小建中制劑中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮素殘留量研究[摘要]目的：建立小建中制劑中赭曲霉毒素A（OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜方法，并用該方法對160批樣品進行污染分析。方法：樣品經(jīng)70%甲醇溶液超聲輔助提取后，提取液采用OasisHLB3cc（60mg）萃取小柱凈化，流動相為（A）0.1%甲酸-水和（B）乙腈-甲醇（6:4），使用WatersCORTECSUPLCC18色譜柱（1.6μm，2.1×100mm）進行分離，并以0.25mL/min的流速進行操作。電噴霧離子源（ESI）被選擇作為實驗的主要工具。在MRM的多反應(yīng)監(jiān)控模型中，同步采集正、負離子的數(shù)據(jù)；利用基質(zhì)外標法來實現(xiàn)數(shù)值的精確度。結(jié)果：OTA和ZEN在0.1~20μg/mL內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.997，平均加樣回收率83.7%~108.6%，RSD1.5%~8.6%；均有基質(zhì)減弱效應(yīng)。160批樣品中檢出赭曲霉毒素A共18批，玉米赤霉烯酮共40批，檢出率分別為11.3%和25.0%。結(jié)論：該方法簡單、準確、可靠，適用于小建中制劑等中藥制劑中OTA和ZEN的污染研究。[關(guān)鍵詞]小建中制劑；赭曲霉毒素A；玉米赤霉烯酮；LC-MS/MS法；炙甘草；糊精 StudyonochratoxinAandzearalenoneresiduesinXiaojianzhongpreparation[Abstract]Objective:AHPLC/MSmethodforochratoxinA(OTA)andzenalenone(ZEN)inXiaojianZhongpreparationwasestablishedand160batchesofsampleswereanalyzedbythismethod.Method:Thesampleswereultrasonicallyextractedwith70%methanolsolution.OasisHLB3cc(60mg)extractioncolumnwasusedforpurification.Themobilephaseswere(A)0.1%formic-waterand(B)acetonitrile-methanol(6:4).WatersCORTECSUPLCC18column(1.6μm)wasused.2.1×100mm)wereseparatedandoperatedataflowrateof0.25mL/min.Anelectrosprayionsource(ESI)waschosenasthemaintoolfortheexperiment.Inthemulti-reactionmonitoringmodelofMRM,thedataofpositiveandnegativeionsarecollectedsimultaneously.Thenumericalaccuracyisachievedbyusingmatrixexternalscalingmethod.Results:ThelinearrelationshipbetweenOTAandZENwasgoodin0.1-20μg/mL,thecorrelationcoefficients(r2)weregreaterthan0.997,theaveragerecoverieswere83.7%-108.6%,andtheaveragerecoverieswere1.5%-8.6%.Bothhadmatrixweakeningeffect.Amongthe160samples,18batchesofochratoxinAand40batchesofzearalenoneweredetected,therateswere11.3%and25.0%respectively.Conclusion:Themethodissimple,accurateandreliable,andissuitableforthestudyofOTAandZENcontaminationintraditionalChinesemedicinepreparationssuchasXiaojianzhongPreparation.[Keywords]Xiaojianzhongpreparation;OchratoxinA;Zearalenone;LC-MS/MSmethod;Roastedlicorice;dextrin目錄TOC\o"1-3"\h\u229501文獻綜述 引言近年來，中藥的藥效逐漸被人們所認識和重視，但其安全性問題也日益引起人們的關(guān)注。中藥材在生長、采集、貯藏、制備、運輸?shù)冗^程中，可能會受到各種外源有害殘留物的污染，其中真菌毒素殘留是一個非常重要的影響因素。真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的一系列有毒代謝產(chǎn)物，它們可以通過多種途徑進入中藥材中，這些真菌毒素具有不同的毒性，可以對人體造成多種危害，例如損害肝臟、腎臟等器官，引起免疫系統(tǒng)異常等。有許多文獻報道顯示中藥制劑中存在赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮等真菌毒素的污染。這些污染物的存在不僅影響了中藥材的質(zhì)量，也嚴重影響了中藥的安全性和符合率。因此，建立高效、迅速、精確的多種真菌毒素殘留檢測方法對于確保中藥的質(zhì)量和安全性至關(guān)重要。為了解決這個問題，科研機構(gòu)和制藥企業(yè)需要加強合作，共同研發(fā)更加先進、高效的真菌毒素殘留檢測方法。同時，中藥材的種植、采集、貯藏、制備、運輸?shù)冗^程也需要加強管理和監(jiān)控，確保中藥材的質(zhì)量和安全性。除此之外，公眾也需要提高對中藥安全性的認識和重視。在選擇中藥產(chǎn)品時，應(yīng)該選擇正規(guī)渠道購買，注意查看產(chǎn)品的產(chǎn)地、生產(chǎn)日期、規(guī)格等信息，避免購買來源不明、質(zhì)量不可靠的產(chǎn)品。