DNA網(wǎng)絡(luò)特異性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的雙受體聚集，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡摘要：目的本研究利用滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（RCA）在腫瘤微環(huán)境（TME）中原位組裝DNA網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞受體NCL和PTK7聚集以誘導(dǎo)凋亡。方法整合適配體與I-motif序列至探針，分別靶向肝癌細(xì)胞受體NCL和PTK7。利用I-motif的酸響應(yīng)性誘導(dǎo)受體聚集，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡調(diào)控。結(jié)果pH為6.5時(shí)，DNA網(wǎng)絡(luò)展現(xiàn)良好的酸響應(yīng)性，表現(xiàn)為圓二色信號(hào)紅移和水合粒徑縮小。SEM實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，酸性環(huán)境促進(jìn)了DNA網(wǎng)絡(luò)形態(tài)的緊密化。聚丙烯凝膠酰胺電泳（PAGE）實(shí)驗(yàn)顯示DNA網(wǎng)絡(luò)具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。毒性實(shí)驗(yàn)表明，DNA網(wǎng)絡(luò)對(duì)正常肝細(xì)胞（L-02）影響輕微，但對(duì)肝癌細(xì)胞（HepG-2）具有顯著毒性，引發(fā)細(xì)胞核皺縮并誘導(dǎo)凋亡。結(jié)論本研究構(gòu)建的DNA網(wǎng)絡(luò)具有優(yōu)異的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗腫瘤效果，為腫瘤個(gè)性化治療提供了新的策略。關(guān)鍵詞：肝癌細(xì)胞；DNA網(wǎng)絡(luò)；受體聚集；細(xì)胞凋亡；I-motifDNAnetworksspecificallyinducedoublereceptoraggregationinlivercancercelltoinducecellapoptosisAbstract:ObjectiveInthisstudy,rollingringamplificationreaction(RCA)wasusedtoassembleDNAnetworksinthetumormicroenvironment(TME)topromotetheaggregationoflivercancercellreceptorsNCLandPTK7toinduceapoptosis.MethodsTheaptamerandI-motifsequenceswereintegratedintotheprobetotargethepatocellularcarcinomareceptorNCLandPTK7respectively.TheacidresponsivenessofI-motifwasusedtoinducereceptoraggregationtoachieveapoptosisregulation.ResultsWhenpHwas6.5,theDNAnetworkshowedgoodacidresponse,includingcirculardichroicsignalredshiftandhydratedparticlesizereduction.SEMexperimentsfurtherconfirmedthatacidicenvironmentpromotedthemorphologyofDNAnetworks.Polypropylenegelamideelectrophoresis(PAGE)showedthattheDNAnetworkhadgoodstructuralstability.ToxicitytestsshowedthattheDNAnetworkhadaslighteffectonnormalhepatocytes(L-02),buthadsignificanttoxicityonhepatomacells(HepG-2),causingnuclearcontractionandinducingapoptosis.ConclusionTheDNAnetworkconstructedinthisstudyhasexcellentstructuralstabilityandanti-tumoreffect,whichprovidesanewstrategyforpersonalizedtumortreatment.Keywords:Livercancercell;DNAnetwork;Receptoraggregation;Cellapoptosis;I-motif

第1章導(dǎo)論1.1肝癌概述肝癌是一種常見(jiàn)的具有高度侵襲性的癌癥，5年生存率不超過(guò)18%，預(yù)計(jì)到2025年，肝癌每年新增病例將超過(guò)100萬(wàn)例[1，2]。其中，肝細(xì)胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是肝癌的主要組織學(xué)亞型，其所占比例達(dá)90%以上[3]。肝癌起病隱匿、發(fā)展迅速、惡性程度高，給治療和預(yù)后帶來(lái)了很大的困難。因此，肝癌是人類健康面臨嚴(yán)重威脅的一種惡性疾病，急需開(kāi)發(fā)出有效且安全的治療方法。目前，手術(shù)治療是早期肝癌患者的首選治療方案。除了血液系統(tǒng)腫瘤外，幾乎所有惡性腫瘤均可通過(guò)手術(shù)切除腫瘤病灶及其附近的淋巴結(jié)的方式進(jìn)行治療，但是手術(shù)仍然無(wú)法完全阻止肝癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[4]；化學(xué)治療通過(guò)單獨(dú)或聯(lián)合使用藥物，破壞肝癌細(xì)胞的DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。但是大多數(shù)化學(xué)治療藥物無(wú)法靶向肝癌細(xì)胞，易產(chǎn)生卵巢衰竭、心肌毒性等嚴(yán)重的毒副作用[5，6]。并且大多數(shù)患者需要多種備選的化學(xué)治療方案，以克服化療藥物產(chǎn)生的腫瘤耐藥性；放射治療利用高能輻射（如x射線）摧毀肝癌細(xì)胞的DNA，通常與手術(shù)治療、化學(xué)治療結(jié)合使用以清除殘留的肝癌細(xì)胞，可以進(jìn)一步提高手術(shù)或化療療效，但放射治療主要適用于成年人[7-9]\o"Casey,2021#87"；光療法主要包括光熱治療(PTT)和光動(dòng)力治療(PDT)，利用光能量治療腫瘤具有精確無(wú)痛的優(yōu)點(diǎn)，但是光療法無(wú)法根治肝癌，并且容易產(chǎn)生皮膚反應(yīng)、眼部損傷等副作用[10]；靶向治療作為一種新興的治療方式，利用特定藥物針對(duì)肝癌細(xì)胞的突變基因或特征進(jìn)行干預(yù)，減少對(duì)健康細(xì)胞的影響。相比傳統(tǒng)治療方法，靶向治療具有更好的療效和安全性[11，12]。分子靶向治療（Moleculartargetedtherapy）是指以癌癥相關(guān)分子作為靶點(diǎn)，將化學(xué)分子、抗體等有效治療探針靶向定位于腫瘤部位，從而達(dá)到癌癥治療的目的。分子靶向治療具有定向、定位的優(yōu)勢(shì)，可以減少用藥劑量，以高效率的治療效果和低毒副作用成為癌癥治療研究的熱點(diǎn)[13]。在肝癌細(xì)胞內(nèi)存在許多可以作為癌癥治療靶點(diǎn)的分子，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞外基質(zhì)等，這些相關(guān)的分子靶點(diǎn)為未來(lái)發(fā)展新型腫瘤治療技術(shù)提供了潛在的可能。1.2細(xì)胞膜受體概述細(xì)胞膜受體（Cellmembranereceptor）是位于細(xì)胞表面的一類分子，其主要作用是識(shí)別和結(jié)合特定的生物活性物質(zhì)，形成受體—配體復(fù)合物后觸發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)，從而對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝、遷移等生理病理過(guò)程中的細(xì)胞行為進(jìn)行調(diào)控[14，15]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞具有特殊的代謝特征，表現(xiàn)為快速生長(zhǎng)、無(wú)限增殖和失去接觸抑制等。因此，肝癌細(xì)胞表面特異性高表達(dá)的膜受體，可作為實(shí)現(xiàn)肝癌特異性治療的重要靶點(diǎn)，如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（c-Met）、核仁素（NCL）、蛋白酪氨酸激酶（PTK）等[16-18]。核仁素（NCL）是一種廣泛存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)，在核仁中含量豐富[19]。NCL具有在核仁、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表面之間穿梭的能力，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、胞質(zhì)分裂、胚胎發(fā)育和核生成等生物過(guò)程。