第一章緒論

一、生物技術(shù)的發(fā)展簡史

答：以技術(shù)特征來分可分為：傳統(tǒng)生物技術(shù)，近代生物技術(shù)，現(xiàn)代生物技術(shù)

1、傳統(tǒng)生物技術(shù)階段

遠古人們對微生物的利用，釀造技術(shù)

1680年發(fā)現(xiàn)了微生物、揭示了發(fā)酵現(xiàn)象的奧秘

19世紀末，20世紀30年代出現(xiàn)了工業(yè)發(fā)酵、開創(chuàng)了工業(yè)微生物的新時期

特點：生產(chǎn)過程簡單、生產(chǎn)設(shè)備要求低、產(chǎn)品多為結(jié)構(gòu)簡單的初級代謝產(chǎn)物

2、近代生物技術(shù)階段

1941年，開發(fā)研究青霉素

抗生素工業(yè)

氨基酸發(fā)酵工業(yè)20世紀50年代

酶制劑工業(yè)20世紀60年代

特點：產(chǎn)品類型多、生產(chǎn)技術(shù)要求高、生產(chǎn)設(shè)備規(guī)模巨大、技術(shù)發(fā)展速度快。

3、現(xiàn)代生物技術(shù)階段

1953年watson,crick.提出生命基本物質(zhì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型

1974年Boyer和Cohen建立了DNA重組技術(shù)

1975年，雜交瘤技術(shù)（抗體工程）

1977年，基因操作手段獲得生長激素抑制因子。胰島素等克隆。

1982年基因工程產(chǎn)品被投放市場。

2001年人類基因組草圖完成

特點：（1）基因操作技術(shù)日新月異（2）新技術(shù)新方法迅速應(yīng)用（3）基因工程藥物和疫苗研究開發(fā)快（4）新的生

物治療制劑產(chǎn)業(yè)化前景光明（5）轉(zhuǎn)基因動、植物取得重大突破（6）現(xiàn)代生物技術(shù)給農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)帶來飛躍（7）

重要基因的結(jié)構(gòu)和功能研究是今后的研究熱點（8）基因治療取得了大的進展（9）蛋白質(zhì)工程的發(fā)展（10）生物信

息學(xué)的發(fā)展

二、生物技術(shù)藥物的分類

答：1.生物技術(shù)制藥：采用現(xiàn)代生物技術(shù)、借助某些微生物、植物或動物來生產(chǎn)所需要的藥品。

2.生物技術(shù)藥物：采用DNA重組技術(shù)或其他生物新技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥物。

3.生物藥物：泛指包括生物制品在內(nèi)的生物體的初級和次級代謝產(chǎn)物或生物體的某一組成部分，甚至整個生物

體用作診斷和治療疾病的醫(yī)藥品。

4.生物藥物的分類（1）應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造的基因重組多肽、蛋白質(zhì)類治療藥物（2）基因藥物（3）動物、

植物和微生物的天然藥物（4）合成和部分合成的生物藥物。

按功能分類（1）治療藥物（2）預(yù)防藥物（3）診斷藥物。

三、生物技術(shù)制藥的特征：高技術(shù)，高投入，長周期，高風(fēng)險，高收益。

四、利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的兩個不同途徑：1.用克隆的基因表達生產(chǎn)有用的肽類和蛋白質(zhì)藥物或疫苗。2.利用基

因工程技術(shù)改造傳統(tǒng)的制藥工業(yè)。

第二章基因工程制藥

一、基因工程新藥：免疫性蛋白，細胞因子，激素，酶類。

二、基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點（簡答）：

1.利用基因工程技術(shù)可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（胰島素，干擾素，細胞因子等）。

2.可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和機構(gòu)進行深入的研究，從而擴大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍。