同時，在使用中藥產(chǎn)品時，也應(yīng)該按照說明書上的用法用量使用，避免出現(xiàn)不良反應(yīng)。小建中制劑包含四種不同的劑型，分別是片劑、合劑、膠囊劑和顆粒劑，是臨床常用的經(jīng)典中藥復(fù)方制劑。這些復(fù)方制劑具有溫中補虛和緩急止痛的功效，并被收錄于《中國藥典》2020年版中。小建中制劑由桂枝、白芍、炙甘草、生姜和大棗等五種藥物組成。制備過程繁瑣，中藥成分易受到真菌污染，這些真菌性質(zhì)穩(wěn)定，耐高溫，難以在加工過程中被破壞，導致毒素產(chǎn)生并污染小建中制劑。因此，為了滿足當前對于中藥材及其中藥制劑中真菌毒素殘留檢測的需求，建立一種高效、高通量、低成本的檢測體系顯得尤為迫切。這樣的檢測體系不僅可以提高檢測效率，降低檢測成本，還能夠滿足大批量樣品的快速篩查和精確定量分析的需求。故本課題計劃采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，檢測制劑中的赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮殘留量，并對市場上流通的制劑質(zhì)量進行評估，以提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)支撐，確保制劑的安全性，為藥品安全護航。1文獻綜述1.1中藥制劑中真菌毒素的污染現(xiàn)狀中藥是中華民族的文化瑰寶，是歷年來醫(yī)療實踐的結(jié)晶，由于人們生活水平顯著提高，自身的健康問題越來越受到注重，中藥產(chǎn)品也被廣泛使用。中藥在發(fā)揮預(yù)防疾病、保健養(yǎng)生作用的同時，由此引發(fā)的安全問題也日益引起人們的重視。尤其以真菌毒素為主要代表的外源性有害物質(zhì)嚴重影響到藥材的質(zhì)量和用藥安全[1]。中藥材中的真菌毒素主要來源于種植、采集、加工、儲存、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)，這些環(huán)節(jié)難以避免真菌毒素的產(chǎn)生，給中藥及其制劑帶來了安全隱患。中藥制劑主要是通過將中藥材加工成粉末直接入藥或提取制劑，這兩種方式可能導致原料藥材中的真菌毒素轉(zhuǎn)移至制劑中，若儲存不當，粉末入藥的制劑會進一步累積風險。目前已發(fā)現(xiàn)的真菌毒素中有400多種，其中重點關(guān)注的真菌毒素包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（俗稱嘔吐毒素）、伏馬菌素等[2]。這些毒素具有引發(fā)癌癥、致畸、致突變等嚴重危害。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織的報告[3]，全球每年約有25%的農(nóng)產(chǎn)品受到真菌毒素污染，給經(jīng)濟帶來的直接損失可達數(shù)千億美元。研究人員在探究植物藥、動物藥及其制劑時，發(fā)現(xiàn)了多種真菌毒素的污染現(xiàn)象[4-5]。具體來說，某些藥材如炙甘草、黃芪和豆蔻，容易受到赭曲霉毒素的影響[6-9]；而瓜蔞皮、薏苡仁、玉米及其制品則較易被玉米赤霉烯酮污染[10-15]。另外，含油量較高的種子和動物藥材容易受到黃曲霉毒素的侵擾。值得關(guān)注的是，中藥材中的真菌毒素污染可能會在加工成中成藥的過程中傳遞。這種傳遞程度受到毒素特性和生產(chǎn)工藝的影響。例如，在分析小兒七星茶顆粒的生產(chǎn)過程中，如果使用了大量受玉米赤霉烯酮污染的薏苡仁和稻芽作為原料，那么最終的產(chǎn)品中也能檢測到該毒素。近年來，一些研究團隊已經(jīng)開始對土鱉蟲、瓜蔞皮、肉豆蔻等中藥材[16-19]進行污染機制的研究，并成功分離出產(chǎn)毒菌株，揭示了具體的污染環(huán)節(jié)和關(guān)鍵的影響因素[20]。然而，目前對于大多數(shù)中藥中真菌毒素的污染機制仍然知之甚少，迫切需要進行更廣泛和深入的研究[21]。1.2中藥制劑中真菌毒素的檢測方法由于中藥材及其制劑中受真菌毒素污染后難以徹底去除，即便在極低濃度也會對人們的健康造成損害。因此，對真菌毒素的分析和檢測已引起相關(guān)部門和研究學者的重視[22]。《中國藥典》2020年版四部通則“2351真菌毒素測定法”對黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、分別制定了相應(yīng)的檢測方法，同時還收載了多種真菌毒素的檢測方法[23]。目前真菌毒素的檢測方法分類較多，按照應(yīng)用場景進行分類，可分為快速篩查類、現(xiàn)場監(jiān)測類和實驗室分析類等。采用ELISA法、免疫層析等技術(shù)對早期大規(guī)模樣本進行快速篩查。ELISA法原理是活性抗原-抗體-酶的免疫吸附，同時底物在酶的作用下被催化為有色產(chǎn)物，通過分光光度法進行測量，既能夠快速檢測又能對真菌毒素進行初步定量[24-25]。免疫層析法是當樣品和標記探針混合物在層析作用下于試紙條上移動時，樣品中相應(yīng)的抗體（或抗原）與膜上對應(yīng)的抗原（或抗體）發(fā)生特異性結(jié)合并富集，并在試紙條上顯示出探針標記物的信號，進而實現(xiàn)對目標物的定性定量分析[26-28]?，F(xiàn)場監(jiān)測類檢測方法應(yīng)用于樣品生產(chǎn)、存儲環(huán)節(jié)的原位、在線監(jiān)測，多用在糧食作物方面，也可用于中藥材及飲片等產(chǎn)品中，囊括光譜分析法和傳感器分析法等。近年來真菌毒素的光譜檢測技術(shù)以其特有的重現(xiàn)性好、無需預(yù)處理且檢測快速等優(yōu)勢已成為研究熱點，尤其近紅外光譜法、熒光光譜法和拉曼光譜等分子光譜展現(xiàn)了巨大的潛力和優(yōu)勢。傳感器分析法通過固態(tài)傳感器檢測污染食品釋放的揮發(fā)性真菌毒素，該技術(shù)多運用于赭曲霉毒素、黃曲霉毒素和其產(chǎn)毒真菌的檢測研究[29-33]。實驗室分析類檢測方法擬采用薄層色譜（TLC）、氣相色譜（GC）、液相色譜（LC）及與質(zhì)譜（MS）聯(lián)用等方法。