與正常細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出NCL定位異常和表達(dá)明顯增高。由于NCL具有優(yōu)越的穿梭性能，在癌細(xì)胞的生物活動(dòng)中發(fā)揮重要功能，抑制癌細(xì)胞表面NCL的功能有利于誘導(dǎo)癌細(xì)胞程序性死亡，這對(duì)于開(kāi)發(fā)新的癌癥治療方法具有深遠(yuǎn)影響。San等人[20]的研究證明，NCL過(guò)表達(dá)與肝癌患者的腫瘤分級(jí)、血管浸潤(rùn)、血清甲胎蛋白水平和生存率低相關(guān)，并且異位NCL過(guò)表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞惡化并刺激PI3K/Akt相關(guān)致癌信號(hào)通路激活。因此，NCL有潛力成為肝癌診斷與治療的重要靶點(diǎn)。酪氨酸激酶蛋白7(PTK7)是一種缺乏催化活性的受體蛋白酪氨酸激酶[21]，它與受體酪氨酸激酶相似，但是它的胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域缺乏保守的殘基。研究表明，PTK7參與Wnt信號(hào)通路，在包括HCC在內(nèi)的多種癌癥類型中過(guò)表達(dá)，并且可通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤增殖及侵襲，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要功能[22]。一個(gè)經(jīng)典的途徑是PTK7能夠與VEGFR1相互配對(duì)，形成二聚體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白FAK和AKT的磷酸化過(guò)程。這一系列的反應(yīng)對(duì)于血管的形成至關(guān)重要，直接影響細(xì)胞的遷移、增殖以及生存能力。通過(guò)干擾PTK7與其他蛋白的相互作用，可以阻斷癌細(xì)胞的信號(hào)傳遞，從而實(shí)現(xiàn)治療效果。Tsz等人[23]的研究證明，PTK7通過(guò)調(diào)控SOX9和TGF-β信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移，并且PTK7的表達(dá)與肝癌惡性程度呈正相關(guān)。因此，PTK7有望成為肝癌的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。本課題組已完成的工作證實(shí)利用核酸適配體（AS1411）誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面的NCL聚集可以有效促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。因此，基于NCL和PTK7的性質(zhì)，調(diào)控其聚集可為肝癌的治療方向提供新的策略。1.3受體調(diào)控概述目前，細(xì)胞膜表面的受體調(diào)控方式主要包括誘導(dǎo)聚集、解聚集以及聚集－解聚的可逆調(diào)控這三種模式[24]。細(xì)胞通過(guò)表面受體－受體相互作用接收外界信息，并調(diào)節(jié)自身功能做出響應(yīng)，但是大多數(shù)受體不能以單體的形式發(fā)揮功能，需要形成聚集體才能激活下游信號(hào)通路。因此，人工調(diào)控受體聚集可影響細(xì)胞增殖、干細(xì)胞分化、腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥性產(chǎn)生等[25]；與受體聚集激活下游信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞功能相對(duì)比，受體解聚則通過(guò)抑制受體激活進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與功能。但是解聚過(guò)程靈活性有限，細(xì)胞可能無(wú)法快速適應(yīng)環(huán)境變化；聚集－解聚的可逆調(diào)控在探究細(xì)胞膜受體介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中具有重要意義。通過(guò)在細(xì)胞膜錨定探針的特定位置引入光控基團(tuán)，并借助光照引發(fā)的DNA鏈置換反應(yīng)等先進(jìn)技術(shù)，從而有效地控制細(xì)胞膜上受體分子的聚集與解聚狀態(tài)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜受體功能的精細(xì)調(diào)節(jié)。但是，受體聚集－解聚的可逆調(diào)控需要消耗額外的能量和資源，在某些情況下會(huì)增加細(xì)胞的負(fù)擔(dān)，從而限制了細(xì)胞對(duì)外界信號(hào)的快速響應(yīng)能力。綜上所述，受體聚集調(diào)控細(xì)胞功能具有廣泛應(yīng)用和重要意義。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，誘導(dǎo)細(xì)胞膜受體聚集的方法日益多樣化。其中包括利用光敏材料、磁性材料、熱敏材料以及DNA納米材料等。1.3.1光敏材料隨著光敏技術(shù)的發(fā)展，光調(diào)控細(xì)胞表面受體聚集成為生物醫(yī)學(xué)研究的新方向。利用特定的光敏材料，如光敏蛋白或有機(jī)小分子，可以精確控制細(xì)胞膜受體的聚集狀態(tài)。這種方法具有高時(shí)空分辨率和非侵入性的特點(diǎn)，為研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)提供了新的工具和途徑。如圖1-1所示，Chen等人[26]設(shè)計(jì)了一種光控DNA組裝方法，通過(guò)核酸適配體特異性識(shí)別和光刺激，觸發(fā)c-Met二聚化實(shí)現(xiàn)光誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞行為。圖1-1細(xì)胞信號(hào)激活的光控DNA組裝方法示意圖[26]。Figure1-1SchematicrepresentationofphotocontrolledDNAassemblyapproachforthecellsignallingactivation[26].1.3.2磁性材料利用外部磁場(chǎng)對(duì)細(xì)胞表面磁性材料施加強(qiáng)大的驅(qū)動(dòng)力和控制磁性材料的尺寸與形狀，可以精確地操控細(xì)胞膜受體的聚集狀態(tài)。如圖1-2所示，Kim等人[27]合成了表面具有特定性質(zhì)的納米顆粒，并將它們引入到巨噬細(xì)胞中，通過(guò)調(diào)節(jié)外部條件來(lái)控制納米顆粒的聚集程度，調(diào)控細(xì)胞表面受體與其配體之間的結(jié)合，進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞的黏附性能。圖1-2磁控納米顆粒聚集體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中受體－配體結(jié)合[27]。Figure1-2Magneticallycontrollednanoparticleaggregatesregulatereceptor-ligandbindinginmacrophages[27].1.3.3熱敏材料熱敏材料的性質(zhì)會(huì)隨著溫度的變化而發(fā)生改變。在調(diào)控細(xì)胞膜受體聚集方面，熱敏材料可以被設(shè)計(jì)成在特定溫度范圍內(nèi)發(fā)生相變或結(jié)構(gòu)改變，從而影響細(xì)胞膜上受體的狀態(tài)。熱敏響應(yīng)是一種常見(jiàn)的生物功能調(diào)控策略，由于其可控性較好，因此被廣泛應(yīng)用。如圖1-3所示，Qiao等人[28]提出了一種熱控策略，用于在細(xì)胞表面實(shí)現(xiàn)聚合物-肽偶聯(lián)物的原位構(gòu)象轉(zhuǎn)變。這種策略能夠操縱和監(jiān)測(cè)HER2受體的聚集，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的磷酸化，進(jìn)一步有效抑制癌細(xì)胞的增殖。圖1-3熱控制聚合肽在細(xì)胞表面的原位相變用于高效抑制癌細(xì)胞增殖[28]。Figure1-3Insituphasetransformationofthermocontrolledpolymericpeptidesonthecellsurfaceisusedtoeffectivelyinhibittheproliferationofcancercells[28].1.3.4DNA納米材料DNA納米材料具備良好的可編輯性、生物相容性和可降解性，已成為構(gòu)建納米器件的重要材料。功能性的DNA納米結(jié)構(gòu)，如DNA折紙、DNA適配體和DNAzyme等，被廣泛應(yīng)用于控制細(xì)胞表面受體的聚集。如圖1-4所示，Zhang等人[29]利用雙功能單鏈DNA（包含AS1411適體和pH響應(yīng)I鏈序列）對(duì)金納米粒子（AuNPs）進(jìn)行修飾，制備了AI-Au智能納米機(jī)器。