ICS11.220

ICSB41

53

云南省地方標準

DB53/T1059.3—2021

滇金絲猴檢疫技術(shù)

第3部分：隱孢子蟲實驗室檢測技術(shù)規(guī)范

QuarantinetechniqueforRhinopithecusbieti

—Part3:TechnicalspecificationsforlaboratoryexaminationofCryptosporidium

2021-09-30發(fā)布2021-10-14實施

云南省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB53/T1059.3—2021

目??次

前言...................................................................................................................................................................III

引言.....................................................................................................................................................................Ⅴ

1范圍.................................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件.............................................................................................................................................1

3術(shù)語和定義.....................................................................................................................................................1

4縮略語.............................................................................................................................................................2

5試驗原理.........................................................................................................................................................2

6試驗條件.........................................................................................................................................................2

6.1實驗室通用要求.....................................................................................................................................2

6.2采樣人員要求.........................................................................................................................................2

7儀器設備和試劑.............................................................................................................................................2

7.1儀器設備.................................................................................................................................................2

7.2試劑.........................................................................................................................................................2

8樣品.................................................................................................................................................................3

8.1采樣要求.................................................................................................................................................3

8.2糞樣的選取原則.....................................................................................................................................3

8.3采樣程序.................................................................................................................................................3

8.4樣品的保存與運輸.................................................................................................................................3

9試驗步驟.........................................................................................................................................................3

9.1形態(tài)學檢測.............................................................................................................................................4

9.2巢式PCR檢測.........................................................................................................................................4

10試驗數(shù)據(jù)處理...............................................................................................................................................5

附錄A（規(guī)范性）糞樣的采集信息表............................................................................................................6

附錄B（規(guī)范性）巢式PCR反應....................................................................................................................7

I

DB53/T1059.3—2021

前??言

本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

本文件是DB53/T1059《滇金絲猴檢疫技術(shù)》的第3部分。DB53/T1059已經(jīng)發(fā)布了以下部分：

——第1部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌實驗室檢測技術(shù)規(guī)范；

——第2部分：毛首線蟲實驗室檢測技術(shù)規(guī)范；

——第3部分：隱孢子蟲實驗室檢測技術(shù)規(guī)范；

——第4部分：志賀桿菌實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。

本文件由云南省林業(yè)與草原局、云南省市場監(jiān)督管理局共同提出。

本文件由云南省林業(yè)標準化技術(shù)委員會（YNTC02）歸口。

本文件主要起草單位：云南農(nóng)業(yè)大學、云南省標準化研究院、昆明動物園、云南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所。

本文件主要起草人：楊建發(fā)、黃艷梅、衡昭君、楊俊、鄒豐才、李迅、陳培富、宋海洋、張譽方、

蒙英雯、李云喬、朱尤帥。

III

DB53/T1059.3—2021

引言

滇金絲猴（Rhinopithecusbieti）是中國特有珍稀瀕危靈長類動物，屬于國家Ⅰ級重點保護野生

動物，列入《世界自然保護聯(lián)盟》（IUCN）瀕危物種紅色名錄。編制并發(fā)布DB53/T1059《滇金絲猴檢

疫技術(shù)》地方標準，推進滇金絲猴疫病診斷的標準化和規(guī)范化，指導從事野生動物保護相關(guān)的專業(yè)人員

按規(guī)范程序?qū)嵤Φ峤鸾z猴相關(guān)病原的實驗室檢測，為滇金絲猴的科學研究和保護工作提供病原或疫病

調(diào)查的基礎數(shù)據(jù)，為滇金絲猴檢疫、疫病監(jiān)測和防治提供重要的參考依據(jù)，促進滇金絲猴繁育和擴群，

維護地區(qū)物種與生態(tài)平衡，提升生物多樣性保護成效。

本文件已發(fā)布4個部分：

——第1部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從產(chǎn)氣莢膜梭菌實驗室檢測技術(shù)的總則、

產(chǎn)氣莢膜梭菌分型、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；

——第2部分：毛首線蟲實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從毛首線蟲實驗室檢測技術(shù)規(guī)范的試驗原理、

試驗條件、儀器設備和試劑、樣品采集與保存、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；

——第3部分：隱孢子蟲實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從隱孢子蟲實驗室檢測技術(shù)的試驗原理、試