TLC法耗時短，是一種快速、簡便、經(jīng)濟的方法，它采用了一種多功能的純化塔來降低對霉菌毒素的干擾，可以達到對各種真菌毒素的同時測定。隨著其他方法逐漸興起，此方法檢測精度遠不如其他方法，現(xiàn)多用于定性分析[34]。GC法適合用于具有一定揮發(fā)性的真菌毒素的檢測，由于大部分真菌毒素在氣相分析中不易氣化，需要通過衍生化方法，而衍生化等處理過程耗時復(fù)雜的問題也限制了此法在真菌毒素檢測方面的應(yīng)用[35]。LC-MS/MS法由于其具有高靈敏度和選擇性，且可通過同時定量多種真菌毒素的特點，成為微量真菌毒素分析的方法。利用全掃模式下采集高質(zhì)量準確度、高質(zhì)量分辨率的全掃描數(shù)據(jù)，確切到質(zhì)量數(shù)與保留時間、同位素強度、同位素分布等信息結(jié)合，確認復(fù)雜基質(zhì)中的化合物，從而實現(xiàn)在無標準品下真菌毒素的快速篩查[36-41]。 2小建中制劑中OTA和ZEN的檢測方法研究2.1儀器和試藥表1儀器和設(shè)備信息序號儀器名稱型號廠家1高效液相色譜儀LC-20A日本SHIMADZU公司2三重四級桿質(zhì)譜儀TripleQuad5500美國ABSciex公司3高速低溫離心機X1R美國ThermoFisherScientific公司4渦旋混合器Talbous美國Talboys公司5數(shù)控超聲波清洗器KQ-500DE昆山市超聲儀器有限公司6天平儀MS204S瑞士MettlerToledo公司7純水儀A10美國millipore公司表2試劑信息序號試劑名稱純度級別廠家1赫曲霉毒素A大于99%/新加坡Pribolab公司2玉米赤霉烯酮大于99%/新加坡Pribolab公司3甲醇/色譜純美國Honeywell公司4乙腈/色譜純美國Honeywell公司5甲酸/色譜純中國麥克林公司6超純水//實驗室提供7HLB3cc（60mg）萃取小柱Oasis?/IreiandWaters公司2.2樣品信息2023年中藥國抽小建中系列品種，共收集四種劑型分別為合劑共67批、顆粒劑共54批、片劑共14批、膠囊劑共25批；共計160批。詳見圖1。圖1中藥國抽小建中樣品劑型與批數(shù)2.3溶液的配制2.3.1標準儲備液、中間液的配制標準儲備溶液：精密稱取一定量的赭曲霉毒素A（OTA）和玉米赤霉烯酮（ZEN）兩種真菌毒素標準品置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度均為100μg/mL的標準儲備溶液，于-18℃下避光保存?；旌蠘藴手虚g溶液：精密吸取0.1mL的OTA標準儲備溶液、0.2mL的ZEN標準儲備溶液于10mL容量瓶中，配成以O(shè)TA的質(zhì)量濃度為100ng/mL和以ZEN的質(zhì)量濃度為200ng/mL的混合標準中間液A；再精密吸取1mL的混合標準中間液A于10mL容量瓶中以O(shè)TA的質(zhì)量濃度為10ng/mL和以ZEN的質(zhì)量濃度為20ng/mL的混合標準中間液B；兩組混合標準中間液均用甲醇稀釋定容，于-18℃下避光保存。2.3.2標準工作溶液的配制精密吸取“2.3.1”中一定量的混合標準中間液A、B，配制以O(shè)TA的質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、1、2、5、10ng/mL的系列混合標準工作溶液；以ZEN的質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.8、2、4、10、20ng/mL的系列混合標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。2.3.3樣品前處理取1克樣品（準確到0.01克），精密添加70%的甲醇溶液10ml，超聲波30分鐘，離心8000r/min,5min，精密量出1mL上清液，加水稀釋到2mL，搖動均勻。慢慢地流過已處理的HLB柱（3cc,60毫克，在使用之前，按順序用甲醇和水3mL進行洗脫），直到有足夠的氣體經(jīng)過，將洗脫液丟棄，然后用3mL甲醇洗脫，采集洗脫液，在40℃氮氣下慢慢地干燥，加入50%乙腈溶液，將其定容到1mL，然后用0.22μm的有機微孔濾膜進行過濾，然后用HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜法分析測定。2.4儀器條件2.4.1色譜條件色譜柱為WatersCORTECSUPLCC18(1.6μm，2.1×100mm)；流動相A為0.1%甲酸-水，流動相B為甲醇-乙腈（2:3）；流速為0.25mL/min；柱溫為40℃；進樣量為10μL；梯度洗脫順序見表3。表3梯度洗脫順序時間（min）A相（%）B相（%）0.50~1.0070301.00~2.0055452.00~2.5040602.50~4.5030704.50~7.0020807.00~9.0010909.00~9.1010909.10~11.00010011.00~11.10010011.1070302.4.2質(zhì)譜條件電離模式：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正、負離子模式同時掃描；通過多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)模式完成定量檢測。質(zhì)譜參數(shù)見表4-6。表4正離子模式質(zhì)譜參數(shù)條件：氣簾氣(CUR)碰撞活化參數(shù)(CAD)離子噴霧電壓(IS)離子化溫度(TEM)霧化氣1(GS1)霧化氣2(GS2)30kPa6kPa5500V450℃40kPa60kPa表5負離子模式質(zhì)譜參數(shù)條件：氣簾氣(CUR)碰撞活化參數(shù)(CAD)離子噴霧電壓(IS)離子化溫度(TEM)霧化氣1(GS1)霧化氣2(GS2)30kPa6kPa-4500V450℃40kPa60kPa表6OTA和ZEN質(zhì)譜參數(shù)真菌毒素英文名稱ESI(+/-)母離子(m/z)子離子(m/z)去簇電壓(V)碰撞能量(ev)OTAOchratoxinAESI+404.0239.1*/358.373.7/60.933.6/20.3ZENZearalenoneESI-317.1174.9*/273.2-149.0/-150.1-31.3/-25.52.5定性與定量本次實驗中，2種真菌毒素需要做到同時定性與定量測定。