細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)方法BacterialReverseMutationTest1范圍本方法確定了細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的基本原則、要求和方法。本方法適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測(cè)。2定義2.1回復(fù)突變r(jià)eversemutation細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營(yíng)養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型（prototroph）。2.2基因突變genemutation在化學(xué)致突變物作用下DNA中堿基對(duì)的排列順序發(fā)生變化。2.3堿基置換突變basesubstitutionmutation引起DNA鏈上一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的置換。堿基置換有轉(zhuǎn)換（transition）和顛換（transversion）兩種形式。轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘌呤所代替。顛換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘧啶所代替。2.4移碼突變frameshiftmutation引起DNA鏈上增加或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)。2.5細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)bacterialreversemutationassay利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測(cè)定引起細(xì)菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的氨基酸缺陷型回復(fù)突變?yōu)樵B(yǎng)型的試驗(yàn)方法。3原理鼠傷寒沙門(mén)氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)；大腸桿菌色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)。假如有致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長(zhǎng)形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變，故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的S9混合液。4儀器和設(shè)備培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱（-80℃）或液氮生物容器、普通冰箱、天平、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計(jì)數(shù)器、低溫高速離心機(jī)、玻璃器皿、生物安全柜等。5培養(yǎng)基和試劑5.10.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L色氨酸－0.5mmol/L生物素溶液成分：L-組氨酸（MW155）78mgD-生物素（MW244）122mgL-色氨酸（MW204）102mg加蒸餾水/去離子水至1000mL配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min。儲(chǔ)存于4℃冰箱。若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸。5.2頂層瓊脂培養(yǎng)基成分：瓊脂粉1.2g氯化鈉1.0g加蒸餾水/去離子水至200mL配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。試驗(yàn)時(shí)，加入0.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L色氨酸－0.5mmol/L生物素溶液20mL。若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸。5.3Vogel-Bonner（V-B）培養(yǎng)基E成分：枸櫞酸（C6H8O7·H2O）100g磷酸氫二鉀（K2HPO4）500g磷酸氫銨鈉（NaNH4HPO4·4H2O）175g硫酸鎂（MgSO4·7H2O）10g加蒸餾水/去離子水至1000mL配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水/去離子水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)存于4℃冰箱。5.420%葡萄糖溶液成分：葡萄糖200g加蒸餾水/去離子水至1000mL配制：加少量蒸餾水/去離子水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水/去離子水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲(chǔ)存于4℃冰箱。5.5底層瓊脂培養(yǎng)基成分：瓊脂粉7.5g蒸餾水/去離子水480mLV-B培養(yǎng)基E10mL20%葡萄糖溶液10mL配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h，備用。5.6營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基成分：牛肉膏2.5g胰胨5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）1.0g加蒸餾水/去離子水至500mL配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)存于4℃冰箱。5.7鹽溶液（1.65mol/LKCl+0.4mol/LMgCl2）成分：氯化鉀（KCl）61.5g氯化鎂（MgCl2·6H2O）40.7g加蒸餾水/去離子水至500mL配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)存于4℃冰箱。5.80.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）成分：磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）2.965g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）29.015g加蒸餾水/去離子水至500mL配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)存于4℃冰箱。5.9S9混合液成分：每毫升S9混合液肝S9100μL鹽溶液20μL滅菌蒸餾水/去離子水380μL0.2mol/L磷酸鹽緩沖液500μL輔酶II（NADP）4μmol6-磷酸葡萄糖（G-6-P）5μmol配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶?jī)?nèi)稱(chēng)重，然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。如輔酶II、6-磷酸葡萄糖采用溶液，需根據(jù)加入量調(diào)整滅菌蒸餾水/去離子水的體積。S9混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。試驗(yàn)結(jié)束，剩余S9混合液應(yīng)該丟棄。