3.利用基因工程可以發(fā)現(xiàn)挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。

4,可以彌補內(nèi)源生理活性物質(zhì)藥物的不足，并對其進行改造。

5.利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。

三、目的基因的獲得

原核細胞（較易獲得目的基因）基因組較小，可直接分離獲得。

基因組一限制性內(nèi)切酶一水解成若干片段一探針篩選一提純一擴增

真核生物：一個單拷貝基因僅占整個基因組的10甚至更少，不易獲得。

構(gòu)建cDNA文庫一構(gòu)建基因文庫一人工合成一PCR擴增

DNA文庫：通過重組、克隆保存在宿主細胞中的各種DNA分子的集合體。文庫保存了該種生物的全部遺傳信息，

需要時可從中分離獲得。

如何構(gòu)建DNA文庫：

1.分離純化基因組DNA。條件應(yīng)溫和，以保證得到較長的DNA鏈。

2.DNA片段與載體連接?；蚪MDNA一酶水解一具一定長度的片段（粘性末端）

載體（噬菌體等）一酶解一與目的基因連接

3.導(dǎo)入宿主細胞：攜帶基因組DNA片段的噬菌體或粘粒經(jīng)包裝后轉(zhuǎn)入宿主細胞內(nèi)培養(yǎng)擴增。插入基因組片段的集

合體即基因組文庫。

4.篩選目的基因：原核細胞不可用來作為基因的表達系統(tǒng)（無轉(zhuǎn)錄后加工）。原核細胞基因庫只能用核算探針雜交

篩選目的基因。

cDNA文庫：以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。利用某種生物的總mRNA合成cDNA,再將這些cDNA

與載體連接，轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。

特點:（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細菌中直接表達。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫

小的多，容易構(gòu)建。

如何構(gòu)建cDNA文庫：cDNA以mRNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而成，故須選擇mRNA豐富、較易獲得的、目的基因表達

活躍的組織細胞為材料“

（1）修飾cDNA兩端接頭：人工合成的雙鏈寡核甘酸，二端均為平頭或含酶切位點。銜接頭：一端為平頭，一端

為粘末端。

（2）cDNA與載體相連各cDNA各自與一個載體在T4連接酶作用下以粘末端互相連接，即為重組DNA分子。

（3）導(dǎo)入宿主細胞重組體在一定條件下導(dǎo)入宿主細胞培養(yǎng)或保存。宿主細胞必須是來自一個細胞的克隆體，以保

證它們的遺傳性狀相同。

（4）篩選目的基因核酸雜交法：cDNA克?。ň呋蚴删撸┫跛崂w維素膜一雜交（DNA探針）一顯影定位一

挑選一培養(yǎng)擴增~純化。

四、目的基因序列測定法：

1、雙脫氧鏈終止法（Sanger法）

原理：DNA鏈中的戊糖在3'位碳原子上有-0H基團，在DNA合成、鏈的延長過程中，新?lián)饺氲拿撗鹾烁仕?'

-P與前一核甘酸的戊糖3'-0H以磷酸二酯鍵相連。

Sanger法是在反應(yīng)體系中加入2',3'-ddNTP,由于其沒有3'-0H而不能與下一個核甘酸相連，于是DNA鏈

的合成便終止。

2、化學(xué)裂解法（Maxam-Gilbert法）

原理：使特定的堿基首先被化學(xué)修飾，然后再經(jīng)化學(xué)處理。如：用硫酸二甲酯使鳥喋吟甲基化，然后再加哌啜，使

甲基化的鳥噪吟丟失，DNA鏈從鳥噤吟修飾處后的3',5'-磷酸二酯鍵斷裂。

3、自動測序儀測序法（ABI）

原理：自動測序儀基于2,3-雙脫氧末端終止法的原理，標記系統(tǒng)由放射性核素改為發(fā)特定熒光信號的熒光染料，

預(yù)先將四種熒光染料與四種雙脫氧核甘三磷酸共價相連，使其帶有不同的熒光標記。當(dāng)某一種ddNTP摻入到正在

合成的DNA單鏈分子中時，該鏈的延伸便終止并帶有相應(yīng)的熒光染料。

自動測序系統(tǒng)包括電泳分離系統(tǒng)、熒光檢測裝置、計算機成像系統(tǒng)及分析軟件組合。

其它大片序列測序方法：隨機克隆法（先水解再亞克?。?、限制性酶切片段亞克隆法、互套缺失法（定向連續(xù)次級

克?。?/p>

五、表達載體具備的條件：

1,載體能夠獨立地復(fù)制。

2,應(yīng)具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記。

3,應(yīng)具有很強的啟動子。

4,應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)受到誘導(dǎo)時才能進行轉(zhuǎn)錄。