其中，定性需要滿足以下四個條件:(1)空白實驗中不出現(xiàn)與陽性對照品相同的離子峰；(2)特征離子的色譜峰信噪比(S/N)均需要在3:1以上；(3)試樣色譜峰保留時間應(yīng)與校正溶液保持一致,容許產(chǎn)生的±2.5%的偏差；(4)檢測到的離子豐度比應(yīng)與校正溶液保持一致,容許偏差需要在歐盟2002/657/EC規(guī)定的要求中。定量方法選用外標法，用空白樣品基質(zhì)溶液配制系列標準溶液，與未知試樣平行進行檢測。不同濃度等體積的標準品進樣，以峰面積值對樣品濃度繪制成標準工作曲線，推算出未知試樣中被測組分濃度。2.6方法學考察2.6.1線性方程、檢出限和定量限取藥用小建中四種劑型的陰性基質(zhì)樣品，按照“2.3.3”進行前處理后，得基質(zhì)提取液為基質(zhì)溶劑，50%的乙腈溶液為空白溶劑，按照“2.3.2”配制基質(zhì)溶液標準工作曲線和空白溶液標準工作曲線，按“2.2”儀器條件在計算機上進行測定。橫軸（x）為質(zhì)量濃度，縱軸（y）為目的組分峰面積，由此畫出標準曲線，根據(jù)3倍信噪比(S/N≥3)確定方法檢出限(LOD)，以10倍信噪比（S/N≥10）確定定量限(LOQ)，結(jié)果得四種劑型中OTA和ZEN存在較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）都在0.997以上，檢出限(LOD)為1~2μg/kg，定量限(LOQ)為4~8μg/kg。OTA和ZEN的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限結(jié)果見表7和表8。表7四種劑型中OTA和ZEN的基質(zhì)溶液線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)r2檢出限、定量限劑型毒素基質(zhì)溶液線性回歸程線性范圍（μg/L）相關(guān)系數(shù)r2檢出限（μg/kg）定量限（μg/kg）合劑OTAy=700117x-1011500.1~100.999914ZENy=53720x-2121000.2~200.999328顆粒劑OTAy=306079x-203930.1~100.998914ZENy=11836x+5979.40.2~200.998928片劑OTAy=182214x+582500.1~100.998914ZENy=5294.3x+2670.60.2~200.999228膠囊劑OTAy=189334x+717790.1~100.999514ZENy=5061.7x+114080.2~200.999428表8四種劑型中OTA和ZEN的空白溶液線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)r2檢出限、定量限劑型毒素空白溶液線性回歸方程線性范圍(μg/L）相關(guān)系數(shù)r2檢出限（μg/kg）定量限（μg/kg）合劑OTAy=911181x＋1319440.1~100.997914ZENy=136810x＋242550.2~200.998928顆粒劑OTAy=435896x＋270590.1~100.999514ZENy=77007x-4406.600.2~200.999628片劑OTAy=767963x+5811900.1~100.998914ZENy=109283x+9798.40.2~200.998928膠囊劑OTAy=376728x+201370.1~100.999614ZENy=57676x+4577.70.2~200.9994282.6.2基質(zhì)效應(yīng)評價以“2.3.2”中制備的不同濃度的混合標準工作溶液，分別用50%乙腈溶液和“2.3.3”法制成的樣品基質(zhì)溶液定容，制備標準工作曲線，考察基體對光譜信號的影響，通過基質(zhì)溶液配制的標曲斜率和空白溶劑配制的標曲斜率的之比(SSE)進行計算，當SSE值在80%~120%范圍內(nèi)，基本不考慮基體的影響。從結(jié)果可見，四種劑型的基質(zhì)效應(yīng)為4.3%~71.1%，表示四種劑型中的OTA和ZEN均存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，故在LC-MS/MS中采用基體標樣對樣品進行校正，可以彌補基體影響，提供定量分析的準確性。樣品基質(zhì)溶液和空白溶劑的線性回歸方程、SSE值可以通過下面的公式計算，結(jié)果見表9。SSE%=基質(zhì)溶液標準曲線斜率表9基質(zhì)溶液和空白溶液中OTA和ZEN的線性回歸方程、SSE值劑型毒素基質(zhì)溶液線性回歸方程空白溶液線性回歸方程SSE值（%）合劑OTAy=700117x-10115y=911181x+13194471.1ZENy=53720x-212100y=136810x+24255054.0顆粒劑OTAy=306079x-20393y=435896x+27059070.2ZENy=11836x+5979.4y=770007x-4406.6015.6片劑OTAy=182214x+58250y=767963x+58119024.6ZENy=5294.3x+2670.6y=109283x+9798.44.3膠囊劑OTAy=189334x+71779y=376728x+2013777.7ZENy=5061.7x+11408y=57676x+4577.709.22.6.3方法精密度按2.3.3法配制成小建中制劑四種劑型的陰性基質(zhì)溶液，同一份基質(zhì)溶液中加入OTA濃度為1ng/mL；ZEN濃度為2ng/mL的混合標準液，連續(xù)進樣6次。實驗結(jié)果得出四種劑型中OTA和ZEN的峰面積RSD為1.2%~8.8%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表10。