5.10菌株鑒定用和特殊用途試劑5.10.1組氨酸-色氨酸-生物素平板成分：瓊脂粉15g蒸餾水/去離子水934mLV-B培養(yǎng)基E20mL20%葡萄糖20mL滅菌鹽酸組氨酸水溶液（0.5g/100mL）10mL滅菌鹽酸色氨酸水溶液（0.5g/100mL）10mL滅菌0.5mmol/L生物素溶液6mL配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，V-B培養(yǎng)基、組氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時(shí)蒸餾水/去離子水改為944mL）。待溶液稍微冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。5.10.2氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板成分：瓊脂粉15g蒸餾水/去離子水930mLV-B鹽溶液20mL20%葡萄糖20mL滅菌鹽酸組氨酸溶液（0.5g/100mL）10mL滅菌鹽酸色氨酸水溶液（0.5g/100mL）10mL滅菌0.5mmol/L生物素溶液6mL氨芐青霉素溶液（8mg/mL于0.02mol/LNaOH中）3.15mL四環(huán)素溶液（8mg/mL于0.02mol/LHCl中）0.25mL配制：瓊脂和水高壓滅菌20min，將無(wú)菌的葡萄糖、VB鹽溶液、組氨酸溶液和色氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中，混勻（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時(shí)蒸餾水/去離子水改為加940mL）。冷卻至大約50℃，在無(wú)菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。5.10.3營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板成分：瓊脂粉7.5g營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基500mL配制：于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。6試驗(yàn)菌株及其生物學(xué)特性鑒定6.1試驗(yàn)菌株采用以下菌株作為標(biāo)準(zhǔn)組合：鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA1535；鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97或TA97a或TA1537；鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA98；鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA100；鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA102或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）。6.2生物學(xué)特性鑒定新獲得的或長(zhǎng)期保存的菌種，在試驗(yàn)前必須進(jìn)行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示。表1試驗(yàn)菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)菌株組氨酸缺陷色氨酸缺陷脂多糖屏障缺損氨芐青霉素抗性切除修復(fù)缺損四環(huán)素抗性自發(fā)回變菌落參考數(shù)*Ames實(shí)驗(yàn)室Zeiger實(shí)驗(yàn)室TA97+/+++-90~180*75~200*TA97a+/+++-90~180*75~200*TA98+/+++-30~5020~50TA100+/+++-100~20075~200TA102+/++-+240~320*100~400*TA1535+/+-+-10~355~20TA1537+/+-+-3~155~20WP2uvrA/+/-+-/5~20WP2uvrA（pKM101）/+/++-/100~200注“+”表示需要組氨酸“+”表示需要色氨酸“+”表示具有rfa突變“+”表示具有R因子“+”表示對(duì)于鼠傷寒沙門(mén)氏菌具有△uvrB突變，對(duì)于大腸桿菌具有△uvrA突變“+”表示具有pAQ1質(zhì)粒*在體外代謝活化條件下自發(fā)回變菌落數(shù)略增。對(duì)于各菌的自發(fā)回變范圍，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室在參考其他實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上應(yīng)建立自己的歷史對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)，形成適合本實(shí)驗(yàn)室條件的適用范圍。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室背景數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)與文獻(xiàn)報(bào)道相符。6.2.1組氨酸缺陷/色氨酸缺陷原理：組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株本身不能合成組氨酸，只能在補(bǔ)充組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長(zhǎng)；色氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株本身不能合成色氨酸，只能在補(bǔ)充色氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長(zhǎng)。鑒定方法：將測(cè)試菌株增菌液分別于含組氨酸或者色氨酸培養(yǎng)基平板和無(wú)組氨酸或者色氨酸平板上劃線(xiàn)，于37℃下培養(yǎng)24h后觀(guān)察結(jié)果。結(jié)果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長(zhǎng)，而在無(wú)組氨酸平板上則不能生長(zhǎng)；色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平板上生長(zhǎng)，而在無(wú)色氨酸平板上則不能生長(zhǎng)。6.2.2脂多糖屏障缺損原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質(zhì),如結(jié)晶紫能穿透菌膜進(jìn)入菌體，從而抑制其生長(zhǎng)，而野生型菌株則不受其影響。鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液0.1mL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線(xiàn)，然后將浸濕的0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線(xiàn)處交叉放置。37℃下培養(yǎng)24h后觀(guān)察結(jié)果。結(jié)果判斷：假若待測(cè)菌在濾紙條與劃線(xiàn)交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說(shuō)明該待測(cè)菌株具有rfa突變。6.2.3氨芐青霉素抗性原理：含R因子的試驗(yàn)菌株對(duì)氨芐青霉素有抗性。因?yàn)镽因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質(zhì)粒存在與否。鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液0.1mL，在氨芐青霉素平板上劃線(xiàn)，37℃下培養(yǎng)24h后觀(guān)察結(jié)果。結(jié)果判斷：假若測(cè)試菌在氨芐青霉素平板上生長(zhǎng)，說(shuō)明該測(cè)試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含R因子，否則，表示測(cè)試菌不含R因子或R因子丟失。