在酸性微環(huán)境下，這些修飾的AuNPs之間形成I-motif結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的特異性結(jié)合并促進(jìn)NCL聚集，最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。圖1-4腫瘤細(xì)胞膜上核蛋白原位聚集通過(guò)I-motif結(jié)構(gòu)激活細(xì)胞凋亡的示意圖[29]。Figure1-4SchematicRepresentationofCellApoptosisActivatedbyNucleolinAggregationInSituonTumorCellMembranethroughFormationofI-motifStructure[29].目前，DNA納米材料主要通過(guò)特定的點(diǎn)狀或線性相互作用來(lái)與其他分子或細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合。然而，這種作用模式存在局限，膜反轉(zhuǎn)現(xiàn)象可能導(dǎo)致探針失效，從而限制了DNA納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用。相比之下，DNA水凝膠是由DNA分子自組裝形成的一種具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水溶性材料。與傳統(tǒng)的點(diǎn)線作用模式相比，DNA水凝膠以其顯著增大的作用面積和豐富的修飾位點(diǎn)，展現(xiàn)出更為強(qiáng)大的作用效能。因此，DNA水凝膠具備更為廣闊的應(yīng)用前景。1.4DNA水凝膠DNA水凝膠結(jié)合了DNA的可編程性和水凝膠的特性，具有優(yōu)異的生物相容性和可控性。通過(guò)設(shè)計(jì)DNA水凝膠結(jié)構(gòu)并引入特定適配體，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞表面受體的特異性識(shí)別和結(jié)合。DNA水凝膠通過(guò)其獨(dú)特的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化和其他精準(zhǔn)釋放策略，在特定部位實(shí)現(xiàn)藥物的定向釋放，從而顯著減少對(duì)正常細(xì)胞的不良影響。這種特性使其成為一種極具潛力的癌癥治療材料。1.4.1DNA水凝膠的合成在室溫下，互補(bǔ)的單鏈DNA可自發(fā)雜交，使其他物質(zhì)在水凝膠形成過(guò)程中被固定而不發(fā)生副反應(yīng)。目前，科學(xué)家們已經(jīng)意識(shí)到了DNA在構(gòu)建功能性水凝膠方面的優(yōu)勢(shì)，并采用了三種主要策略來(lái)合成DNA水凝膠：樹突DNA自組裝、聚合物/DNA雜化、超長(zhǎng)線性DNA鏈雜交。1.4.1.1樹突DNA自組裝樹突狀DNA（DendriticDNA）是一種具有分枝結(jié)構(gòu)的DNA分子，其分支是通過(guò)連接多個(gè)核苷酸單元而成。在構(gòu)建DNA水凝膠時(shí)，樹突狀DNA的“粘性”末端基團(tuán)通過(guò)自組裝形成3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由于DNA分子之間的特定的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，樹突狀DNA能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下形成穩(wěn)定的水凝膠網(wǎng)絡(luò)。如圖1-5所示，Wu等人[30]設(shè)計(jì)了一種基于四個(gè)分支的樹突狀DNA等溫自組裝技術(shù)的水凝膠（DDH）用于3D細(xì)胞培養(yǎng)。即使在納摩爾濃度下，DDH也顯示出可調(diào)節(jié)的機(jī)械強(qiáng)度和可逆的觸變性。無(wú)論是在體細(xì)胞還是惡性細(xì)胞的培養(yǎng)中，DDH都展現(xiàn)出了顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果，并且復(fù)雜的細(xì)胞形態(tài)（如細(xì)胞集落和球狀體）在DDH中培養(yǎng)也具有很高的活力。圖1-5用于3D細(xì)胞培養(yǎng)的樹突狀DNA水凝膠（DDH）的自組裝[30]。Figure1-5Self-assemblyofdendriticDNAhydrogels(DDH)for3Dcellculture[30].1.4.1.2聚合物/DNA雜化水凝膠聚合物/DNA雜化水凝膠是由聚合物和DNA分子共同構(gòu)成，通過(guò)共價(jià)交聯(lián)或非共價(jià)相互作用形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。通常，聚合物可以提供水凝膠的骨架結(jié)構(gòu)，而DNA則作為功能性分子被引入其中。聚合物/DNA雜化水凝膠具有多種功能，可以根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行設(shè)計(jì)。如圖1-6所示，Cui等人[31]介紹了一種簡(jiǎn)單的低成本混合水凝膠，該水凝膠由聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和DNA制備而成，能夠在CFPS中高效且重復(fù)地合成蛋白質(zhì)，它為蛋白質(zhì)生產(chǎn)和無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)極大地節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。圖1-6PEGDA/DNA水凝膠的制備及其在無(wú)細(xì)胞蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用示意圖[31]。Figure1-6PreparationofPEGDA/DNAhydrogelanditsapplicationintheproductionofcell-freeproteins[31].1.4.1.3超長(zhǎng)線性DNA雜交滾換擴(kuò)增技術(shù)（RollingCircleAmplification，RCA）是一種高效的等溫核酸酶擴(kuò)增技術(shù)，其具有高靈敏度、強(qiáng)特異性、多功能性的特點(diǎn)，能高效負(fù)載不同種類的功能基團(tuán)。通過(guò)精細(xì)設(shè)計(jì)，可以通過(guò)RCA合成多種DNA納米結(jié)構(gòu)。因此，RCA被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞成像、腫瘤治療等領(lǐng)域。如圖1-7所示，Shuai等人[32]開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)RCA產(chǎn)生的可編程DNAzyme組裝體，借助miR-21的特異性激活和Na+的內(nèi)源性驅(qū)動(dòng)，引發(fā)DNAzyme的酶切反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)miRNA的靈敏檢測(cè)。圖1-7基于RCA構(gòu)建可編程DNAzyme組裝體用于細(xì)胞內(nèi)miR-21成像分析示意圖[32]。Figure1-7AprogrammableDNAzymeassemblywasconstructedbasedonRCAforintracellularmiR-21imaginganalysis[32].1.4.2DNA水凝膠的應(yīng)用與傳統(tǒng)的水凝膠相比，DNA水凝膠具有更豐富的結(jié)構(gòu)。利用DNA聚合鏈的可編程性和可控性，通過(guò)合理設(shè)計(jì)DNA序列或修飾其他功能特性的高分子聚合物、適配體和抗菌肽的DNA鏈段，可制備多功能性DNA水凝膠。DNA水凝膠因其對(duì)pH、光、酶、熱及離子等多種刺激的響應(yīng)特性，展現(xiàn)出了在生物傳感檢測(cè)、藥物運(yùn)輸、3D細(xì)胞培養(yǎng)、組織修復(fù)以及腫瘤治療等領(lǐng)域的廣泛適用性。1.4.2.1生物傳感器件在藥物篩選、臨床診斷、環(huán)境分析等多個(gè)科學(xué)研究領(lǐng)域，均要求檢測(cè)方法具備快速響應(yīng)、高度靈敏以及多功能集成的特點(diǎn)[33-35]。功能DNA作為交聯(lián)單元，其表面可修飾各種特異性適配體，使DNA水凝膠形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有智能響應(yīng)的特點(diǎn)[36]。加入待測(cè)物后，待測(cè)物與交聯(lián)DNA發(fā)生分子識(shí)別并導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)斷裂，進(jìn)而使水凝膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變，從而釋放水凝膠中封裝的信號(hào)物質(zhì)。如圖1-8所示，Yao等人[37]設(shè)計(jì)了一種封裝在pH敏感型水凝膠中的DNA比率熒光探針。在酸性條件下，ZnO-NH2被分解，從而釋放出CO-Y-DNA探針。當(dāng)目標(biāo)分子miRNA-21與CO-Y-DNA探針雜交后，導(dǎo)致CO-Y-DNA探針中修飾的TAMRA和Cy5之間的熒光比率發(fā)生變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的靈敏檢測(cè)。