表10四種劑型中OTA和ZEN的精密度劑型合劑顆粒劑片劑膠囊劑毒素OTAZENOTAZENOTAZENOTAZEN峰面積18.63E+052.75E+051.48E+061.09E+063.34E+033.36E+054.02E+041.12E+04峰面積28.65E+052.55E+051.46E+061.13E+063.39E+033.26E+053.94E+041.10E+04峰面積38.51E+052.61E+051.44E+061.12E+063.12E+033.26E+053.85E+041.17E+04續(xù)表10劑型合劑顆粒劑片劑膠囊劑毒素OTAZENOTAZENOTAZENOTAZEN峰面積48.76E+052.60E+051.45E+061.15E+062.81E+033.11E+053.69E+041.06E+04峰面積58.43E+052.46E+051.47E+061.26E+063.12E+033.06E+053.82E+041.08E+04峰面積68.72E+052.34E+051.48E+061.21E+062.73E+033.06E+053.54E+041.20E+04平均值8.62E+052.55E+051.46E+061.16E+063.09E+033.19E+053.81E+041.12E+04RSD%1.55.51.25.48.84.04.64.82.6.4方法準確度向空白樣品中加入OTA和ZEN的標準溶液，配制成低、中、高三種不同濃度水平，每個濃度水平分別進行3次平行實驗，按照“2.3.3”實驗步驟進行方法處理。加標回收試驗的平均回收率結(jié)果及其相對標準偏差（RSD）如表11所示，OTA和ZEN的回收率穩(wěn)定在83.7%~108.6%之間，RSD為1.5%~8.6%。表11四種劑型中OTA和ZEN回收率及其相對標收準偏差劑型毒素添加水平(μg/kg)回收率（%）RSD(%)劑型毒素添加水平(μg/kg)回收率（%）RSD(%)合劑OTA20102.54.4片劑OTA2083.71.54089.77.74087.53.820086.75.920084.06.1ZEN4082.910.5ZEN4092.24.98082.05.88097.42.040080.60.740093.57.0顆粒劑OTA20107.05.2膠囊劑OTA20104.88.64090.94.440108.61.820080.921.620093.92.8ZEN4098.49.3ZEN40104.23.68082.69.180107.76.340080.13.840091.22.12.6.5方法穩(wěn)定性考察四種劑型中OTA和ZEN于不同時段的檢測結(jié)果；按“2.3.3”法配制成小建中制劑四種劑型的陰性基質(zhì)溶液，同一份基質(zhì)溶液中加入OTA濃度為2ng/mL；ZEN濃度為4ng/mL的混合標準液，于0、2、4、8、12、24、36、48h分別進樣檢測，考察48h內(nèi)穩(wěn)定性。實驗結(jié)果得出OTA和ZEN的峰面積RSD值1.8~8.6%之間，在48h內(nèi)OTA和ZEN均較為穩(wěn)定。結(jié)果見表12。表12OTA和ZEN的穩(wěn)定性考察劑型合劑顆粒劑片劑膠囊劑時間h/毒素OTAZENOTAZENOTAZENOTAZEN03.22E+056.21E+045.13E+055.95E+045.07E+051.90E+043.71E+051.46E+0423.22E+056.21E+044.75E+055.59E+044.94E+051.81E+043.75E+051.36E+0443.04E+056.14E+044.98E+055.72E+044.96E+051.90E+043.58E+051.39E+0482.90E+056.04E+044.65E+055.72E+044.50E+051.94E+043.68E+051.49E+04122.80E+056.04E+044.43E+055.33E+044.33E+051.90E+043.35E+051.28E+04242.75E+056.06E+044.54E+055.63E+044.27E+051.81E+043.35E+051.34E+04362.60E+055.98E+044.16E+055.43E+044.30E+051.92E+043.47E+051.28E+04482.60E+055.91E+044.28E+055.09E+044.54E+051.78E+042.98E+051.23E+04平均值2.89E+056.07E+044.62E+055.56E+044.61E+051.87E+043.48E+051.35E+04RSD%8.61.87.24.87.13.37.36.83小建中制劑中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮污染研究分析3.1赭曲霉毒素A（OTA）檢測結(jié)果按所建方法，對8個廠家共160批次樣品進行了檢驗。結(jié)果7個廠家18批次的OTA檢出率分別為11.3%，平均檢出含量7.0μg/kg。其中，合劑有4個廠家共檢出5批，占7.5%，平均檢出含量5.1μg/kg；片劑有1個生產(chǎn)廠家檢出4批，占28.6%；平均檢出含量13.8μg/kg；膠囊劑檢出1家企業(yè)3批，占12.0%，平均檢出含量為3.0μg/kg；顆粒劑有1個生產(chǎn)廠家6批，占11.1%，平均檢出含量為6.1μg/kg。表13不同劑型中赭曲霉毒素A（OTA）污染情況劑型樣品批次檢出批次檢出率（%）檢出含量均值(μg/kg)檢出含量范圍（μg/kg）合劑6757.465.123.60~6.7片劑14428.5713.7610.30~15.80膠囊劑25312.003.032.20~4.30顆粒劑54611.116.082.20~12.203.2玉米赤霉烯酮（ZEN）檢測結(jié)果按照建立的方法，對8家生產(chǎn)企業(yè)160批樣品進行檢測。結(jié)果有1家企業(yè)共40批樣品檢測出ZEN，由表14可知只有顆粒劑檢出1家企業(yè)40批次樣品，檢出率為74.1%，檢出含量均值為48.6μg/kg；合劑、膠囊劑、片劑未檢測出陽性樣品。表14不同劑型中玉米赤霉烯酮（ZEN）污染情況劑型樣品批次檢出批次檢出率（%）檢出含量均值(μg/kg)檢出含量均值（μg/kg）合劑6700.00.00.0片劑1400.00.00.0膠囊劑2500.00.00.0顆粒劑544074.148.69.8~76.4合計1604074.148.69.8~76.43.3殘留量標準與風險評估OTA因其嚴重的毒性而受到世界各國的廣泛關(guān)注?