ICS11.220

CCSB41

53

云南省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB53/T1059.2—2021

滇金絲猴檢疫技術(shù)第2部分：毛首線蟲實(shí)

驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

QuarantinetechniqueforRhinopithecusbieti

—Part2:TechnicalspecificationsforlaboratoryexaminationofCapillaria

2021-09-30發(fā)布2021-10-14實(shí)施

云南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

1

DB53/T1059.2—2021

目??次

前言...................................................................................................................................................................III

引言.....................................................................................................................................................................Ⅴ

1范圍.................................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件.............................................................................................................................................1

3術(shù)語和定義.....................................................................................................................................................1

4縮略語.............................................................................................................................................................1

5試驗(yàn)原理.........................................................................................................................................................2

6試驗(yàn)條件.........................................................................................................................................................2

6.1實(shí)驗(yàn)室通用要求.....................................................................................................................................2

6.2人員要求.................................................................................................................................................2

6.3生物安全要求.........................................................................................................................................2

7儀器設(shè)備和試劑.............................................................................................................................................2

7.1主要儀器設(shè)備.........................................................................................................................................2

7.2主要試劑.................................................................................................................................................2

8樣品采集與保存.............................................................................................................................................3

9試驗(yàn)步驟.........................................................................................................................................................3

9.1形態(tài)學(xué)檢測(cè).............................................................................................................................................3

9.2PCR檢測(cè)..................................................................................................................................................3

10試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理...............................................................................................................................................3

10.1蟲卵檢測(cè)...............................................................................................................................................4

10.2蟲體檢測(cè)...............................................................................................................................................4

附錄A（規(guī)范性）糞樣的采集和保存方法...............................................................................................5

附錄B（規(guī)范性）毛首線蟲的基本形態(tài)特征...........................................................................................7

I

DB53/T1059.2—2021

前??言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

本文件是DB53/T1059《滇金絲猴檢疫技術(shù)》的第2部分。DB53/T1059已經(jīng)發(fā)布了以下部分：

——第1部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范；

——第2部分：毛首線蟲實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范；

——第3部分：隱孢子蟲實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范；

——第4部分：志賀桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由云南省林業(yè)與草原局、云南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局共同提出。

本文件由云南省林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（YNTC02）歸口。

本文件主要起草單位：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、云南省標(biāo)準(zhǔn)化研究院、昆明動(dòng)物園、云南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所。

本文件主要起草人：楊建發(fā)、黃艷梅、蒙英雯、朱勛程、衡昭君、楊俊、鄒豐才、陳培富、宋海洋、

張譽(yù)方、李云喬、朱尤帥。

III

DB53/T1059.2—2021

引言

滇金絲猴（Rhinopithecusbieti）是中國特有珍稀瀕危靈長(zhǎng)類動(dòng)物，屬于國家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生

動(dòng)物，列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟》（IUCN）瀕危物種紅色名錄。編制并發(fā)布DB53/T1059《滇金絲猴檢

疫技術(shù)》地方標(biāo)準(zhǔn)，推進(jìn)滇金絲猴疫病診斷的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，指導(dǎo)從事野生動(dòng)物保護(hù)相關(guān)的專業(yè)人員

按規(guī)范程序?qū)嵤?duì)滇金絲猴相關(guān)病原的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，為滇金絲猴的科學(xué)研究和保護(hù)工作提供病原或疫病

調(diào)查的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為滇金絲猴檢疫、疫病監(jiān)測(cè)和防治提供重要的參考依據(jù)，促進(jìn)滇金絲猴繁育和擴(kuò)群，

維護(hù)地區(qū)物種與生態(tài)平衡，提升生物多樣性保護(hù)成效。

本文件已發(fā)布4個(gè)部分：

——第1部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范。本部分從產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的總則、

產(chǎn)氣莢膜梭菌分型、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；

——第2部分：毛首線蟲實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范。本部分從毛首線蟲實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范的試驗(yàn)原理、

試驗(yàn)條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品采集與保存、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；

——第3部分：隱孢子蟲實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范。本部分從隱孢子蟲實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的試驗(yàn)原理、試

驗(yàn)條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；

——第4部分：志賀桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范。本部分從志賀桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)涉及的總則、志

賀桿菌分類、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范。

Ⅴ

DB53/T1059.2—2021

滇金絲猴檢疫技術(shù)