圖1-8DNA水凝膠組裝示意圖及其在CO-Y-DNA探針pH響應(yīng)釋放和miRNA-21比例熒光檢測(cè)中的應(yīng)用[37]。Figure1-8IllustrationsoftheassemblyofDNAhydrogelsanditsapplicationforpH-responsivereleaseofCO-Y-DNAprobeandratiometricfluorescencedetectionofmiRNA-21[37].1.4.2.2藥物運(yùn)輸藥物運(yùn)輸系統(tǒng)的設(shè)計(jì)旨在延長(zhǎng)藥物在病理環(huán)境中的滯留時(shí)間，提高藥物的穩(wěn)定性和生物利用度，減弱給藥后的副作用。具有良好生物相容性、可降解性和高載藥能力的材料是藥物輸送系統(tǒng)的理想選擇，如聚合物[38]、納米顆粒[39]、脂質(zhì)體[40]、微球[41]、水凝膠[42]。這些材料可以有效地承載藥物并實(shí)現(xiàn)控制釋放，同時(shí)在完成任務(wù)后被生物體降解或代謝，極大地減弱對(duì)人體的不良影響，并提高治療效果。DNA水凝膠作為藥物遞送系統(tǒng)具有許多潛在優(yōu)勢(shì)，其具有效的主動(dòng)靶向能力、高效載藥能力、可控釋放性。通過(guò)修飾不同的靶向基團(tuán)，可以實(shí)現(xiàn)特定部位的藥物遞送；不同類型的無(wú)機(jī)納米粒子、小分子藥物和功能性生物大分子均能通過(guò)物理作用滲入多孔網(wǎng)絡(luò)，并且載藥量較大；通過(guò)調(diào)節(jié)DNA水凝膠的序列結(jié)構(gòu)，可以控制藥物的釋放速率[43，44]。如圖1-9所示，Zhang等人[45]設(shè)計(jì)了嵌有化學(xué)藥物（喜樹堿）DNA鏈自組裝而成可注射DNA水凝膠用于局部化療。由于酶的降解，注射的水凝膠可以逐漸被分解成納米尺寸的顆粒，使其很好地滲透到殘留的腫瘤組織中，并被細(xì)胞有效吸收。圖1-9CPT-共軛DNA水凝膠的合成路線示意圖[45]。Figure1-9SchematicIllustrationoftheSyntheticRouteoftheCPT-ConjugatedDNAHydrogel[45].1.4.2.33D細(xì)胞培養(yǎng)3D細(xì)胞培養(yǎng)被廣泛用于模擬細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)雜形態(tài)，用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)。與2D細(xì)胞培養(yǎng)相比，3D細(xì)胞培養(yǎng)可產(chǎn)生具有更復(fù)雜多層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞聚集體，與體內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)更加相似[46]。水凝膠具有高含水量和類似細(xì)胞外基質(zhì)的特性，為了減少稀有細(xì)胞在分離過(guò)程中的損失，通過(guò)制造一體化水凝膠，以同時(shí)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞的封裝和培養(yǎng)，避免了繁瑣的細(xì)胞分離步驟。目前，一些稀有細(xì)胞（如干細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞）已采用DNA水凝膠的3D培養(yǎng)[47-49]。如圖1-10所示，Tang等人[50]設(shè)計(jì)了一種具有長(zhǎng)保存時(shí)間的DNA水凝膠用于3D細(xì)胞培養(yǎng)。PLL被引入作為交聯(lián)劑和保護(hù)劑，PLL和DNA之間的靜電相互作用驅(qū)動(dòng)了水凝膠的形成。并且DNA上的PLL涂層增加了DNA和核酸酶之間的空間位阻，從而削弱了核酸酶對(duì)磷酸二酯鍵的消化，增強(qiáng)了DNA水凝膠的穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明，該DNA/PLL水凝膠的保存時(shí)間從1天延長(zhǎng)至15天以上，涂層策略有望促進(jìn)DNA水凝膠在更多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的發(fā)展。圖1-10DNA/PLL水凝膠的細(xì)胞捕獲及涂層保護(hù)原理示意圖[50]。Figure1-10SchematicdiagramofcellcaptureandcoatingprotectionofDNA/PLLhydrogels[50].1.4.2.4組織修復(fù)組織修復(fù)是指由于致病因素作用而導(dǎo)致局部組織和細(xì)胞受損或死亡后，通過(guò)鄰近健康細(xì)胞的再生來(lái)恢復(fù)組織完整性的過(guò)程。如今，使用生物材料再生被創(chuàng)傷或病理病變損傷的組織已成為一種有前途的治療方法[51]。如圖1-11所示，Gao等人[52]成功構(gòu)建了一種多功能DNA水凝膠，作為高效的傷口敷料。通過(guò)精確的堿基配對(duì)，DNA構(gòu)建塊能夠在幾秒鐘內(nèi)在傷口部位形成凝膠結(jié)構(gòu)。利用C-C錯(cuò)配的胞嘧啶（C）與銀離子（Ag+）形成的橋接絡(luò)合，使其具有更持久的凝膠特性和緩釋特性，從而增強(qiáng)抗菌的治療效果。此外，該DNA水凝膠攜帶的適配體能夠招募并釋放內(nèi)源趨化因子，通過(guò)G偶聯(lián)蛋白受體招募M2巨噬細(xì)胞，促使炎癥過(guò)程迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞增殖過(guò)程。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這種雙功能化DNA水凝膠敷料能夠顯著加速耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染的大鼠皮膚組織再生和傷口愈合過(guò)程。圖1-11DNA-FKNa/Ag+水凝膠修復(fù)MRSA感染傷口示意圖[52]。Figure1-11SchematicillustrationofDNA-FKNa/Ag+hydrogelforrepairofMRSAinfectedwounds[52].1.4.2.5腫瘤治療目前，癌癥治療仍然面臨巨大挑戰(zhàn)，需要尋找更有效的治療方法。除了傳統(tǒng)的放射治療、手術(shù)和化學(xué)治療外，一些非常規(guī)的治療方式如基因治療、干細(xì)胞治療、天然抗氧化劑、靶向治療、光動(dòng)力治療等以及先進(jìn)技術(shù)如納米顆粒和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)都可被應(yīng)用于癌癥的診斷和治療。目前，研究重點(diǎn)之一是開(kāi)發(fā)有效的靶向納米藥物來(lái)專門針對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行治療，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷[53，54]。納米材料可以自由分子形式進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮治療作用。然而，腫瘤固有的屏障減低了藥物的滲透性，從而導(dǎo)致治療效果差。DNA水凝膠是一種具有良好生物相容性和可調(diào)控性的材料，其能高效地固定藥物分子，并實(shí)現(xiàn)藥物的針對(duì)性釋放。如圖1-12所示，Quazi等人[55]在納米級(jí)DNA水凝膠上逐步進(jìn)行功能化，構(gòu)建了一種肽藥物遞送載體（Dgel-PD-AuNP-YNGRT）。該載體利用靜電吸引力將一種多肽藥物加載到Dgel網(wǎng)絡(luò)中，隨后進(jìn)行光熱試劑AuNPs組裝，用于光觸發(fā)肽藥物的釋放。另一種肽序列YNGRT與Dgel結(jié)合，用于腫瘤組織的定向遞送。研究結(jié)果表明，Dgel-PD-AuNP-YNGRT納米復(fù)合物能夠特異性地移動(dòng)至癌細(xì)胞組織，經(jīng)光照射后釋放抗癌肽藥物，從而殺死癌細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞毒性影響可以忽略不計(jì)。圖1-12Dgel-PD-AuNP-YNGRT納米復(fù)合物的合成及光觸發(fā)分解和肽藥物的釋放示意圖[55]。Figure1-12SchematicPresentationofSynthesisoftheDgel-PD-AuNP-YNGRTNanocomplexandLight-TriggeredDisassemblyandPeptideDrugRelease[55].為了最大程度地減少DNA水凝膠對(duì)正常組織細(xì)胞的影響，實(shí)現(xiàn)原位組裝的DNA水凝膠顯得尤為重要。這樣一來(lái)，DNA水凝膠能實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的靶向作用，提高治療的針對(duì)性和效果，降低對(duì)正常組織的影響。1.5腫瘤微環(huán)境腫瘤微環(huán)境（Tumormicroenvironment，TME）是一種復(fù)雜而豐富的多細(xì)胞環(huán)境，對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)至關(guān)重要，其中包括各種細(xì)胞、分子和血管[56]。