5,應(yīng)具有很強的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其它無關(guān)的基因，同時很強

的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。

6,所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號。

六、常用的酵母啟動子：

【組成型工磷酸甘油酸激酚，烯醇醐，3-磷酸甘油醛脫氫醐，乙醉脫氫酶，磷酸三糖異構(gòu)醐，信息素-因子，細胞

色素-c。

【誘導(dǎo)型】：酸性磷酸酯酶，半乳糖激酶，UDP-D-半乳糖-4-差向酶。

七、大腸桿菌表達外源蛋白質(zhì)的優(yōu)缺點：

細胞質(zhì)中：優(yōu)點：1,形成包涵體。2,蛋白質(zhì)產(chǎn)量高。3,表達的鍵簡單。

缺點：1,形成包涵體。2,還原環(huán)境不利于二硫鍵的形成。3,N-末端真實性受影響。4,蛋白質(zhì)能解。

5,種類分離純化復(fù)雜。

細胞周質(zhì)：優(yōu)點：1,由于周質(zhì)蛋白質(zhì)種類少，純化簡單。2,蛋白質(zhì)酶解不甚嚴重。3,促進二硫鍵形成與蛋白質(zhì)

折疊作用。4,蛋白質(zhì)N-末端結(jié)構(gòu)真實。

缺點：1,信號肽并非總有助于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運。2,有可能形成包涵體。

細胞外：優(yōu)點：1，酶解作用程度低。2,容易純化。3,促進蛋白質(zhì)折疊作用。4,蛋白質(zhì)N-末端結(jié)構(gòu)真實。

缺點：1,大腸桿菌中表達真實的外源蛋白質(zhì)不會分泌到細胞外。2,分泌在細胞內(nèi)的稀釋，分離純化相當(dāng)

復(fù)雜。

融合蛋白：真核基因在大腸桿菌中表達時，產(chǎn)生的一種氨基端是原核序列，竣基端是真核序列，由一條短的原核多

肽和真核蛋白結(jié)合在一起的蛋白。

八、人胰島素的生產(chǎn)方法：簡答胰組成結(jié)構(gòu)通過什么方式

九、大腸桿菌表達中遇到的問題：

1,內(nèi)含子mRNA酶系錯誤產(chǎn)物。

2,轉(zhuǎn)錄信號不同。

3,分子結(jié)構(gòu)。

4,真核蛋白質(zhì)分離加工。

5,降解。

十、基因工程菌遺傳的不穩(wěn)定性的表現(xiàn)：

1.結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失，重排，修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失。

2,分配不穩(wěn)定性：整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸。

十一、基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機制（導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定性的原因）：

1,受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解。

2,外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝。

3,重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時的不均勻分配。

4,受體細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排。

十二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法：

選擇合適的宿主菌。選擇合適的我體。選擇壓力。分階段控制培養(yǎng)?？刂婆囵B(yǎng)條件。固定化。

一些基因重組菌在復(fù)合培養(yǎng)基中顯示較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性。

十三、基因工程菌的培養(yǎng)方式：

1,分批培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間后，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生

長的培養(yǎng)方法。

2,連續(xù)培養(yǎng)：是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達一定程度后，開動進料和出料蠕動泵，以一定

稀釋率進行不間斷培養(yǎng)。

3,透析培養(yǎng)：是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除

其對生產(chǎn)菌的不利影響。

4,固定化培養(yǎng)：基因工程菌經(jīng)過固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進行連續(xù)培養(yǎng)，對分泌型菌更為有利。

十四、培養(yǎng)基常用碳源：葡萄糖，占油，乳糖，甘露糖，果糖。

氮源：酵母粉，蛋白豚，酪蛋白水解物，玉米漿，氨水，硫酸銹，氯化鏤

不同的碳源對菌體生長和外源基因表達有較大影響：使用葡萄糖和甘油菌體比生長速率和呼吸強度相差不大。葡萄

糖對lac啟動子有抑制作用。用甘露糖做碳源不產(chǎn)生乙酸。乳糖啟動子使用乳糖作碳源較為有利，乳糖同時還起誘

導(dǎo)作用。

無機磷的影響：過量的無機磷會刺激葡萄糖的利用、菌體生長和氧消耗。在低磷濃度下，盡管最大菌體濃度較低，

但產(chǎn)物比產(chǎn)率及產(chǎn)物濃度都最高。啟動子只有在低磷酸鹽的情況下才被啟動。

溫度的影響：溫度對基因表達調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯或小分子調(diào)節(jié)分子合成水平上.

