fā)射波長：440nm；

i)液相色譜圖參見附錄A。

4.4.5定性檢測

試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準品色譜峰的保留時間相比較，變化范圍應在±2.5%

之內。

4.4.6標準曲線制作

4

DB34/T4268—2022

在4.4.4的液相色譜分析條件下，將標準系列溶液由低到高濃度進樣檢測，以AFB1、AFB2、AFG1和AFG2

色譜峰面積與各對應濃度作圖，得到標準曲線回歸方程，其線性相關系數(shù)應大于0.99。

4.4.7空白試驗

稱取不含黃曲霉毒素的空白試樣，按照上述同樣的提取、凈化和檢測步驟做空白實驗。應確認不含

有干擾待測組分的物質。

分析結果計算與表述

試樣中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的含量，用上述外標法的標準曲線，以待測樣品目標毒素的峰面積，

按照公式（1）計算出毒素濃度，計算結果保留三位有效數(shù)字，單位為（μg/kg或μg/L）。

1000×(???0)×?×?

?=······························································(1)

1000×??×?

式中：

C——試樣中AFB1、AFB2、AFG1或AFG2的含量，單位為微克每千克或微克每升（μg/kg或μg/L）；

ρ——標準工作液中黃曲霉毒素的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；

A——樣液中黃曲霉毒素的峰面積；

A0——空白樣液中黃曲霉毒素的峰面積；

V——樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；

m——最終樣液所代表的試樣量，單位為克或毫升（g或mL）；

AS——標準工作液中黃曲霉毒素的峰面積。

精密度

在重復性條件下，獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值，不得超過算術平均值的20%。

檢測限

當稱取樣品5g（或50mL）時，AFB1的檢出限為0.04μg/kg（或μg/L），AFB2的檢出限為0.02

μg/kg（或μg/L），AFG1的檢出限為0.04μg/kg（或μg/L），AFG2的檢出限為0.02μg/kg（或μg/L）。

5第二法雙柱凈化-液相色譜柱串聯(lián)質譜檢測法

原理

試樣中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取，提取液用含1%吐溫-20

的磷酸鹽緩沖溶液稀釋后，經(jīng)黃曲霉毒素多功能凈化柱初步凈化，再用免疫親和柱凈化和富集，凈化液

濃縮、定容和過濾后，經(jīng)液相色譜分離，串聯(lián)質譜檢測。外標法定量。

試劑和材料

5.2.1試劑

同4.2.1。

5.2.2材料

同4.2.2。

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5.2.3試劑配制

同4.2.3。

5.2.4標準品

同4.2.4。

5.2.5標準溶液配制

同4.2.5。

儀器和設備

5.3.1高速粉碎機。

5.3.2渦旋振蕩器或搖床。

5.3.3天平：感量0.01g和0.00001g。

5.3.4渦旋混合器。

5.3.5空氣壓力泵。

5.3.6離心機：轉速≥6000×g。

5.3.7固相萃取裝置：配15mL～50mL免疫親和層析針筒。

5.3.8氮吹儀。

5.3.9篩網(wǎng)：1mm～2mm試驗篩孔徑。

5.3.10液相色譜-串聯(lián)質譜儀：帶電噴霧離子源。

分析步驟

5.4.1取樣

同4.4.1。

5.4.2提取

同4.4.2。

5.4.3凈化

同4.4.3。

5.4.4液相色譜參考條件

高效液相色譜參考條件如下：

a)流動相：A相：水；B相：甲醇；

b)梯度洗脫：95%A相（0min～5min），95%－35%A相（5min～7.5min），95%A相（7.5

min～10min）；

c)色譜柱：C18柱（柱長100mm，柱內徑2.1mm；填料粒徑1.7μm），或相當者；

d)流速：0.4mL/min；

e)柱溫：25℃；

f)進樣體積：1.0μL。

5.4.5質譜參考條件

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DB34/T4268—2022

質譜參考條件列出如下：