6.2.4紫外線(xiàn)敏感性原理：具有△uvrB/A突變的菌株對(duì)紫外線(xiàn)敏感，當(dāng)受到紫外線(xiàn)照射后，不能生長(zhǎng)，而具有野生型切除修復(fù)酶的菌株，則能照常生長(zhǎng)。鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液0.1mL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線(xiàn)，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W，距離33cm）8秒鐘。置37℃下孵育24h后觀(guān)察結(jié)果。結(jié)果判斷：具有△uvrB/A突變的菌株對(duì)紫外線(xiàn)敏感，經(jīng)輻射后細(xì)菌不生長(zhǎng)，而具有完整的切除修復(fù)系統(tǒng)的菌株，則照常生長(zhǎng)。6.2.5四環(huán)素抗性原理：具有pAQI的菌株對(duì)四環(huán)素有抗性。鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液0.1mL于氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線(xiàn)，置37℃下孵育24h后觀(guān)察結(jié)果。結(jié)果判斷：假若測(cè)試菌照常在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上生長(zhǎng)，表明該測(cè)試菌株對(duì)氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有pAQI質(zhì)粒，否則，說(shuō)明測(cè)試菌株不含pAQI質(zhì)粒。6.2.6自發(fā)回變?cè)恚好糠N試驗(yàn)菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱(chēng)為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗(yàn)菌株的一項(xiàng)特性。鑒定方法：將待測(cè)菌株增菌液0.1mL加到2mL含組氨酸-色氨酸-生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸），混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置37℃培養(yǎng)箱中孵育48～72h后計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。結(jié)果判斷：每種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應(yīng)符合表1要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下的略高。6.2.7回變特性-診斷性試驗(yàn)原理：每種試驗(yàn)菌株對(duì)診斷性誘變劑回變作用的性質(zhì)以及S9混合液的效應(yīng)不一。鑒定方法：按照平板摻入試驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行。將受試物換成診斷性誘變劑。結(jié)果判斷：標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)某些診斷性誘變劑特有的回變結(jié)果參見(jiàn)表2。表2測(cè)試菌株的回變性誘變劑劑量（μg/皿）S9TA97TA98TA100TA102TA1535TA1537WP2uvrAWP2uvrA（pKM101）柔毛霉素6.0-124312347592////疊氮化鈉1.5-7633000188320（0.5μg）///ICR-1911.0-1640631850////鏈霉黑素0.25-inhinhinh2230////絲裂霉素C0.5-inhinhinh2772////2,4,7-三硝基-9-芴酮0.20-8377824440016////4-硝基-O-次苯二胺20-216015997980////4-硝基喹啉-N-氧化物0.5-5282924220287//610/甲基磺酸甲酯1.0（μL）-1742327306586////敵克松50.0-26881198183895////9-氨基吖啶50-/////337//2-氨基芴10+174261943026261////苯并（a）芘1.0+337143937255/110（5μg）//2-氨基蒽20+////380（5μg）/300/注：（1）inh表示抑菌；（2）表中數(shù)值均已扣除溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)。7大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和S9的制備7.1誘導(dǎo)選擇SPF級(jí)雄性成年大鼠，體重200g左右。將多氯聯(lián)苯（PCB混合物）溶于玉米油中，濃度為200mg/mL，按500mg/kg體重一次腹腔注射，5d后將動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死，安樂(lè)死前禁食12h。也可采用苯巴比妥鈉和β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)的方法進(jìn)行制備。經(jīng)口或腹腔注射給予80mg/kg苯巴比妥鈉和80mg/kgβ-萘黃酮，每天1次，連續(xù)3d，安樂(lè)死前禁食16h。7.2S9制備在無(wú)菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的0.15mol/L氯化鉀溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化鉀溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化鉀溶液3mL。用電動(dòng)勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機(jī)上，在4℃條件下，以9000g離心10min，取其上清液（S9）分裝，每管裝2～3mL，儲(chǔ)存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物試驗(yàn)環(huán)境、飼料、飲水應(yīng)符合國(guó)家相應(yīng)規(guī)定。上述全部操作均在冰水浴中進(jìn)行，均為無(wú)菌操作。制備肝S9所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S9制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定。也可使用商品化S9，使用前需確認(rèn)其活力和無(wú)菌狀態(tài)。8溶劑的選擇如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水/去離子水作為溶劑；如為脂溶性，應(yīng)選擇對(duì)試驗(yàn)菌株毒性低且無(wú)致突變性的有機(jī)溶劑，首選二甲基亞砜（DMSO），也可選擇其他溶劑。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為100μL。9劑量設(shè)置需結(jié)合受試物的溶解度及對(duì)細(xì)菌的毒性，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定最高劑量。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存活數(shù)減少，都是毒性的標(biāo)志。對(duì)原料而言，一般最高劑量組可為5mg/皿或5μL/皿。