ICS65.020.30

CCSB41

37

山東省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB37/T4639.1—2023

豬疫病診斷技術(shù)第1部分：圓環(huán)病毒

Diagnosistechnologyofswineepidemicdisease—Part1:Circovirus

2023-08-03發(fā)布2023-09-03實(shí)施

山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB37/T4639.1—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件是DB37/T4639《豬疫病診斷技術(shù)》的第1部分。DB37/T4639已經(jīng)發(fā)布了以下部分：

——第1部分：圓環(huán)病毒。

本文件代替DB37/T1827—2011《豬圓環(huán)病毒2型熒光PCR檢測技術(shù)》，與DB37/T1827—2011相比，

除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動(dòng)外，主要技術(shù)變化如下：

a)增加了“引言”（見引言）；

b)更改了提出與組織實(shí)施單位（見前言，2011年版的前言）；

c)刪除了主要起草人和起草單位（見2011年版的前言）；

d)更改了“范圍”（見第1章，2011年版的第1章）

e)增加了“規(guī)范性引用文件”和“術(shù)語和定義”（見第2章和第3章）；

f)更改了“試劑或材料”和“儀器設(shè)備”相關(guān)內(nèi)容（見第4章和第5章，2011年版的第2章）；

g)增加了“臨床診斷”和“病理診斷”（見6.1、6.2）；

h)更改了“實(shí)驗(yàn)室診斷”（見6.3，2011年版的第3章）；

i)增加了“參考文獻(xiàn)”（見參考文獻(xiàn)）。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實(shí)施。

本文件由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本文件的歷次版本發(fā)布情況為：

——2011年首次發(fā)布為DB37/T1827—2011；

——本次為第一次修訂。

I

DB37/T4639.1—2023

引言

疫病是威脅養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要原因，疫病的精準(zhǔn)診斷是綜合防控的前提。豬圓環(huán)病毒?。≒CVD）

是由豬圓環(huán)病毒（PCV）引起的一種多系統(tǒng)性疾病，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎

和腎病綜合征（PDNS）、增生性壞死性肺炎（PNP）和繁殖障礙性疾病等，主要表現(xiàn)為呼吸、泌尿、腸

道、淋巴、心血管、神經(jīng)、繁殖系統(tǒng)以及皮膚的功能紊亂，同時(shí)可以導(dǎo)致免疫抑制，進(jìn)而導(dǎo)致繼發(fā)或混

合感染是國際公認(rèn)的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的疾病之一，對生豬生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

為規(guī)范我省豬圓環(huán)病毒診斷工作，以進(jìn)一步提高豬疫病綜合防控工作能力，保護(hù)養(yǎng)殖業(yè)公共衛(wèi)生安

全，最大限度減少豬圓環(huán)病毒病造成的經(jīng)濟(jì)損失，本文件結(jié)合先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)和行業(yè)的實(shí)際，嚴(yán)格按照GB/T

1.1《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的要求編寫，以“科學(xué)性、先進(jìn)性、系統(tǒng)性、

適用性”為原則，聚焦豬圓環(huán)病毒病診斷的關(guān)鍵參數(shù)，制定《豬疫病診斷技術(shù)第1部分：圓環(huán)病毒》。

II

DB37/T4639.1—2023

豬疫病診斷技術(shù)第1部分：圓環(huán)病毒

1范圍

本文件描述了豬圓環(huán)病毒1型（PorcineCircovirusType1，PCV1）、2型（PorcineCircovirusType

1，PCV2）和3型（PorcineCircovirusType3，PCV3；）的熒光PCR檢測及鑒別檢測技術(shù)。

本文件適用于豬圓環(huán)病毒1型、2型和3型的快速分子診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4試劑或材料

4.1水：符合GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。

4.2磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：取磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.27g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.42g、氯化

鈉（NaCl）8g、氯化鉀（KCl）0.2g，加滅菌水約800mL充分?jǐn)嚢枞芙猓尤霛恹}酸調(diào)pH至7.4，定

容至1000mL。

4.3核酸提取試劑：市售病毒DNA/RNA提取試劑盒或磁珠法提取試劑盒。

4.4熒光PCR試劑盒。

5儀器設(shè)備

5.1熒光定量PCR儀。

5.2震蕩研磨儀。

5.3高速冷凍離心機(jī)：離心力≥8000g。

5.4電子天平：精度0.0001g。

5.5生物安全柜。

5.6冰箱：2℃～8℃，-20℃以下和-70℃以下。

5.7渦旋振蕩器。

6診斷方法

1

DB37/T4639.1—2023

6.1臨床診斷

6.1.1流行特點(diǎn)