驗條件、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；

——第4部分：志賀桿菌實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從志賀桿菌實驗室檢測技術(shù)涉及的總則、志

賀桿菌分類、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范。

Ⅴ

DB53/T1059.3—2021

滇金絲猴檢疫技術(shù)

第3部分：隱孢子蟲實驗室檢測技術(shù)規(guī)范

重要提示：本文件涉及人獸共患病原體的操作，應在符合國家相關(guān)生物安全規(guī)定（GB19489和

NY/T541）的條件下進行。

1范圍

本文件規(guī)定了滇金絲猴（Rhinopithecusbieti）檢疫技術(shù)中隱孢子蟲實驗室檢測技術(shù)的試驗原理、試

驗條件、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理。

本文件適用于滇金絲猴檢疫技術(shù)中隱孢子蟲實驗室檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

隱孢子蟲Cryptosporidium

頂復門孢子蟲綱真球蟲目隱孢子蟲科隱孢子蟲屬。主要寄生于動物的腸上皮細胞，可引起隱孢子蟲

病。隱孢子蟲卵囊是其感染階段，卵囊圓形或橢圓形，直徑4μm～6μm，囊壁光滑、無色，一個卵囊中

含有4個子孢子。目前共鑒定出9個隱孢子蟲種可以感染非人靈長類動物。其中，微小隱孢子蟲（C.parvum）

和安氏隱孢子蟲（C.andersoni）感染較普遍。

3.2

巢式PCRnestedpolymerasechainreaction

利用2套引物，對靶細胞基因2次識別并進行2輪擴增的方法。它可從極少量的模板中獲得較高濃度

和純度的靶片段，第1次擴增反應的產(chǎn)物被用作第2次PCR的模板，而第2次反應的寡核苷酸引物對位于第

1對引物內(nèi)側(cè)。

1

DB53/T1059.3—2021

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

bp：堿基對BasePair

dNTPs：脫氧核苷三磷酸混合液DeoxyribonucleosideTriphosphatesMixture

DNA：脫氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid

PCR：聚合酶鏈式反應PolymeraseChainReaction

TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液TrisAcetate-EDTABuffer

BLAST：基于局部序列比對算法的搜索工具BasicLocalAlignmentSearchTool

5試驗原理

隱孢子蟲卵囊沒有孢子囊，有4個子孢子，該形態(tài)特征與其他孢子蟲的卵囊明顯不同。依據(jù)該特征

可進行隱孢子蟲的形態(tài)分類學鑒定。對于形態(tài)學鑒定存疑的物種，采用分子生物學方法進一步確定。

6試驗條件

6.1實驗室通用要求

實驗室應滿足GB19489中生物安全實驗室的要求。

6.2采樣人員要求

采樣和試驗人員應具有相應的專業(yè)知識。采樣過程中的生物安全要求應符合GB/T27401的要求。

7儀器設備和試劑

7.1儀器設備

7.1.1微量移液器：10μL、50μL、200μL、1000μL，微量移液器槍頭若干。

7.1.2振蕩器。

7.1.3正置光學顯微鏡。

7.1.4載玻片及蓋玻片若干。

7.1.5落地式低速離心機：3000r/min。

7.1.6玻璃棒、接種環(huán)、燒杯（或塑料杯）、金屬篩（40目）、離心管。

7.1.7電子天平：感量為0.001g。

7.1.8高速臺式離心機：12000r/min。

7.1.9恒溫水浴鍋：36℃±1℃，65℃±1℃。

7.1.10PCR擴增儀。

7.1.11電泳系統(tǒng)。

7.1.12微波爐。