隨著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，腫瘤細(xì)胞傾向于進(jìn)行缺氧性糖酵解代謝，導(dǎo)致腫瘤區(qū)域積聚大量乳酸，使腫瘤微環(huán)境的pH值下降，通常從健康組織的pH7.3-7.4酸化至腫瘤組織的pH6.2-6.9。如圖1-13所示，腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)包括酸度、缺氧、乳酸升高和葡萄糖濃度降低、分泌組變化以及基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的募集等[57]，這些特性十分利于腫瘤的增殖、侵襲、黏附、血管生成以及抵抗治療[58]。隨著對(duì)TME的研究越來(lái)越深入，其作為一種調(diào)控因素也逐漸得到了臨床的重視。圖1-13實(shí)體腫瘤結(jié)構(gòu)與腫瘤微環(huán)境的重要特征示意圖[57]。Figure1-13Schematicofasolidtumorillustratingkeyfeaturesofthetumormicroenvironment[57].研究表明，在H+的驅(qū)動(dòng)下，特定的酸響應(yīng)DNA序列能夠折疊形成穩(wěn)定的I-motif結(jié)構(gòu)。這種I-motif結(jié)構(gòu)是一種四鏈DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其對(duì)pH值具有顯著的依賴性。因此，該DNA序列已被廣泛用作納米技術(shù)應(yīng)用中的pH開(kāi)關(guān)。通過(guò)基因編輯、轉(zhuǎn)染、納米技術(shù)或直接引入寡核苷酸等多種方式，可以將該DNA序列引入TME，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤低pH環(huán)境的響應(yīng)，這為實(shí)現(xiàn)腫瘤的特異性治療提供了有力的技術(shù)支撐。1.6核酸適配體癌細(xì)胞及其微環(huán)境的固有異質(zhì)性和復(fù)雜性使得實(shí)現(xiàn)癌癥精準(zhǔn)治療仍然是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。為了實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷和精準(zhǔn)治療，迫切需要開(kāi)發(fā)癌細(xì)胞和相關(guān)生物標(biāo)志物的高性能識(shí)別工具。核酸適配體（Aptamer）是一種人工合成的寡核苷酸序列（RNA或DNA），具有高度特異性和親和力，用于特定的靶標(biāo)識(shí)別和結(jié)合，它們通常通過(guò)體外篩選或進(jìn)化技術(shù)來(lái)獲得。由于DNA可編程性高和生物相容性好，核酸適配體作為靶向單元具有極大優(yōu)勢(shì)。因此，采用DNA組裝體調(diào)控細(xì)胞表面受體聚集影響細(xì)胞行為的研究愈來(lái)愈熱。值得一提的是，肝癌細(xì)胞表面的NCL和PTK7表達(dá)水平顯著上升，這為核酸適配體在癌癥的高效診斷和精準(zhǔn)治療方面提供了巨大的應(yīng)用潛力。1.7存在的問(wèn)題細(xì)胞表面功能調(diào)控作為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)，對(duì)于疾病診斷與治療具有重要意義。然而，目前用于細(xì)胞表面功能調(diào)控的探針和方法仍面臨一些挑戰(zhàn)。（1）難以長(zhǎng)時(shí)間錨定在細(xì)胞表面：目前用于細(xì)胞表面功能調(diào)控的一些探針不能長(zhǎng)期穩(wěn)定存在于細(xì)胞膜表面，容易被細(xì)胞內(nèi)吞，從而影響探針的持續(xù)性作用效果。（2）外部刺激依賴性：大多數(shù)用于調(diào)控細(xì)胞表面受體聚集的方法需要依賴外部刺激，如光、熱、磁場(chǎng)等。這些操作繁瑣，且難以避免對(duì)正常組織的損傷，限制了它們?cè)谂R床應(yīng)用中的可行性。（3）缺乏精準(zhǔn)性和特異性：一些探針可能缺乏對(duì)特定受體或細(xì)胞的精準(zhǔn)識(shí)別，對(duì)正常細(xì)胞容易產(chǎn)生非特異性影響，增加了治療過(guò)程中的副作用。1.8本實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容采用滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（RCA）形成三維DNA網(wǎng)絡(luò)探針以提供更大的作用面積和更多的修飾位點(diǎn)，增強(qiáng)探針的穩(wěn)定性。通過(guò)嫁接核酸適配體Asl411和Sgc8，多抓手捕獲肝癌細(xì)胞表面NCL和PTK7，增強(qiáng)探針的特異性。進(jìn)一步地，在三維DNA網(wǎng)絡(luò)中嫁接具有酸響應(yīng)的I-motif序列，在腫瘤組織特有的微酸性（pH6.2-6.9）環(huán)境中，I-motif序列在H+離子的驅(qū)動(dòng)下會(huì)發(fā)生收縮，形成穩(wěn)定的G四鏈體結(jié)構(gòu)。這一過(guò)程原位觸發(fā)了肝癌細(xì)胞表面NCL和PTK7雙受體的聚集，進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。通過(guò)這種設(shè)計(jì)，我們實(shí)現(xiàn)了對(duì)肝癌細(xì)胞的精準(zhǔn)治療。這種策略不僅具有高度的靶向性和特異性，還能夠在原位發(fā)揮作用，減少對(duì)正常組織的損傷。因此，它為肝癌的精準(zhǔn)醫(yī)療提供了新的思路和方法。圖1-14基于RCA構(gòu)建可編程DNA網(wǎng)絡(luò)凝膠用于誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡示意圖。Figure1-14SchematicdiagramofconstructingaprogrammableDNAnetworkgelbasedonRCAtoinduceapoptosisoflivercancercells.

第2章正文2.1試劑與儀器2.1.1實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)中所使用的DNA（表2-1）和TBE粉劑（1×）購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；T4DNA連接酶（350U/μL）及緩沖液（10×）購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；DEPC處理水、phi29DNA聚合酶（10U/μL）及緩沖液（10×）、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量MarkerA（25-500bp）、甘油凝膠上樣緩沖（6×）、4SRedPlus核酸染色劑VII購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）購(gòu)于北京昌盛生物技術(shù)公司；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)所使用的CellCountingKit-8（CCK-8）試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所；NaCl（≥99.5%）購(gòu)于成都金山化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用溶液均用超純水（18.2MΩ.cm-1）配置。表2-1本實(shí)驗(yàn)所使用的DNA序列Table2-1DNAsequencesusedinthiswork名稱DNA序列（5’-3’）Template-1PhosphateTCGTTTGATGTTATCTTTTTTTTTCCACCACCACCAACACCACCACCACCTTTTTTTTTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGCTGGAACACPrimer-1AACATCAAACGAGTGTTCCAGCCCTemplate-2PhosphateTTGTCTAACCGTACAGTATTTTCCCGGCGGCGCAGCAGTTAGATTTTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTTGATAACATCAAACGAPrimer-2ACGGTTAGACAATCGTTTGATGTT2.1.2實(shí)驗(yàn)儀器DNA溶液含量均使用NanoDropOne超微量紫外–可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；樣品的離心分離采用H1650-W離心機(jī)（湖南湘儀離心儀器有限公司）和SuperMiniDancer調(diào)速型迷你離心機(jī)（上海生工生物工程股份有限公司）；溶液的混勻采用Mixcr4K微型旋渦混合儀（上海生工生物工程股份有限公司）；溶液反應(yīng)的溫度控制采用舒適型恒溫混勻儀（德國(guó)艾本德股份公司）；聚丙烯酰胺凝膠電泳和成像分別采用BG-Power300電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司）和BG-gdsAUTO凝膠成像分析系統(tǒng)（北京百晶生物技術(shù)有限公司）；圓二色譜通過(guò)J-810圓二色儀（上海嘉斯科貿(mào)易有限公司）進(jìn)行測(cè)試；測(cè)試細(xì)胞熒光成像數(shù)據(jù)均由OlympusIX-81共聚焦熒光顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）獲得并通過(guò)Image-ProPlus處理和分析；細(xì)胞毒性使用Bio-TekEpoch多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）測(cè)定96孔板的吸光度與熒光強(qiáng)度來(lái)考察。