；贠TA的污染狀況和毒素水平，歐洲等多個國家和機構(gòu)都制訂了相應(yīng)的OTA標準，并參照國外OTA的最大容許值，對某些食物進行了限定。我們國家對谷物，大豆，咖啡；對于酒類等，可設(shè)定OTA含量為2-10μg/kg。歐盟禁止谷物，咖啡，葡萄酒；OTA的含量上限為0.5μg/kg，如甘草等。美國食品安全委員會規(guī)定小麥，大麥，黑麥等谷物和制品的OTA含量低于5.0μg/kg。詳見表13。在藥物中。只有10.0版《歐洲藥典》和《英國藥典》和2020版《英國藥典》中對甘草和甘草的提取物進行了檢測，檢出限都是80μg/kg。而中國目前還沒有關(guān)于OTA的規(guī)定。而在GB2761-2017《國家食品安全標準食品中真菌毒素限量》中部分食品規(guī)定的限量值為5.0μg/kg、歐盟藥典的部分草藥品種及提取物的限量值為20.0μg/kg，因此本研究以20.0μg/kg為OTA的限量。表13中國及不同組織對食品中OTA限量標準國家或地區(qū)種類限量（μg/kg）中國谷物及其制品、豆類及其制品、烘焙咖啡豆、研磨咖啡（烘焙咖啡）5葡萄酒2速溶咖啡10歐盟未加工谷物；烘培咖啡豆及磨碎的烘培咖啡，不含可溶性咖啡5所有來自未加工谷物的產(chǎn)品，包括加工谷物制品和直接供人食用的谷物3葡萄干果、速溶咖啡10葡萄酒及果酒；芳香化葡萄酒，芳香化葡萄酒飲料和芳香化葡萄酒雞尾酒；供人類直接消費的葡萄汁2胡椒、肉豆蔻、姜、姜黃、辣椒及含有上述香料之一的香料混合物，甘草15用于草藥沖劑的甘草根20甘草提取物，用于食品，特別是飲料和糖果80不直接賣給消費者小麥面筋8嬰幼兒加工谷物食品和嬰兒食品，專門為嬰兒設(shè)計的特殊醫(yī)療用途的膳食食品0.5CAC小麥、大麥、黑麥＜5在全球食品安全領(lǐng)域，控制玉米赤霉烯酮（ZEN）的污染是至關(guān)重要的。鑒于ZEN對谷物的污染程度較高，世界各國都在其谷物和谷物制品中嚴格控制ZEN的含量。目前，大部分國家已經(jīng)通過法規(guī)設(shè)定了ZEN的具體限量。具體來說，針對消費者的谷物及其制品，ZEN的限量一般在60-200μg/kg，而嬰兒食品中ZEN的限制則更加嚴格。CAC和美國尚未制定具體的谷物ZEN限量標準。相比之下，歐盟的監(jiān)管范圍要廣得多，不只是小麥、玉米，還有其它種類的谷類，并對原糧與成品糧食的限量規(guī)定進行了區(qū)別。特別是針對嬰幼兒這樣的敏感群體，為了保證其食物的安全性，歐盟還對其進行了嚴格的限量。詳見表14。在我國，目前尚沒有對原糧和成品糧分別設(shè)定ZEN的限量標準，故以60μg/kg為ZEN的限量。表14各國及組織對食品中ZEN限量標準國家或地區(qū)種類限量（μg/kg）中國谷物及其制品、小麥、小麥粉、玉米、玉米面(片、渣)60澳大利亞谷物(食品)60法國谷物、植物藥200意大利谷物100歐盟未加工的農(nóng)作物《除玉米)100加工后的粉末(除玉米粉)75餅干、面包等烘培食品50未加工的玉米350加工谷類嬰幼兒食品20直接用于人類消費的玉米、玉米粉、玉米面、玉米胚芽、玉米胚芽油和玉米精油200從OTA的檢測結(jié)果來看，檢出18批樣品的含量在2.2~15.8μg/kg，均低于20.0μg/kg，存在污染，但風險不高。從ZEN的檢測結(jié)果來看，檢出的40批樣品含量在9.8~76.4μg/kg，有14批超出60μg/kg，較OTA污染嚴重，存在一定風險。根據(jù)我國歷年來藥品中真菌毒素的情況分析，OTA和ZEN的污染可能分別來源炙甘草藥材和顆粒劑中的藥用輔料糊精。總的來說，抽檢結(jié)果顯示小建中制劑有一定程度的真菌毒素污染，雖然污染等級不高，但仍需要重視處方中炙甘草及糊精的質(zhì)量監(jiān)控。4討論4.1基質(zhì)效應(yīng)考察基質(zhì)效應(yīng)是指在提取基體中的目標物時，基質(zhì)中的干擾物質(zhì)會對目標物產(chǎn)生電離作用，從而導致目標物對目標物的檢測出現(xiàn)“增強”或“抑制”的現(xiàn)象。本研究分別用空白溶液與基質(zhì)溶液各配制一組濃度對應(yīng)相等的混合標準溶液，通過儀器檢測后，分別得到基質(zhì)溶液匹配的工作曲線和空白溶液匹配的工作曲線，以基質(zhì)溶液配制的標準曲線斜率和空白溶液配制的標準曲線斜率之比表示，即SSE值。低于80%~120%時，顯示出基質(zhì)抑制作用；反之則為增強作用。本實驗結(jié)果表明，OTA和ZEN在小建中制劑中均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，本實驗采用基質(zhì)溶液液配制標準曲線對樣品中的毒素進行定量，降低基質(zhì)干擾的影響，提高了定量分析的準確度。4.2提升小建中制劑安全性的策略通過本文的研究發(fā)現(xiàn)小建中制劑小建中制劑中可被檢測出真菌毒素，雖然污染等級不高，但作為藥品它對人類健康存在潛在風險不可忽視。因此加強中藥及其制劑的質(zhì)量監(jiān)控尤為重要。中藥材及制劑其種植、加工、貯存和運輸全過程均存在真菌毒素污染的風險，因此想要實現(xiàn)中藥中真菌毒素可防可控，可以加強中藥全產(chǎn)業(yè)鏈過程中真菌毒素的控制合理規(guī)范中藥材種植、養(yǎng)殖方式，加強對內(nèi)生真菌的研究；嚴把中藥制劑的原料質(zhì)量關(guān)，加強制劑工藝的過程控制；加強中藥中真菌毒素污染的監(jiān)控力度，盡快建立并實施國家層面的中藥安全性風險監(jiān)測計劃，建立適合中藥材及其制劑的真菌毒素風險評估方法和完善的中藥真菌毒素的限量標準體系，為限量制訂提供科學依據(jù)。結(jié)論基于此，擬構(gòu)建一種簡便、快速、高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)，實現(xiàn)對中藥飲片中赭曲霉素A（OTA）和玉米赤霉烯酮（ZEN）的同步測定。該方法具有高標準、環(huán)境友好、結(jié)果準確可靠等優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)對微量真菌毒素及代謝物的同步測定，是當前真菌毒素快速分析的重要方法。該方法操作簡便，可用于小建中制劑及其它中成藥制劑中真菌毒素的檢測。從本文及其他研究人員的研究結(jié)果表明，小建中制劑中可被檢測出真菌毒素，說明中藥制劑中存在真菌毒素的安全隱患。