第2部分：毛首線蟲實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了滇金絲猴（Rhinopithecusbieti）檢疫技術(shù)中毛首線蟲實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范的試驗(yàn)原理、

試驗(yàn)條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品采集與保存、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。

本文件適用于滇金絲猴檢疫技術(shù)中毛首線蟲實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

線蟲nematodes

線蟲動(dòng)物門為假體腔動(dòng)物，線蟲屬通常呈圓柱形，線狀或毛發(fā)狀，某些種類呈鞭狀或球狀。不分節(jié)，

兩側(cè)對(duì)稱并具有三胚層假體腔，一般為雌雄異體。蟲體大小隨種類不同差別較大，雄蟲一般較雌蟲小。

寄生性線蟲最常見寄生于消化道。

3.2

毛首線蟲trichuris

毛首線蟲是滇金絲猴最為常見也是危害最大的消化道線蟲。蟲卵隨滇金絲猴糞便排到外界，在糞便

和土壤中發(fā)育為感染性蟲卵；經(jīng)口感染后，幼蟲在小腸內(nèi)孵出，鉆入腸絨毛間發(fā)育，然后移行到盲腸和

結(jié)腸內(nèi)發(fā)育為成蟲。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PolymeraseChainReaction

TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液TrisAcetate-EDTABuffer

DNA：脫氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid

NCBI：美國國家生物技術(shù)信息中心NationalCenterforBiotechnologyInformation

BLAST：基于局部序列比對(duì)算法的搜索工具BasicLocalAlignmentSearchTool

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DB53/T1059.2—2021

5試驗(yàn)原理

鏡檢滇金絲猴消化道內(nèi)的毛首線蟲蟲卵或蟲體，依據(jù)其形態(tài)特征鑒定病原；采用PCR方法開展分子

鑒定。

6試驗(yàn)條件

6.1實(shí)驗(yàn)室通用要求

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿足GB19489的要求。

6.2人員要求

采樣與試驗(yàn)人員具有相應(yīng)的專業(yè)知識(shí)。

6.3生物安全要求

采樣及試驗(yàn)過程中做好自身防護(hù)，試驗(yàn)結(jié)束后的檢驗(yàn)器具要進(jìn)行消毒處理，廢棄樣品要及時(shí)進(jìn)行無

害化集中處理。

7儀器設(shè)備和試劑

7.1主要儀器設(shè)備

7.1.1正置光學(xué)顯微鏡。

7.1.2載玻片及蓋玻片若干，漏斗、玻璃棒、燒杯。

7.1.3金屬篩：60目。

7.1.4PCR擴(kuò)增儀。

7.1.5高速臺(tái)式離心機(jī)。

7.1.6單道可調(diào)移液器（量程0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL和100μL～1000μL）。

7.1.7電子天平（量程0.01mg～10000mg）。

7.1.8恒溫水浴鍋：36℃±1℃，65℃±1℃。

7.1.9電泳槽、電泳儀，紫外凝膠成像儀，渦旋振蕩器。

7.2主要試劑

7.2.1飽和食鹽水。

7.2.22.5%重鉻酸鉀液。

7.2.3基因組DNA提取試劑盒。

7.2.42×TaqPCRMasterMix。

7.2.5DL2000DNAMarker。

7.2.6無菌水。

7.2.750×TAE緩沖液：Tris堿242g和57.1mL冰醋酸，用雙蒸水定容到1L。

7.2.8核酸染料，用于凝膠成像顯示條帶。

7.2.91%瓊脂糖凝膠：1g瓊脂糖與100mL1×TAE緩沖液，加熱融化均勻，加入10μL核酸染料，60℃

時(shí)，倒入膠槽，插上樣品梳。室溫下待凝膠凝固后，垂直向上拔出固定在凝膠中的樣品梳。

2

DB53/T1059.2—2021

8樣品采集與保存

糞樣的采集和保存方法見附錄A。

9試驗(yàn)步驟

9.1形態(tài)學(xué)檢測(cè)

9.1.1蟲卵檢測(cè)

采用飽和食鹽水漂浮法，毛首線蟲卵富集在飽和液表面。取糞樣5g，加飽和食鹽水50mL，用玻璃

棒攪勻，通過60目金屬篩或雙層紗布過濾到干凈燒杯中，靜置0.5h；蘸取表面液膜，點(diǎn)樣于載玻片上，

蓋上蓋玻片，進(jìn)行鏡檢。

9.1.2蟲體檢測(cè)