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1環(huán)狀模板的合成本部分環(huán)狀DNA模板的合成包括環(huán)狀模板1（Circulartemplate1,CT1）和環(huán)狀模板2（Circulartemplate2,CT2）的合成，兩種環(huán)狀DNA模板采取相同的反應(yīng)體系，具體濃度和配比如下：首先將100μM模板鏈（Template）與100μM引物鏈（Primer）按1:2的比例在T4DNA連接酶緩沖溶液中95℃雜交10min，退火至25℃反應(yīng)1.5h，以促進(jìn)兩者發(fā)生雜交反應(yīng)。隨后，加入3μLT4DNA連接酶（350U/μL）置于16℃恒溫混勻儀過(guò)夜反應(yīng)16h。接著，65℃加熱10min以滅活T4DNA連接酶，最終制備所得2μM的CT1和CT2，置于4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2RCA產(chǎn)物的合成通過(guò)RCA反應(yīng)擴(kuò)增獲得兩種長(zhǎng)單鏈R1和R2，具體濃度和配比如下：分別將CT1、CT2與終濃度為1mMdNTP、1×Tris-NaCl、0.4U/μLphi29DNA聚合酶在0.5×phi29DNA聚合酶緩沖液中均勻混合，30℃擴(kuò)增反應(yīng)4h，隨即65℃加熱10min以滅活phi29DNA聚合酶，最終制備所得兩種RCA產(chǎn)物R1和R2，置于4℃保存?zhèn)溆谩?.2.3DNA網(wǎng)絡(luò)的合成將制備所得的R1和R2以1:1加入進(jìn)行反應(yīng)，在37°C下以450rpm勻速混合30min以促進(jìn)膠水鏈充分雜交形成DNA網(wǎng)絡(luò)。2.2.4實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化為了能更高效地合成DNA網(wǎng)絡(luò)，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，主要對(duì)Template與Primer的反應(yīng)比例以及RCA產(chǎn)物合成時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。2.2.4.1Template和Primer的反應(yīng)比例優(yōu)化將Template與Primer分別以1:1、1:2、1:3比例進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件同2.2.1，得到不同濃度的CT。根據(jù)2.2.2的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行RCA產(chǎn)物的合成，將所制備的R1和R2等量混合后，分別加入適量SYBRGold進(jìn)行染色，隨后在365nm紫外燈下進(jìn)行產(chǎn)物量的可視化比較。2.2.4.2RCA產(chǎn)物合成時(shí)間優(yōu)化Template與Primer以1:2進(jìn)行反應(yīng)后得到CT，反應(yīng)條件同2.2.1。根據(jù)2.2.2的實(shí)驗(yàn)條件分別進(jìn)行1-10h的合成時(shí)間優(yōu)化，將所制備的R1和R2等量混合后，分別加入適量SYBRGold進(jìn)行染色，隨后在365nm紫外燈下進(jìn)行產(chǎn)物量的可視化比較。2.2.5聚丙烯凝膠電泳表征制備12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）的方法如下：將4mL超純水、2.4mL丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺40%溶液（比例為29:1）、1.6mL5×TBE溶液、60μL過(guò)硫酸銨和10μL四甲基乙二胺（TEMED）混合均勻后，立即轉(zhuǎn)移至制膠裝置中并插入適當(dāng)尺寸的樣品梳。在1×TBE緩沖液中以200V的電壓進(jìn)行40min的凝膠電泳，接著使用4SRedPlus染料對(duì)樣品進(jìn)行20min的脫色處理，最后利用BG-gdsAUTO凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像。2.2.6圓二色譜表征取超純水進(jìn)行基線校正，將已制備好的pH分別為6.5和7.4的兩組樣品（R1、R2和DNA網(wǎng)絡(luò)）稀釋適當(dāng)倍數(shù)，按順序取400μL樣品上樣到比色皿中，隨后通過(guò)J-810圓二色儀進(jìn)行測(cè)試，分別獲得R1、R2和DNA網(wǎng)絡(luò)的圓二色性光譜。2.2.7水合粒徑表征將已制備好的pH分別為6.5和7.4的兩組樣品（R1、R2和DNA網(wǎng)絡(luò)）進(jìn)行超聲處理10min使其分散均勻，隨后立即取40μL放入微量樣品池，采用ZEN3600粒徑分析儀進(jìn)行測(cè)試表征。2.2.8掃描電子顯微鏡（SEM）表征取pH值分別為6.5和7.4的DNA網(wǎng)絡(luò)10μL滴加到硅片上，在-80°C下將DNA網(wǎng)絡(luò)快速凍結(jié)保留水凝膠網(wǎng)絡(luò)形態(tài)，之后使用SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行24h干燥。用導(dǎo)電膠將硅片固定在SEM樣品臺(tái)上，通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡S-4800拍攝樣品獲得圖像。2.2.9流變測(cè)試成功制備pH值分別為6.5和7.4的DNA網(wǎng)絡(luò)后，利用ARES-G2旋轉(zhuǎn)流變儀對(duì)DNA網(wǎng)絡(luò)的機(jī)械性能進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試采用時(shí)間掃描模式，應(yīng)變恒定為30%，頻率恒定為6Hz，環(huán)境溫度為25°C，測(cè)定時(shí)間為3.5min，隨后將500μLDNA網(wǎng)絡(luò)均勻平鋪到8mm的平行平板幾何體上進(jìn)行測(cè)試。2.2.10探針?lè)€(wěn)定性考察為了考察DNA網(wǎng)絡(luò)在體內(nèi)是否能穩(wěn)定存在，將R1、R2、DNA網(wǎng)絡(luò)分別用1%FBS和DNaseⅠ(1U/mL)進(jìn)行處理，在37°C恒溫培養(yǎng)箱分別反應(yīng)0h，12h，24h，36h，48h，60h，再通過(guò)瓊脂糖電泳分別分析R1、R2、DNA網(wǎng)絡(luò)條帶的遷移情況，評(píng)估探針結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。2.2.11細(xì)胞培養(yǎng)將HepG-2細(xì)胞凍存管從-80°C超低溫冰箱中取出，在37°C水浴下快速解凍并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，使用1000rpm離心機(jī)3min，去除上清液后加入相應(yīng)培養(yǎng)基輕輕吹打，后將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶并置于37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，HepG-2使用10%FBS和0.1%抗支原體藥的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到80–90%時(shí)，去除瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基并加入PBS清洗2次，隨后加入1mL胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行約2min消化，去除廢液后加入培養(yǎng)基，所獲得的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.2.12細(xì)胞毒性本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。首先將HepG-2細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，并置于37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以1×105個(gè)/mL的密度將細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行接種，再次放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。