針對不同類型真菌毒素在化學結(jié)構(gòu)、色譜行為和光學特征等方面存在共性問題，采用常規(guī)柱層析方法難以實現(xiàn)快速、準確的分離；同時，由于中藥材中組分復(fù)雜，存在著基體干擾等問題，難以實現(xiàn)對其多殘留的有效快速檢測。因此，建立一套高效、準確、可靠的多組分真菌毒素同步分析方法，是當前急需解決的問題，也是未來的研究熱點。同時，應(yīng)加強對中藥材中霉菌毒素含量的研究，并對其安全性進行評估，應(yīng)針對我國當前霉菌毒素污染狀況，建立中藥材及其制劑中霉菌毒素限量標準。參考文獻：[1]王靜.中藥外源性有害物質(zhì)分析與研究[J].天津藥學,2023,35(04):73-78.[2]ADEBOOA,MOLELEKOAT,MAKHUVELER,etal.Areviewonnovelnon-thermalfoodprocessingtechniquesformycotoxinreduction[J].IntJFoodSciTechnol,2021,56(1):13-27.[3]ESKOLAM,KOSG,ELLIOTTCT,etal.Worldwidecontaminationoffood-cropswithmycotoxins:Validityofthewidelycited‘FAOestimate’of25[J].CritRevFoodSciNutr,2020,60(16):2773-2789.[4]ARI?OA,ESTOPA?ANG,etal.HighlevelsofochratoxinAinlicoriceandderivedproducts[J].IntJFoodMicrobiol,2007,114(3):366-369.[5]HUANGXJ,WANGSM,MAOD,etal.OptimizedQuEChERSmethodcombinedwithUHPLC-MS/MSforthesimultaneousdeterminationof15mycotoxinsinliquorice[J].JAOACInt,2018,101(3):633-642.[6]毛丹,王少敏等.LC-MS/MS法同時測定中藥肉豆蔻中12種真菌毒素[J].中國藥師,2020,23(07):1311-1315.[7]葉林鏈,毛丹,等.肉豆蔻中赭曲霉毒素的測定及赭曲霉毒素產(chǎn)毒菌的分離鑒定[J].分析試驗室,2021,40(1):7-11.[8]胡佳哲,賴宇紅.高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定淀粉類藥用輔料中22種真菌毒素的含量[J].中國藥品標準,2023,24(04):444-450.[9]胡佳哲,曹雅靜等.首批立法保護嶺南中藥材中真菌毒素的LC-MS/MS法檢測[J].藥物分析雜志,2020,40(03):477-482.[10]王少敏,黃曉靜,等.QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定中藥瓜蔞皮中22種真菌毒素[J].食品安全質(zhì)量檢測學報,2018,9(22):5843-5850.[11]胡佳哲,吳鳳丹等.同位素標記-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定中藥材中8種真菌毒素[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2020,30(05):513-517.[12]王少敏,杜春曉,等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定瓜蔞皮及提取物中6種玉米赤霉烯酮類真菌毒素[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2020,30(12):1424-1427.[13]諸寅,毛偉峰,等.上海市售薏苡仁中玉米赤霉烯酮的污染狀況及暴露評估[J].衛(wèi)生研究,2020,49(5):840-843,872.[14]胡佳哲,陳浩桉等.中藥材中常見真菌毒素污染狀況及分析方法研究進展[J].海峽藥學,2019,31(01):1-5.[15]薛琳琳,張朋振,等.玉米赤霉烯酮在玉米及其副產(chǎn)物中污染現(xiàn)狀及生物脫毒研究進展[J].畜牧與獸醫(yī),2024,56(01):145-151.[16]張瑋瑋,張志鵬,等.遠志產(chǎn)地初加工過程中黃曲霉污染調(diào)查及病發(fā)規(guī)律研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2021,32(3):603-606.[17]左甜甜,劉麗娜,等.動物藥中黃曲霉毒B1的定量風險評估探索[J].藥物分析雜志,2019,39(7):1267-1271.[18]蔡飛,高微微,李紅玲,等.中藥上黃曲霉毒素的污染現(xiàn)狀與防除技術(shù)[J].中國中藥雜志,2010,35(19):2503-2507.[19]]尹寧寧,周黎明,等.HPLC法同時測定21種中藥飲片中4種黃曲霉毒素的含量[J].山東中醫(yī)雜志,2019,38(11):1067-1071.[20]周恒,王少敏,等.中藥中真菌毒素污染的現(xiàn)狀及防控對策[J].中國食品藥品監(jiān)管,2022,(03):110-118.[21]徐曉艷,王宇,等.中藥材中真菌毒素的檢測與脫毒研究進展[J].中草藥,2024,55(02):657-669.[22]于松.發(fā)霉的食物危害有多大[J].生命與災(zāi)害,2022,(08):3938.[23]國家藥典委員會中國藥典2020年版一部、四部[S].北京中國醫(yī)藥科技出版社,2020.[24]范孝英,李芳.酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法在食品微生物檢測中的應(yīng)用分析[J].食品安全導刊,2021,(09):152+154.[25]周穎琴,熊瑛,等.酶聯(lián)免疫吸附法測定藥食同源中藥飲片中黃曲霉毒素的研究[J].現(xiàn)代食品,2022,28(18):163-168.[26]諶遠.嘔吐毒素抗原模擬表位的定向突變及其免疫層析試紙條的制備[D].南昌大學,2022.[27]張甄.