用生理鹽水清洗干凈蟲體，放于載玻片，滴加乳酸酚透明液2～3滴，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下

觀察透明蟲體的內(nèi)部形態(tài)構(gòu)造。對(duì)于存疑蟲體，結(jié)合下述PCR擴(kuò)增方法對(duì)其進(jìn)行蟲種鑒定。

9.2PCR檢測(cè)

9.2.1DNA提取和保存

取糞樣，用商品化DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，提取步驟按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。1周內(nèi)使

用到的DNA，放置于4℃冰箱中；需要長(zhǎng)期保存的DNA，放置于-20℃冰箱中。

9.2.2PCR擴(kuò)增

9.2.2.1PCR擴(kuò)增引物

針對(duì)線蟲線粒體細(xì)胞色素C氧化酶第一亞基（COXI）基因設(shè)計(jì)引物，此引物靈敏度和特異性較高。

上下游引物序列如下：

JB3：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′；JB4.5：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′。

9.2.2.2PCR擴(kuò)增體系

PCR擴(kuò)增體系為25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，無菌水10.5μL，引物JB3和JB4.5

各0.5μL，DNA模板1.0μL。

9.2.2.3PCR擴(kuò)增程序

用PCR擴(kuò)增儀設(shè)置反應(yīng)程序，94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，設(shè)

置36個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后72℃延伸5min，16℃結(jié)束反應(yīng)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

9.2.2.4PCR產(chǎn)物檢測(cè)

PCR擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物5μL，加入1%瓊脂糖凝膠電泳孔中，以DL2000DNAMarker作為參照，

110V電壓電泳30min。將凝膠取出放入紫外凝膠成像儀中觀察并拍照。若出現(xiàn)預(yù)期的420bp左右的條

帶，擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序后驗(yàn)證。

10試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

3

DB53/T1059.2—2021

10.1蟲卵檢測(cè)

經(jīng)飽和食鹽水漂浮法鏡檢發(fā)現(xiàn)如附錄B中圖B.1所示的蟲卵，直接判定為滇金絲猴毛首線蟲感染陽

性。若發(fā)現(xiàn)存疑蟲卵，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBIGenBank中的序列進(jìn)行BLAST在

線比對(duì)，判定是否為滇金絲猴毛首線蟲感染陽性。

10.2蟲體檢測(cè)

對(duì)蟲體進(jìn)行鏡檢觀察到如附錄B中B.2描述的蟲體，直接判定為滇金絲猴毛首線蟲感染陽性。若發(fā)現(xiàn)

存疑蟲體，對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBIGenBank中的序列進(jìn)行BLAST在線比對(duì)，判

定是否為滇金絲猴毛首線蟲感染陽性。

BA

4

DB53/T1059.2—2021

CA

附錄A

（規(guī)范性）

糞樣的采集和保存方法

A.1采樣工具

一次性PE手套、自封袋、樣品管、記號(hào)筆、標(biāo)簽紙等。

A.2糞樣新鮮程度判定

將糞便樣品放于自封袋，根據(jù)糞便表面的濕潤(rùn)程度、完整程度以及氣味等條件，判斷糞便樣品的新

鮮程度并記錄。

A.3糞樣的選取原則

A.3.1應(yīng)采集滇金絲猴新鮮糞樣，同一堆糞樣只采集一份樣品，兩堆樣品的距離應(yīng)大于3m。

A.3.2如遇到滇金絲猴母幼糞樣應(yīng)分開采集；依據(jù)母猴和幼猴的糞樣大小有明顯差異作出判斷，并在

備注欄記錄。

A.4樣品采集方法

A.4.1采集糞樣外部和內(nèi)部的樣品，每次采樣時(shí)應(yīng)更換新的PE手套，以避免樣品間的交叉污染。

A.4.2采集時(shí)，直接剝?nèi)》蛛x新鮮糞樣的表層部分和內(nèi)部部分，分別放入自封袋，貼上樣品標(biāo)簽紙，

寫上樣品編號(hào)，將樣品管放入自封袋，并再次寫上樣品編號(hào)。

A.4.3同一堆糞樣應(yīng)盡量多取樣品。

A.5樣品記錄與編號(hào)

在采集糞樣時(shí)，應(yīng)填寫《滇金絲猴糞樣采集記錄表》（見表A.1）。記錄采