豬是PCV的天然宿主，各種年齡、不同性別的豬都可以感染，但以哺乳期和育成期的豬最易感。病

豬和帶毒豬是主要的傳染源，可經(jīng)口腔、呼吸道、精液感染不同日齡的豬，少數(shù)孕豬還可經(jīng)胎盤垂直傳

播。

6.1.2臨床癥狀

6.1.2.1斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)

引起斷奶期進(jìn)行性消瘦、皮膚蒼白、呼吸困難、厭食、精神沉郁、被毛粗亂、出現(xiàn)以咳嗽、噴嚏、

呼吸加快及呼吸困難為特征的呼吸障礙，10%～20%豬的皮膚和可視粘膜可見黃疸，豬群的死亡率增加，

體表淋巴結(jié)，特別是腹股溝淺淋巴結(jié)腫大，有的還表現(xiàn)腹瀉和中樞神經(jīng)癥狀。其它臨床癥狀，包括咳嗽、

發(fā)熱、胃炎、腦膜炎及突然死亡。

6.1.2.2豬腎病與皮炎綜合征(PDNS)

斷奶仔豬和育肥豬食欲減退，有時(shí)體溫上升，皮下水腫，皮膚表面出現(xiàn)圓形或不規(guī)則形隆起，紅色

或紫色、中央發(fā)黑的斑塊。破損皮膚常融合成大的塊。通常病變在后肢、腹部首先發(fā)現(xiàn)，然后慢慢向胸、

耳等部位擴(kuò)展。剖檢，在大部分死亡豬中，可見雙腎腫大、蒼白、皮質(zhì)有出血小點(diǎn)。

6.1.2.3仔豬的先天性震顫(CT)

出生后3周齡仔豬，因痙攣而出現(xiàn)步態(tài)異常姿勢，從雙耳，被毛和尾巴等發(fā)抖，發(fā)展到全身肌肉有

節(jié)奏性扭擺，后肢嚴(yán)重痙攣，呈跳躍運(yùn)動(dòng)等。欲稱“仔豬跳跳病”或“仔豬抖抖病”，是仔豬剛出生不

久，出現(xiàn)全身或局部肌肉陣發(fā)性攣縮的一種疾病。另一種表現(xiàn)是后肢肌肉呈強(qiáng)直性痙攣，后肢分開，似

犬坐姿勢，尾部輕微震顫，病豬可在3周內(nèi)康復(fù)。

6.1.2.4豬增生性和壞死性肺炎(PNP)

與保育豬和育肥豬發(fā)生的呼吸道病有關(guān)。PNP的確診主要依據(jù)組織病理學(xué)變化，表現(xiàn)為增生性和壞

死性肺炎，病豬主要表現(xiàn)呼吸困難，肺臟見點(diǎn)狀出血。

6.2病理診斷

剖檢病變?yōu)樨i只消瘦，貧血，皮膚蒼白，黃疸，最顯著的剖檢變化是全身淋巴結(jié)腫大，特別是腹股

溝淺淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、氣管支氣管淋巴結(jié)及下頜淋巴結(jié)腫大2～5倍，有時(shí)可達(dá)10倍。切面硬度增

大，可見均勻的白色，所有病例幾乎都能看到肺萎縮不全，重量和硬度增加，部分病例尖葉有固質(zhì)化、

致密的病灶，肺有輕度的多灶性或高度的彌漫性間質(zhì)肺炎。肺臟腫脹，堅(jiān)硬似橡皮樣；肝臟發(fā)暗，肝小

葉間結(jié)締組織增生。肝臟最常見到門脈周圍淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞浸潤，具有竇狀隙內(nèi)單核炎性細(xì)胞集聚

和肝細(xì)胞的單細(xì)胞壞死為特征的肝炎。慢性死亡病例，由于黃疸而使肝小葉周圍纖維化，肝細(xì)胞壞死、

消失及單核細(xì)胞彌漫性浸潤。腎臟水腫、蒼白，被膜下有壞死灶。顯微鏡觀察，淋巴結(jié)的皮質(zhì)區(qū)及副皮

質(zhì)區(qū)顯著擴(kuò)張，有單核和巨噬細(xì)胞浸潤，有時(shí)散布有大量的多核巨細(xì)胞，有些淋巴細(xì)胞萎縮，少數(shù)情況

還有壞死。肝臟表現(xiàn)不同程度的炎癥，有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤；腎臟的皮質(zhì)和髓質(zhì)