同時檢測黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮免疫層析試紙條的研制[D].黑龍江八一農(nóng)墾大學,2010.[28]孫云杰.谷物中四種真菌毒素的熒光免疫分析方法研究[D].江南大學,2022.[29]鄧依.近紅外光譜技術(shù)在糧食真菌毒素檢測中的應(yīng)用進展[J].釀酒科技,2021,(11):101-105.[30]]張強,劉成海,孫井坤,等.基于支持向量機的稻谷黃曲霉毒素B1近紅外無損檢測[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2015,46(05):84-88.[31]劉來亭,楊覃,等.激光誘導熒光光譜法檢測黃曲霉毒素的研究進展[J].飼料研究,2020,43(12):151-153.[32]楊雪倩,于慧春,等.拉曼光譜法檢測玉米中黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮[J].核農(nóng)學報,2021,35(01):159-166.[33]沈飛,吳啟芳,姜大峰,等.基于電子鼻技術(shù)的糙米黃曲霉毒素污染快速檢測方法研究[J].中國糧油學報,2017,32(06):146-151.[34]馮莉.薄層色譜法檢測玉米中黃曲霉毒素B1[J].現(xiàn)代畜牧科技,2018,(08):20.[35]李楠,李莉,朱彤霞.4種鐮刀菌毒素的氣相色譜系統(tǒng)檢測方法[J].環(huán)境科學,1993,(03):73-75+95.[36]黃仁堂,劉洪美,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測中藥中多種真菌毒素的研究進展[J].中華中醫(yī)藥學刊,2022,40(12):27-35+281.[37]何紹映,李如棟,等.液相色譜法及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定山楂及其制品中展青霉素的結(jié)果比較與建議[J].食品安全質(zhì)量檢測學報,2020,11(19):6879-6885.[38]郝剛.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在2015年版《中國藥典》中藥標準中的應(yīng)用[J].中國藥品標準,2017,18(03):171-174.[39]朱偉堃,井改革,等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定紅曲米中10種真菌毒素含量[J].中國藥業(yè),2023,32(03):89-93.[40]吳定芳，王磊,等.高效液相色譜法測定茶葉中6種真菌毒素[J].分析儀器,2023,(01):32-38.[41]章璐幸,黃朝輝,等.應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法建立谷物中18種真菌毒素非靶向篩查數(shù)據(jù)庫及確證方法[J].色譜,2023,41(01):66-75.附錄A附表A1小建中制劑OTA和ZEN檢出樣含量表劑型檢品編號批號生產(chǎn)單位OTA(μg/kg)ZEN(μg/kg)片劑2023A0239620220202廠家四//2023A02405202110017.5/2023A02618202205014.8/2023A0325520221102//2023A0326820221101//2023A0374420220202//2023A037502022020212.2/2023A017832022080115.6/2023A0241020220801//2023A0261620220801//2023A026172022080115.8/2023A0325820220801//2023A032592022080113.4/2023A037432022080110.3/顆粒劑2023A01379XJ220715廠家一/53.32023A01380XJ221203/55.12023A01381XJ220618/46.72023A01382XJ220725/62.62023A01383XJ2106073.613.92023A01738XJ220313/21.02023A01739XJ2202085.558.82023A01741XJ220605/41.92023A01744XJ220603/45.42023A01746XJ220331/74.72023A01756XJ220710/65.7續(xù)附表A1劑型檢品編號批號生產(chǎn)單位OTA(μg/kg)ZEN(μg/kg)顆粒劑2023A01759XJ220507廠家一/55.22023A01762XJ211210/13.92023A01765XJ220506/68.42023A01767XJ220313//2023A01931XJ220333/59.62023A02361XJ221002/48.52023A02364XJ220714//2023A02371XJ220306//2023A02372XJ220414/63.22023A02377XJ220721/612023A02380XJ220321/42.12023A02401XJ220722/70.32023A02408XJ220204/64.22023A02611XJ220707/61.92023A02612XJ220608/55.72023A02613XJ2204012.656.42023A02614XJ220323/30.62023A02615XJ221110/51.02023A03132XJ220604//2023A03133XJ221204/37.22023A03137XJ220505/66.52023A03138XJ221002/76.42023A03139XJ221205/34.32023A03745XJ221102/29.62023A03746XJ220415/42.92023A03747XJ221212//2023A03751XJ221219/65.7續(xù)附表A1劑型檢品編號批號生產(chǎn)單位OTA(μg/kg)ZEN(μg/kg)顆粒劑2023A03756XJ211211廠家一/30.52023A03760XJ201105//2