通過(guò)兩種pH為6.5和7.4的培養(yǎng)基配置初始濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%的單鏈探針，加入100μL的R1于室溫反應(yīng)30min，后加入100μL的R2于37℃培養(yǎng)箱中孵育48h，使其原位組裝形成DNA網(wǎng)絡(luò)。移除孔內(nèi)的探針后，每孔加入100μL10%CCK-8試劑，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30min。最后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，以計(jì)算細(xì)胞存活率。其中，OD實(shí)驗(yàn)組為加入探針與細(xì)胞孵育后在450nm處的吸光度值，OD對(duì)照組為未加入探針與細(xì)胞孵育在450nm處的吸光度值，而OD空白組為無(wú)細(xì)胞和探針只有培養(yǎng)基在450nm處的吸光度值。細(xì)胞存活率2.2.13Calcein-AM/PI活死細(xì)胞雙染實(shí)驗(yàn)將HepG-2細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種在六孔板中，放于37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h。通過(guò)兩種pH為6.5和7.4的培養(yǎng)基配置初始濃度為10%的單鏈探針，加入200μL的R1于室溫反應(yīng)30min，后加入200μL的R2于37℃培養(yǎng)箱中孵育48h，使其原位組裝形成DNA網(wǎng)絡(luò)。收集培養(yǎng)基于15mL離心管中，PBS洗滌細(xì)胞兩次。加入400μL胰蛋白酶消化并將細(xì)胞溶液匯集于先前的15mL離心管中，離心后轉(zhuǎn)移至成像皿中。加入Calcein-AM/PI雙染試劑后于37℃培養(yǎng)箱中孵育15min。最后用共聚焦熒光顯微鏡OlympusIX-81拍攝細(xì)胞熒光圖像（綠色和紅色熒光通道）。2.2.14細(xì)胞核DAPI染色實(shí)驗(yàn)將HepG-2細(xì)胞以0.5×105個(gè)/孔的密度接種在細(xì)胞成像皿中，置于37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h。通過(guò)兩種pH為6.5和7.4的培養(yǎng)基配置初始濃度為10%的單鏈探針，加入200μL的R1于室溫反應(yīng)30min，后加入200μL的R2于37℃培養(yǎng)箱中孵育48h，使其原位組裝形成DNA網(wǎng)絡(luò)。去除探針后，PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入細(xì)胞核染色試劑DAPI后于室溫孵育5min。最后用共聚焦熒光顯微鏡OlympusIX-81拍攝細(xì)胞熒光圖像（藍(lán)色熒光通道）。2.3結(jié)果和討論2.3.1CT與DNA網(wǎng)絡(luò)的合成與表征在實(shí)驗(yàn)中，首先通過(guò)Template與Primer進(jìn)行退火雜交，形成DNA環(huán)狀復(fù)合物。隨后，加入T4DNA連接酶將DNA環(huán)狀復(fù)合物連接，分別形成CT1和CT2，再通過(guò)RCA反應(yīng)得到R1和R2。通過(guò)PAGE凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征。結(jié)果如圖2-1所示，泳道1為DNAmarker（25-500bp）；泳道2為Primer1；泳道3為Template1；泳道4為CT1；泳道5為R1；泳道6為Primer2；泳道7為Template2；泳道8為CT2；泳道9為R2。從圖中可以觀察到，CT的泳道4和8的遷移速度均比相應(yīng)Template和Primer的泳道慢，說(shuō)明通過(guò)T4DNA連接酶進(jìn)行環(huán)合后形成了具有更大的分子量的產(chǎn)物，證明了CT的成功合成，泳道4和8的另一個(gè)條帶均為未反應(yīng)完全的小分子。當(dāng)進(jìn)行下一步擴(kuò)增反應(yīng)后，泳道5和9均滯留在加樣槽內(nèi)且單體條帶均消失，說(shuō)明有更大的分子量的產(chǎn)物生成，證明了RCA產(chǎn)物的成功合成。圖2-1RCA反應(yīng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖像。泳道1，DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量（25-500bp）；泳道2，Primer1；泳道3，Template1；泳道4，CT1；泳道5，R1；泳道6，Primer2；泳道7，Template2；泳道8，CT2；泳道9，R2。該實(shí)驗(yàn)中所有DNA樣品濃度均為1μmol/L。Figure2-1ThepolyacrylamidegelelectrophoresisimageofRCAreaction.Lane1,DNAmarker(25-500bp);Lane2,Primer1;Lane3,Template1;Lane4,CT1;Lane5,R1;Lane6,Primer2;Lane7,Template2;Lane8,CT2;Lane9,R2.TheconcentrationofallDNAsequenceswere1μmol/L.2.3.2實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化為了更加高效地合成RCA產(chǎn)物，使得DNA網(wǎng)絡(luò)形成完全，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)條件以可視化的方式進(jìn)行優(yōu)化。2.3.2.1Template和Primer的反應(yīng)比例優(yōu)化考慮到不同的Template和Primer比例會(huì)影響CT的合成效率，進(jìn)而影響DNA網(wǎng)絡(luò)的生成。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，固定Template的終濃度為2μM，通過(guò)控制Primer的濃度，得到不同比例下合成的CT，再將CT1與CT2按照1:1混合雜交，加入等量SYBRGold進(jìn)行染色，可視化比較DNA網(wǎng)絡(luò)的產(chǎn)量以獲得最優(yōu)的反應(yīng)比例。結(jié)果如圖2-2所示，從左至右Template和Primer比例依次為1:1、1:2、1:3，而當(dāng)二者反應(yīng)比例為1:2時(shí)的凝膠產(chǎn)量最大。我們推測(cè)DNA鏈濃度過(guò)高，可能反而會(huì)降低反應(yīng)效率。因此，選擇Template和Primer比例為1:2作為合成CT的最佳比例。圖2-2不同Template和Primer比例制備RCA產(chǎn)物量照片對(duì)比。試管1，Template和Primer比例為1:1；試管2，比例為1:2；試管3，比例為1:3。Figure2-2ComparisonoftheamountofRCAproductspreparedbydifferenttemplatesandPrimer.Intesttube1,theratioofTemplateandPrimerwas1:1;Testtube2,theratiois1:2;Testtube3,theratiois1:3.2.3.2.2RCA產(chǎn)物合成時(shí)間優(yōu)化采取Template和Primer反應(yīng)比例為1:2合成CT后，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)RCA產(chǎn)物反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行1-10h優(yōu)化，隨后加入適量的SYBRGold進(jìn)行可視化驗(yàn)證。結(jié)果如2-3所示，R1、R2在反應(yīng)1-10h后，生成的產(chǎn)物含量無(wú)明顯差異。但是只有在4h時(shí)，其相應(yīng)溶液變得更加黏稠，更加符合DNA水凝膠網(wǎng)絡(luò)特性。因此選擇4h作為RCA產(chǎn)物最優(yōu)合成時(shí)間。圖2-3（A）不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)R1生成量影響的可視化照片與凝膠特性。試管1，1h；試管2，2h；試管3，3h；試管4，4h；試管5，5h；試管6，6h；試管7，7h；試管8，8h；試管9，9h；試管10，10h。（B）不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)R2生成量影響的可視化照片與凝膠特性。反應(yīng)時(shí)間與試管編號(hào)關(guān)系同前。Figure2-3(A)VisualizationoftheeffectsofdifferentreactiontimesonR1productionandgelproperties.Tube1,1h;Tube2,2h;Tube3,3h;Tube4,4h;Tube5,5h;Tube6,6h;Tube7,7h;Tube8,8h;Tube9,9h;Tube10,10h.