對(duì)產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，最高劑量可為最低抑菌濃度，無(wú)殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應(yīng)設(shè)5個(gè)劑量組，按等比組距的原則設(shè)定劑量間隔，推薦使用約10倍組距。每個(gè)劑量均做3個(gè)平行平板。10試驗(yàn)操作步驟10.1增菌培養(yǎng)取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無(wú)菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應(yīng)每毫升不少于1～2×109活菌數(shù)。10.2平板摻入法試驗(yàn)時(shí)，將含0.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L色氨酸－0.5mmol/L生物素溶液（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸）的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中，45℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗(yàn)菌株增菌液0.1mL，受試物溶液0.1mL和磷酸鹽緩沖液0.5mL或者S9混合液0.5mL（需代謝活化時(shí)），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培養(yǎng)箱里孵育48～72h。計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。試驗(yàn)中，除設(shè)受試物各劑量組外，還應(yīng)同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、溶劑對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和無(wú)菌對(duì)照。10.3預(yù)培養(yǎng)平板摻入法預(yù)培養(yǎng)對(duì)于某些受試物可取得較好效果，因此可根據(jù)情況確定是否進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。在加入頂層培養(yǎng)基前，先進(jìn)行以下預(yù)培養(yǎng)步驟：（1）將受試物（需活化時(shí)另加10%S9混合液0.5mL）和菌液，在37℃中培養(yǎng)20min，或在30℃中培養(yǎng)30min；（2）再加入2mL頂層瓊脂；其他同10.2。11數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷記錄受試物各劑量組、空白對(duì)照（自發(fā)回變）、溶劑對(duì)照以及陽(yáng)性誘變劑對(duì)照的每皿回變菌落數(shù)（如有毒性或沉淀，則需描述各濃度組細(xì)菌毒性大小和沉淀情況），并計(jì)算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。11.1如果受試物TA1535、TA1537、WP2uvrA的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的3倍或3倍以上，受試物TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（pKM101）的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的2倍或2倍以上，并出現(xiàn)以下情形之一，則該受試物判定為致突變陽(yáng)性：（1）呈劑量-反應(yīng)關(guān)系（2）任何一個(gè)劑量條件下，出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)并有可重復(fù)性受試物經(jīng)上述5個(gè)試驗(yàn)菌株測(cè)定后，只要有一個(gè)試驗(yàn)菌株，無(wú)論在加S9或未加S9條件下為陽(yáng)性，均可報(bào)告該受試物細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)為致突變陽(yáng)性。如果受試物經(jīng)5個(gè)試驗(yàn)菌株檢測(cè)后，無(wú)論加S9和未加S9均為陰性，則可報(bào)告該受試物為致突變陰性。11.2如試驗(yàn)中出現(xiàn)可疑陽(yáng)性，應(yīng)通過(guò)改變?cè)囼?yàn)條件（如調(diào)整受試物或S9濃度，改變培養(yǎng)條件），對(duì)可疑陽(yáng)性的受試物進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，以確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。11.3陰性結(jié)果需要驗(yàn)證（即重復(fù)一次），應(yīng)改變?cè)囼?yàn)的條件，如劑量間距（改為5倍間距）等。

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)方法起草說(shuō)明為加強(qiáng)化妝品的監(jiān)督管理，進(jìn)一步提高化妝品使用安全性，國(guó)家藥監(jiān)局化妝品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)組織開(kāi)展了《細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)方法》的研究修訂工作?，F(xiàn)就工作有關(guān)情況說(shuō)明如下：起草原則（一）科學(xué)規(guī)范原則。本試驗(yàn)方法起草宗旨是以我國(guó)2019年發(fā)布的化妝品《細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》為基礎(chǔ)，廣泛參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)指導(dǎo)原則，保證方法科學(xué)、規(guī)范的同時(shí)，兼顧與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的接軌。（二）問(wèn)題導(dǎo)向原則。根據(jù)化妝品審評(píng)工作中遇到的實(shí)際情況，匯總、梳理《細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》中存在的要求不明確、不具體等問(wèn)題，并對(duì)這些問(wèn)題產(chǎn)生的原因和解決方法進(jìn)行深入分析，進(jìn)而對(duì)該試驗(yàn)方法進(jìn)行修訂完善。（三）公開(kāi)透明原則?！都?xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)方法》起草過(guò)程中，堅(jiān)持公開(kāi)透明、廣泛參與的原則，充分參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)法規(guī)和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，多次積極征求檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)、專(zhuān)家、行業(yè)協(xié)會(huì)意見(jiàn)，并根據(jù)意見(jiàn)反饋情況科學(xué)合理地進(jìn)行修改完善。起草過(guò)程國(guó)家藥監(jiān)局化妝品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)于2025年1月委托開(kāi)展細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)方法的修訂工作。前期準(zhǔn)備工作包括梳理并匯總原《細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》方法