大腸桿菌合成青霉素酰化酶不僅受苯乙酸誘導(dǎo)和葡萄糖調(diào)控，而且受溫度調(diào)控。是由于影響了細胞內(nèi)青霉素?；?/p>

酶mRNA的濃度。

十五、如何建立基因工程菌分離工藝

一、建立分離純化工藝需了解的各種因素：

1,含目的產(chǎn)物的起始物料的特點。1）菌種類型及其代謝特性。2）原材料和培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量。3）生產(chǎn)工藝

和條件。4）初始物料的物理化學(xué)和生物學(xué)特性。

2,物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。

3,目的產(chǎn)物特性

4,產(chǎn)品質(zhì)量的要求。

二、分離純化的基本過程：細胞破碎，固液分離，濃縮與初步純化，高度純化直至得到成品，成品加工。

細胞破碎的方法：機械法-非機械法；物理法（勻漿法、珠磨法、超聲法），化學(xué)法（滲透沖擊、增容法），生物法

（酶溶法）。

固液分離常用方法：離心沉淀，膜過濾，雙水相萃取。

三、選擇分離純化方法的依據(jù)：

1根據(jù)產(chǎn)物表達形式來選擇。

2根據(jù)分離單元之間的銜接選擇。應(yīng)盡早采用高效分離手段，將含量最多的雜質(zhì)先分離去除，將最昂貴最費時的分

離單元放在最后階段。色譜分離次序的選擇同樣重要，經(jīng)鹽析后的液體不適宜于離子交換層析，但對疏水層析則可

直接應(yīng)用。離子交換、疏水及親和色譜通?？梢云鸬降鞍踪|(zhì)的濃縮的效應(yīng)。親和層析選擇性最強，多放在第二步以

后。

3根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇

1）應(yīng)具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。2）盡可能減少組成工藝的步驟。3）組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要能相互適

應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝和設(shè)備相適應(yīng)。4）在工藝過程中盡可能少用試劑，尤其是對穩(wěn)定性差的產(chǎn)物。5）分離純化工藝所

用的時間盡可能短，尤其是對穩(wěn)定性差的產(chǎn)物。6）工藝和技術(shù)必須是高效，收率高，易操作，對設(shè)備條件要求低,

能耗低。7）具有較高的安全性。

四、分離純化的技術(shù)要求：1技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性。2選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中

有效的將目的產(chǎn)物分離出來，達到較高的純化倍數(shù)。3收率要高。4兩個技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對物料加

以處理或調(diào)整。5整個分離純化過程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。

十七、包含體的分離、溶解和復(fù)性：

細胞破碎一固液相分離一去污劑或低濃度尿素或鹽酸呱去除可溶性蛋白和膜蛋白一高濃度尿素或鹽酸呱溶解包含

體，DTT打開二硫鍵~逐步透析或稀釋去除變性劑。

常用的蛋白質(zhì)、醯和重組蛋白質(zhì)純化技術(shù)