也有炎癥存在。

6.3實(shí)驗(yàn)室診斷

6.3.1樣品采集

2

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6.3.1.1細(xì)胞培養(yǎng)樣品

按照GB19489規(guī)定，取細(xì)胞培養(yǎng)樣品。

6.3.1.2剖檢樣品

按照NY/T541規(guī)定采集病死豬的淋巴結(jié)、脾臟、腎臟和肺臟等組織樣品。

6.3.2樣品的保存及運(yùn)輸

樣品2℃～8℃貯藏。樣品保存在2℃～8℃條件下不超過24h，-20℃以不超過3個(gè)月，-70℃以下

不超過5年。必須低溫保存運(yùn)輸樣品，且在規(guī)定溫度下的保存期內(nèi)送達(dá)和檢測。

6.3.3樣品處理

6.3.3.1淋巴結(jié)、脾臟、腎臟和肺臟等組織樣品

取適量大小的組織塊放入盛有500μLPBS（4.2）的研磨管中，6000r/min震蕩研磨45s，制成約

10%的組織勻漿液，5000r/min離心5min，上清液備用。

6.3.3.2細(xì)胞培養(yǎng)樣品

將細(xì)胞培養(yǎng)樣品反復(fù)凍融3次，3000r/min離心5min，棄去細(xì)胞碎片，上清備用。

6.3.4試驗(yàn)步驟

6.3.4.1核酸提取

采用DNA提取試劑盒提取各類樣本中的病毒核酸。如在2h內(nèi)檢測可將提取的核酸置于冰上保存，否

則應(yīng)置于-20℃冰箱保存，具體操作步驟如下：

a)取上清液（6.3.3）200μL置于1.5mL離心管中，加入500μL裂解液，在渦旋振蕩器上振

蕩30s混勻，室溫靜置2min；

b)裂解后的液體移入吸附管柱，6000r/min，離心5min；

注：此時(shí)病毒DNA會(huì)吸附再管柱底部的膜上。

c)加500μL洗液至管柱上，6000r/min，離心5min，棄去洗液；

d)重復(fù)上一步驟1次；

e)8000r/min離心10min，去除殘留在膜上的乙醇；

f)將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中，開蓋室溫靜置2min；加入50μL洗脫液，室溫靜置1min；

g)將含有吸附柱的離心管，8000r/min離心1.5min，得到DNA。

6.3.4.2熒光PCR擴(kuò)增

設(shè)25μL反應(yīng)體系，熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)液體系見表1，熒光PCR擴(kuò)增引物參見附錄A。

表1熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)液體系

序號(hào)組分用量

12×SYBR?GreenProTaqHSPremix*612.5

210μMPCV-F1.0

310μMPCV1-R1.0

410μMPCV2-R1.0

3

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表1熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)液體系（續(xù)）

序號(hào)組分用量

510μMPCV3-R1.0

6模板DNA1.5

7ddH2O7

6.3.4.3檢測

設(shè)置陽性、陰性對照，熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件見表2。

表2熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

序號(hào)進(jìn)程反應(yīng)條件反應(yīng)時(shí)間

1預(yù)變性95℃30s

2變性95℃30s

3退火62℃30s

4延伸72℃10s

5循環(huán)數(shù)（2～4）40—

6信號(hào)采集退火時(shí)采集—

6.3.5結(jié)果判定

6.3.5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

直接讀取檢測樣品的熔解曲線峰值溫度，溫度誤差0.1℃范圍內(nèi)。

6.3.5.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

6.3.5.2.1陽性對照參見附錄B。

6.3.5.2.2陰性對照熔解曲線無峰值。

6.3.5.3樣品檢測結(jié)果分析

在陽性和陰性成立前提下，樣品檢測結(jié)果判定如下：

a)熔解曲線峰值溫度為84℃，則樣品中含有PCV1；

b)熔解曲線峰值溫度為85℃，則樣品中含有PCV2；

c)熔解曲線峰值溫度為82℃，則樣品中含有PCV3；

d)熔解曲線峰值溫度為84℃和85℃，則樣品中含有PCV1和PCV2；

e)熔解曲線峰值溫度為84℃和82℃，則樣品中含有PCV1和PCV3；

f)熔解曲線峰值溫度為85℃和82℃，則樣品中含有PCV2和PCV3；

g)熔解曲線峰值溫度為84℃、85℃、82℃，則樣品中含有PCV1、PCV2和PCV3。

4

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

熒光PCR擴(kuò)增引物

熒光定量PCR擴(kuò)增引物見表A.1。

表A.1熒光定量PCR擴(kuò)增引物

引物名稱序列

PCV-F5’-TKGATGATYTTTTATGGSTGG-3’

PCV1-R5’-GTCAGCAGTTGAGGACTACCATT-3’

PCV2-R5’-AGTAATCCGCCGATAAAGAGC-3’

PCV3-R5’-CTCCTAAACAAGGCCTCCAACT-3’

注：簡并堿基K：G/T；Y：C/T；S：G/C