7.1.13凝膠成像系統(tǒng)。

7.2試劑

7.2.1商品化DNA提取試劑盒。

2

DB53/T1059.3—2021

7.2.2商品化PCR分子擴增使用試劑，包含有dNTPs、10×buffer(Mg2+free)、Mg2+、rTaq酶。

7.2.3DL2000DNAMarker。

7.2.4瓊脂糖粉。

7.2.5電泳緩沖液。

7.2.6商品化核酸染料。

7.2.76倍上樣緩沖液（6×LoadingBuffer）。

7.2.8引物：基于隱孢子蟲核糖體小亞基RNA基因（SSUrRNA）設計引物。

7.2.9飽和蔗糖水溶液：蔗糖1280g，蒸餾水1000mL，5%石碳酸21mL。

7.2.10抗酸染色液：石炭酸復紅染色液（第一液）：堿性復紅4g，95％酒精20mL，5％石炭酸8mL，

蒸餾水100mL；10％硫酸溶液（第二液）：純硫酸10mL，蒸餾水90mL（邊攪拌邊將硫酸徐徐傾入水中）；

20g/L孔雀綠液（第三液）：20g/L孔雀綠原液1mL，蒸餾水10mL。

7.2.112.5%重鉻酸鉀溶液：重鉻酸鉀2.5g，加蒸餾水定容至100mL。

8樣品

8.1采樣要求

8.1.1采樣前，準備好采樣用具，如記錄表格、一次性PE手套、自封袋、樣品管、鑷子、酒精噴壺、

記號筆、鉛筆、標簽紙等。

8.1.2采樣人員應規(guī)范穿戴全套個人衛(wèi)生安全防護裝備做好自我防護，與樣品直接接觸的器具均提前

做滅菌處理以防樣品被污染,應準備垃圾袋帶回采樣過程中產(chǎn)生的所有廢棄物品。

8.1.3采樣完成后，所使用的器械、容器、個人防護用品以及廢棄物等做無害化處理，防止環(huán)境污染

和造成疫病傳播。

8.2糞樣的選取原則

8.2.1應采集滇金絲猴新鮮糞樣，采集同一堆糞作為同一份樣品，分裝兩管。以滇金絲猴糞樣表面的

完整程度、濕度顏色以及氣味等條件判斷滇金絲猴糞樣的新鮮程度。

8.2.2如遇到滇金絲猴母幼糞樣，應分開采集；依據(jù)母猴和幼猴的糞便大小有明顯差異作出判斷，并

在備注欄記錄。

8.3采樣程序

8.3.1采集糞樣時，應佩戴一次性PE手套。每次采樣后更換新的PE手套，以避免樣品間的交叉污染。

8.3.2采集時，直接分離新鮮糞樣的表層部分和內(nèi)部部分，分別裝入樣品管，貼上樣品標簽紙，寫上

樣品編號，并做好樣品標記和采樣記錄。將樣品管放入自封袋，密封保存。

8.3.3同一堆糞便應盡量多取樣品。

8.3.4填寫《滇金絲猴糞樣采集記錄表》，見附錄A中表A.1，記錄好采樣信息。

8.4樣品的保存與運輸

樣品分兩份保存，一份冷藏或冷凍保存，一份置于裝有2.5%重鉻酸鉀的樣品管中保存，48h內(nèi)低溫

運輸送到相關(guān)實驗室4℃保存，進行試驗。

9試驗步驟

3

DB53/T1059.3—2021

9.1形態(tài)學檢測

9.1.1飽和蔗糖溶液漂浮法

取備檢糞樣5g～10g，放在燒杯（或塑料杯）內(nèi),加入自來水30mL，使用玻璃棒攪拌均勻，將糞

水混合物緩慢倒入40目金屬篩中過濾入另一個燒杯（或塑料杯）內(nèi)，取濾液10mL置于15mL的干燥離心

管內(nèi)，3000r/min離心3min，緩慢傾去上清液，保留沉淀物，向沉渣中加入10mL飽和蔗糖溶液，攪

拌混勻，3000r/min離心5min，使用接種環(huán)蘸取表面液膜，點樣于載玻片上，加蓋玻片，鏡檢。

9.1.2改良抗酸染色法

取經(jīng)上述方法獲得的上清液，3000r/min離心3min后取沉淀10μL滴于載玻片上，涂片面積適當

且均勻，將糞膜置于空氣中干燥；滴加3～4滴甲醇于糞膜上，自然干燥后準備進行染色。滴加3～4滴抗

酸染色液第1液在糞膜上，靜止5min，用蒸餾水緩慢沖洗；逐滴滴加抗酸染色液第2液，脫色5min～10min，

載玻片上樣品呈粉色，用蒸餾水緩慢沖洗；滴加抗酸染色液第3液，復染1min后再沖洗，待自然干燥后

滴加適量石蠟油；置油鏡下觀察。

9.2巢式PCR檢測

9.2.1樣品的制備及DNA提取

將之前收集好的糞樣取出，用商品化的糞樣DNA提取試劑盒進行DNA提取。樣品的DNA提取具體步驟

按照檢測時所用的商品化DNA提取試劑盒說明書進行。

9.2.2DNA的保存