a)檢測方式：多離子反應監(jiān)測（MRM）；

b)離子源控制條件：電離方式，ESI；毛細管電壓，1.5kV；碰撞能量，6eV；錐孔電壓，40V；

離子源溫度，120℃；錐孔反吹氣流量，50L/h；脫溶劑氣溫度，500℃；脫溶劑氣流量，900

L/h；電子倍增電壓650V；

++

c)離子選擇參數(shù)：離子化方式，ESI[M+H]；AFB1，母離子313/定量離子241，定性離子269；

AFB2，母離子315/定量離子259，定性離子287；AFG1，母離子329/定量離子243，定性離子

215；AFG2，母離子331/定量離子285，定性離子245；

d)總離子流圖：參見附錄B；

e)子母離子掃描圖：參見附錄C。

5.4.6定性檢測

5.4.6.1試樣中各目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間相比較，變化范圍應在

±2.5%之內。

5.4.6.2每種化合物的質譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應包括一個母離子和兩個子離子；同一檢測批次，

對同一化合物，樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當?shù)臉藴嗜芤合啾?，其允許偏差

不超過規(guī)定的范圍（相對離子豐度＞50%，允許相對偏差≤20%；相對離子豐度20%～50%，允許相對

偏差≤25%；相對離子豐度10%～20%，允許相對偏差≤30%；相對離子豐度≤10%，允許相對偏差

≤50%）。

5.4.7標準曲線制作

在5.4.4和5.4.5的液相色譜串聯(lián)質譜儀分析條件下，將標準系列溶液由低到高濃度進樣檢測，以

AFB1、AFB2、AFG1和AFG2色譜峰面積與各對應濃度作圖，得到標準曲線回歸方程，其線性相關系數(shù)應大于

0.99。

5.4.8試樣溶液的測定及濃度范圍調整

取5.4.3中凈化得到的待測溶液進樣，按照5.5公式計算樣品中各待測物含量。待測樣液中的響應值

應在標準曲線線性范圍內，若超過線性范圍則應進行適當稀釋提取液或減少取樣量重新測定。

5.4.9空白試驗

稱取不含黃曲霉毒素的試樣，按照上述5.4.1～5.4.8同樣的提取、凈化和檢測步驟做空白實驗。確

認不含有干擾待測組分的物質。

分析結果計算與表述

試樣中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的含量，用上述外標法標準曲線確認線性范圍，以待測樣品目標毒素

的峰面積，按照公式（2）計算出毒素濃度，計算結果保留三位有效數(shù)字，單位為（μg/kg或μg/L）。

1000×(???0)×?×?

?=······························································(2)

1000×??×?

式中：

C——試樣中AFB1、AFB2、AFG1或AFG2的含量，單位為微克每千克或微克每升（μg/kg或μg/L）；

ρ——標準工作液中黃曲霉毒素的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；

A——樣液中黃曲霉毒素的峰面積；

A0——空白樣液中黃曲霉毒素的峰面積；

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V——樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；

m——最終樣液所代表的試樣量，單位為克或毫升（g或mL）；

AS——標準工作液中黃曲霉毒素的峰面積。

精密度

在重復性條件下，獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%。

檢測限

當稱取樣品5g（或50mL）時，AFB1的檢出限為0.02μg/kg（或μg/L），AFB2的檢出限為0.05

μg/kg（或μg/L），AFG1的檢出限為0.1μg/kg（或μg/L），AFG2的檢出限為0.21μg/kg（或μg/L）。

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A

A

附錄A

（資料性）

黃曲霉毒素AFB1，AFB2，AFG1，AFG2液相色譜圖

A1為四種黃曲霉毒素添加回收樣品色譜峰；A2為四種黃曲霉毒素標準品色譜峰。

圖A.1黃曲霉毒素AFB1，AFB2，AFG1，AFG2液相色譜圖

9

DB