分離原理分離方法特點用途

分解率適中；分級分離對潦速較分級分離、適于脫鹽，大娓模婉

慢循環(huán)）、脫鹽時流速快化的最后一步、用于去除金質(zhì)的

分子大小凝膠過海

（3加in/循環(huán)）：容量受限于樣聚含體；脫然可用于任何階段、

品體積特別是步磬銜接時的緩沖液更操

分辨率通常較高；漉速較快（合最適于早即觸化，即大體積樣品

電荷離子交換適的填料）；容量很大,樣品體且膏白純度較低時使用

積不受限

分腳率較高；流速快：容置很大

等電點色譜聚集純化最后階段

樣品體積不受限

適于任何階耗，特知適于樣品離

分辨率較高；流速大?容量大,

疏水作用于強度較高,如沉淀，離子交換

樣品體積不受限

疏水特性后

適于最后階段；特我適于分子量

反相分辨率較高；流速很怏：容量大

較小的肽

生物親和分辨率極高；流速大；容量大，適于任何階段，特別是樣品濃度

親和

性律品體積不限小、雜質(zhì)含量多時使用

第三章動物細胞工程制藥

一、如何選擇培養(yǎng)基（簡答題）：培養(yǎng)基的基本要求：營養(yǎng)成分，促生長因子，激素，滲透壓，PH,無毒無污染。

1建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是這種細胞首選的培養(yǎng)基，查閱參考文獻，根據(jù)細胞株建議的培養(yǎng)基。

2根據(jù)細胞株的特點和實驗要求選擇培養(yǎng)基。

3用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇效果

好的。

二、天然培養(yǎng)基：血清：

成分：由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種多肽，脂肪，碳水化合物，生長因子，激素，無機物等。

作用：1提供基本營養(yǎng)物質(zhì)。2提供激素和各種生長因子。3提供結(jié)合蛋白。4對培養(yǎng)基中的細胞起到某些保護作用。

質(zhì)量標準：取材對象。取材過程。促生長效果?？寺⌒纬陕?。貼瓶率測定。續(xù)傳代培養(yǎng)。

外觀：透明清亮，土黃或棕黃色。無沉淀或極少。渾濁沉淀多一蛋白質(zhì)變性。棕紅色一取材時有溶血現(xiàn)象。液體稀

薄一摻入生理鹽水過多。

三、合成培養(yǎng)基：人工設(shè)計，配制的培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基：優(yōu)點是成分明確，組分穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)。氨基酸、維生素、糖類、無機鹽、其他成分（酚紅指示劑）。

無血清培養(yǎng)基：即不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間繁殖的合成培養(yǎng)基。HamF12與DMEM1：1混

合。優(yōu)點是1提高了細胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了血清批次之間差異的影響。2減少了有血清帶來的病毒真菌支原

體等微生物污染的危險。3供應(yīng)充足，穩(wěn)定。4細胞產(chǎn)品易于純化。5避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性。6

減少了血清中蛋白對某些微生物測定的干擾，便于對實驗結(jié)果的分析。

無蛋白培養(yǎng)基：不含有動物蛋白的培養(yǎng)基

限定化學(xué)成分培養(yǎng)基：指培養(yǎng)基中所有成分都是明確的

平衡鹽溶液：由無機鹽，葡萄糖組成。維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。用于取材時組織塊

的漂洗、細胞的漂洗、配制其它試劑。

消化液：用于取材進行原代培養(yǎng)時需要將組織塊消化解離形成細胞懸液。傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消

化下來。EDTA溶液（破壞細胞間的連接），膠原酶溶液（上皮類細胞原代培養(yǎng)時使用），胰酶溶液（消化酪蛋白）

添加的抗生素：青霉素（革蘭陽性菌），鏈霉素（革蘭陰性菌）

細胞營養(yǎng)污染的原因途徑：空氣，器材，操作，血清，組織樣本。

污染補救措施：抗生素排除法（有價值的細胞），加溫除菌（支原體污染），動物體內(nèi)接種（腫瘤細胞），與巨噬細

胞共培養(yǎng)

第四章抗體制藥

單克隆抗體：將抗體產(chǎn)生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細

胞成為純一的單克隆細胞體系，此細胞系能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體。是針對一個抗原決定簇的抗

體，又是單一一的B淋巴細胞產(chǎn)生的，故稱單克隆抗體。（高度特異性，均一性，有穩(wěn)定來源可大量生產(chǎn)）

B淋巴細胞及特點：

三.骨髓瘤細胞及特點：

四.利用HAT篩選機理：1體內(nèi)合成DNA兩途徑（主要旁路）2HAT中有氨基蝶吟，抑制主要途徑，可以利用

另兩個成分旁路合成DNA,正常的B細胞有旁路途徑，而腫瘤細胞沒有旁路途徑，B細胞與腫瘤細胞融合后

有B細胞的旁路途徑，比B細胞長命，所以可以存活。

五.人-鼠嵌合抗體：在基因水平上把鼠源性單克隆