1周內(nèi)使用的DNA，可將裝有DNA的離心管保存于4℃冰箱中。長期保存的DNA應保存于-20℃冰箱中。

9.2.3巢式PCR擴增

9.2.3.1巢式PCR擴增引物

基于隱孢子蟲核糖體小亞基RNA基因設計2對引物，引物序列見附錄B中表B.1。

9.2.3.2巢式PCR擴增體系

巢式PCR擴增體系見附錄B中表B.2。

9.2.3.3巢式PCR反應程序

樣品DNA在PCR儀上進行巢式PCR擴增的反應程序分為兩步進行，同時設置陽性對照和陰性對照：

——第1步反應程序如下：94℃預變性5min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，

循環(huán)35次，然后72℃作用10min，4℃存放；

——第2步反應程序如下：94℃預變性5min，94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，

循環(huán)35次，然后72℃作用10min，4℃存放。

9.2.3.4巢式PCR產(chǎn)物檢測

巢式PCR擴增完成后，取5μL第2輪PCR產(chǎn)物與1μL6×LoadingBuffer混合均勻，加入1%瓊脂糖凝

膠孔中，以DL2000DNAMarker作為參照，110V電壓電泳30min。將凝膠取出放入紫外凝膠成像分析

系統(tǒng)中觀察并拍照。

4

DB53/T1059.3—2021

9.2.3.5PCR產(chǎn)物測序及分析

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后陽性對照、陰性對照結(jié)果成立，第2輪PCR產(chǎn)物出現(xiàn)大小為830bp左右的目的條

帶，見附錄B中圖B.1，將PCR產(chǎn)物送測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST在線比對分析。

10試驗數(shù)據(jù)處理

10.1形態(tài)學檢測結(jié)果

隱孢子蟲無孢子囊，一個卵囊有4個子孢子，其卵囊透明無色，呈圓形或橢圓形，直徑4μm～

6μm，囊壁光滑無色，可見內(nèi)有一小暗點或呈淡黃色的子孢子。經(jīng)染色后，油鏡下觀察隱孢子蟲卵囊為

玫瑰紅色，子孢子呈月牙形，有4個。

10.2巢式PCR檢測結(jié)果

將待測序列與GenBank中已有的不同種屬隱孢子蟲蟲種進行比較，根據(jù)比對結(jié)果可直接得出是微小

隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲或其他種屬感染，最終鑒定蟲種。

5

DB53/T1059.3—2021

AA

附錄A

（規(guī)范性）

糞樣的采集信息表

滇金絲猴糞樣采集記錄表見表A.1。

表A.1滇金絲猴糞樣采集記錄表

樣品編號采集管數(shù)內(nèi)部管數(shù)外部管數(shù)種群采集地名經(jīng)緯度、海拔新鮮程度采集日期采集人

B

6

DB53/T1059.3—2021

DCB

附錄B

（規(guī)范性）

巢式PCR反應

B.1總則

可使用多種酶進行巢式PCR擴增，本文件使用的是rTaq酶，根據(jù)此酶制定反應體系、反應時間以及

最適退火溫度。

B.2巢式PCR反應引物

兩步法巢式PCR，引物序列見表B.1。

表B.1引物序列

輪序引物序列（5＇─3＇）目的片段大?。╞p）

上游引物：TTCTAGAGCTAATACATGCG

第一輪

下游引物：CCCATTTCCTTCGAAACAGGA

830

上游引物：GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG

第二輪

下游引物：AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA

B.3巢式PCR反應體系

巢式PCR反應體系見表B.2。第一輪反應體系與第二輪反應體系相同，第二輪反應模板為第一輪的PCR

產(chǎn)物。

表B.2巢式PCR反應體系

組分用量（μL）

模板DNA（＞20ng/μL）