(B)VisualizationoftheeffectsofdifferentreactiontimesonR2productionandgelproperties.Therelationshipbetweenreactiontimeandtesttubenumberisthesameasbefore.2.3.3圓二色譜表征將等量的R1和R2按照上述實(shí)驗(yàn)條件合成DNA網(wǎng)絡(luò)后，使用圓二色譜儀在240nm到320nm波長(zhǎng)的區(qū)間內(nèi)分別對(duì)R1、R2和DNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖2-4所示，R1的CD值為265nm，R2的CD值為278nm，二者CD值存在差異則是由于設(shè)計(jì)了不同的DNA序列導(dǎo)致，這與已有文獻(xiàn)中的描述是一致的。兩條單鏈雜交后，形成的DNA網(wǎng)絡(luò)的CD值發(fā)生了明顯的變化，我們推測(cè)這種現(xiàn)象可能是由于兩條DNA鏈交聯(lián)纏結(jié)后發(fā)生了構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致DNA網(wǎng)絡(luò)的CD值發(fā)生了明顯的變化。圖2-4R1、R2和DNA網(wǎng)絡(luò)的圓二色譜對(duì)比。Figure2-4CirculardichroiccomparisonofR1,R2andDNAnetworks.將等量的R1和R2的pH值分別調(diào)至7.4和6.5，使用圓二色譜儀在220nm到300nm波長(zhǎng)的區(qū)間內(nèi)分別對(duì)R1、R2進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖2-5所示，pH值為7.4時(shí)，R1在269nm處觀察到最大值，R2在275nm處觀察到最大值。當(dāng)pH值降至6.5時(shí)，R1的CD峰值移動(dòng)到了277nm，R2的CD峰值則移動(dòng)到了280nm。R1和R2均發(fā)生了微弱的紅移，這是由于I-strand序列在H+的驅(qū)動(dòng)下形成了穩(wěn)定的具有pH響應(yīng)的I-motif結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其圓二色信號(hào)發(fā)生變化，這與已有文獻(xiàn)中的描述是一致的。圖2-5（A）R1在不同pH條件下的圓二色譜對(duì)比。（B）R2在不同pH條件下的圓二色譜對(duì)比。Figure2-5(A)CirculardichroiccomparisonofR1atdifferentpHconditions.(B)CirculardichroiccomparisonofR2atdifferentpHconditions.2.3.4水合粒徑表征采用動(dòng)態(tài)光散射（Dynamiclightscattering，DLS）測(cè)量RCA產(chǎn)物在不同pH下的粒徑，結(jié)果如圖2-6所示。在pH為7.4和6.5時(shí)，R1的水合粒徑分別為1210±40.5nm和883±11.8nm，R2的水合粒徑分別為1152±7.4nm和847±2.5nm，DNA網(wǎng)絡(luò)的水合粒徑分別為4482±17.7nm和1981±4.8nm。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，R1、R2、DNA網(wǎng)絡(luò)的水合粒徑均在pH為6.5時(shí)相對(duì)更小，再一次驗(yàn)證此RCA產(chǎn)物具有良好的酸響應(yīng)性。在相同pH條件下，對(duì)比三組水合粒徑數(shù)據(jù)，可以看出DNA網(wǎng)絡(luò)的水合粒徑明顯增大，表明了DNA網(wǎng)絡(luò)的成功組裝。圖2-6（A）R1處于不同pH環(huán)境中的水合粒徑對(duì)比圖。（B）R2處于不同pH環(huán)境中的水合粒徑對(duì)比圖。（C）DNA網(wǎng)絡(luò)處于不同pH環(huán)境中的水合粒徑對(duì)比圖。Figure2-6(A)ComparisonofparticlesizeofR1indifferentpHenvironments.(B)ComparisonofparticlesizeofR2indifferentpHenvironments.(C)ComparisonofparticlesizesofDNAnetworksindifferentpHenvironments.2.3.5掃描電子顯微鏡（SEM）表征使用掃描電子顯微鏡SEM對(duì)pH分別為6.5和7.4的DNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行表征。結(jié)果如圖2-7所示，DNA網(wǎng)絡(luò)作為一種多孔結(jié)構(gòu)的材料，在pH值為6.5的酸性環(huán)境下展現(xiàn)出更為緊密的團(tuán)聚形態(tài)。再次驗(yàn)證DNA網(wǎng)絡(luò)在酸性條件下具有良好的酸響應(yīng)性，能夠發(fā)生皺縮。因此，當(dāng)DNA網(wǎng)絡(luò)處于腫瘤微酸環(huán)境中時(shí)，它會(huì)發(fā)生收縮，進(jìn)而有利于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面受體的聚集，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。這一特性為DNA網(wǎng)絡(luò)在肝癌治療中的應(yīng)用提供了有力的支持。圖2-7（A）DNA網(wǎng)絡(luò)在pH為7.4時(shí)的SEM圖像。（B）DNA網(wǎng)絡(luò)在pH為6.5時(shí)的SEM圖像。Figure2-7(A)SEMimageofDNAnetworkatpH7.4.(B)SEMimageofDNAnetworkatpH6.5.2.3.6流變學(xué)測(cè)試?yán)肁RES-G2旋轉(zhuǎn)流變儀對(duì)DNA網(wǎng)絡(luò)的機(jī)械性能進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果如圖2-8所示，在時(shí)間掃描模式下，pH為7.4和pH為6.5的DNA網(wǎng)絡(luò)的G’（儲(chǔ)能模量）均大于G’’（損耗模量），證明了所合成的DNA網(wǎng)絡(luò)在這兩種pH條件下均具有水凝膠特性。與pH為7.4的DNA網(wǎng)絡(luò)相比，pH為6.5時(shí)DNA網(wǎng)絡(luò)的G’（儲(chǔ)能模量）與G’’（損耗模量）之間的差值更大，表明該DNA網(wǎng)絡(luò)在酸性條件下形成的凝膠結(jié)構(gòu)更為緊密，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有利于后續(xù)進(jìn)行的肝癌細(xì)胞受體聚集調(diào)控實(shí)驗(yàn)。圖2-8（A）pH為7.4DNA網(wǎng)絡(luò)的流變特性。（B）pH為6.5DNA網(wǎng)絡(luò)。Figure2-8(A)RheologicalpropertiesofDNAnetworkswithapHof7.4.(B)DNAnetworkswithapHof6.5.2.3.7探針?lè)€(wěn)定性考察為了探究復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境是否會(huì)對(duì)R1、R2和DNA網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，因此，我們?cè)谔骄考?xì)胞毒性前針對(duì)探針的生物穩(wěn)定性進(jìn)行考查，主要包括血清穩(wěn)定性和核酸酶穩(wěn)定性。結(jié)果如2-9所示，當(dāng)R1、R2分別與1%血清和核酸酶（1U/mL）孵育0h、12h、24h、36h、48h和60h后，與對(duì)照組相比，R1、R2各板上2-6泳道槽內(nèi)均無(wú)產(chǎn)物，表明R1、R2長(zhǎng)鏈已被降解成小分子。然而，DNA網(wǎng)絡(luò)的條帶的主要相對(duì)位置未發(fā)生改變，槽內(nèi)仍保留有產(chǎn)物，這表明DNA網(wǎng)絡(luò)具有良好的血清穩(wěn)定性和核酸酶穩(wěn)定性，為其復(fù)雜的體內(nèi)應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。圖2-9R1、R2、DNA網(wǎng)絡(luò)分別用1%FBS和1U/mLDNaseI在37℃下處理不同時(shí)間后產(chǎn)物的凝膠電泳分析。1-6泳道：代表探針?lè)謩e在1%FBS和1U/mLDNaseI中分別孵育0h、12h、24h、36h、48h、60h。Figure2-9TheproductsofR1,R2andDNAnetworkswereanalyzedbygelelectrophoresisaftertreatmentwith1%FBSand1U/mLDNaseIat37℃respectively.1-6lanes:indicatesthattheprobewasincubatedin1%FBSand1U/mLDNaseIfor0h,12h,24h,36h,48h,and60hrespectively.2.3.8細(xì)胞毒性HepG-2細(xì)胞同時(shí)高表達(dá)NCL和PTK7受體，因此選用作為研究目標(biāo)。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)，考察了DNA網(wǎng)絡(luò)對(duì)在不同pH條件下對(duì)于HepG-2細(xì)胞的毒性情況。結(jié)果如圖2-10所示，隨著探針濃度增加，細(xì)胞毒性逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞存活率逐漸降低