基于同源比對(duì)和從頭挖掘的大黃魚(yú)miRNA預(yù)測(cè)：方法、驗(yàn)證與應(yīng)用一、引言1.1研究背景在生命科學(xué)領(lǐng)域，非編碼RNA（non-codingRNA）近年來(lái)成為研究的焦點(diǎn)之一。非編碼RNA是指一類(lèi)本身不攜帶可以翻譯為蛋白質(zhì)的遺傳信息，但卻能執(zhí)行多種生物學(xué)功能的RNA分子。它們廣泛存在于各種生物體內(nèi)，種類(lèi)繁多，包括tRNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA）、rRNA（核糖體RNA）、lncRNA（長(zhǎng)鏈非編碼RNA）、miRNA（微小核糖核酸）、siRNA（小干擾RNA）、cirRNA（環(huán)狀RNA）、piRNA（Piwi相互作用RNA）、snRNA（小核RNA）等。這些非編碼RNA在生物體內(nèi)各自承擔(dān)著獨(dú)特且關(guān)鍵的角色。tRNA負(fù)責(zé)攜帶氨基酸進(jìn)入核糖體，在mRNA的指導(dǎo)下參與蛋白質(zhì)的合成過(guò)程，如同精密生產(chǎn)線中的原料運(yùn)輸員，確保蛋白質(zhì)合成所需的氨基酸能夠準(zhǔn)確無(wú)誤地被送達(dá)指定位置。rRNA則與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體，為mRNA翻譯成蛋白質(zhì)提供了必要的場(chǎng)所，是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵“工廠”。snRNA主要參與RNA前體的加工過(guò)程，是RNA剪切體的重要組成成分，對(duì)RNA的成熟和功能發(fā)揮起著不可或缺的作用。而miRNA作為非編碼RNA家族中的重要成員，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和廣泛的調(diào)控功能。它是一類(lèi)長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA。自1993年首次在秀麗隱桿線蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，越來(lái)越多的研究揭示了miRNA在生物體內(nèi)的關(guān)鍵作用。miRNA主要通過(guò)與靶信使核糖核酸（mRNA）特異結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、生物體發(fā)育時(shí)序等諸多方面都發(fā)揮著重要作用。在動(dòng)物中，一個(gè)miRNA通?？梢哉{(diào)控?cái)?shù)十個(gè)基因，這意味著miRNA能夠通過(guò)構(gòu)建復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，精細(xì)地調(diào)節(jié)生物體的各種生理過(guò)程。在基因表達(dá)調(diào)控方面，當(dāng)細(xì)胞面臨環(huán)境變化或發(fā)育信號(hào)時(shí)，miRNA能夠迅速響應(yīng)，通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過(guò)程，或者促使mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)水平的精準(zhǔn)調(diào)控。在細(xì)胞周期調(diào)控中，miRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞從一個(gè)周期階段進(jìn)入下一個(gè)階段的進(jìn)程，確保細(xì)胞增殖和分化的有序進(jìn)行。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，miRNA同樣扮演著關(guān)鍵角色，它能夠通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，決定細(xì)胞是否走向凋亡，這對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)和個(gè)體發(fā)育具有重要意義。在生物體的發(fā)育過(guò)程中，miRNA的調(diào)控作用更是無(wú)處不在。從胚胎發(fā)育的早期階段開(kāi)始，miRNA就參與了細(xì)胞分化、組織器官形成等關(guān)鍵過(guò)程。在胚胎干細(xì)胞向不同組織細(xì)胞分化的過(guò)程中，特定的miRNA表達(dá)譜會(huì)發(fā)生變化，它們通過(guò)調(diào)控一系列基因的表達(dá)，引導(dǎo)干細(xì)胞向特定的細(xì)胞類(lèi)型分化，最終形成各種組織和器官。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，某些miRNA對(duì)于神經(jīng)元的分化、遷移和突觸形成起著至關(guān)重要的作用；在心血管系統(tǒng)發(fā)育中，miRNA也參與了心臟和血管的形成與發(fā)育過(guò)程。隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力也逐漸被揭示出來(lái)。在疾病的診斷、治療以及預(yù)后判斷等方面，miRNA都展現(xiàn)出了巨大的價(jià)值。在癌癥診斷和預(yù)后方面，miRNA可以作為腫瘤標(biāo)志物，用于早期癌癥的檢測(cè)。由于腫瘤細(xì)胞的異常增殖和分化往往伴隨著miRNA表達(dá)譜的改變，通過(guò)檢測(cè)血液、組織或其他生物樣本中的miRNA水平，能夠?yàn)榘┌Y的早期診斷提供重要依據(jù)。某些miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于或低于正常組織，這些差異表達(dá)的miRNA可以作為潛在的診斷標(biāo)志物，幫助醫(yī)生更早地發(fā)現(xiàn)癌癥，提高治療成功率。在治療方面，miRNA被研究作為治療靶點(diǎn)，用于開(kāi)發(fā)新的治療方法。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)特定miRNA的拮抗劑或激動(dòng)劑，能夠調(diào)節(jié)其表達(dá)水平，從而干預(yù)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。針對(duì)在腫瘤中高表達(dá)的致癌miRNA，可以設(shè)計(jì)拮抗劑來(lái)抑制其功能，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的；而對(duì)于在疾病中低表達(dá)的抑癌miRNA，則可以通過(guò)導(dǎo)入外源的miRNA或使用激動(dòng)劑來(lái)提高其表達(dá)水平，發(fā)揮治療作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，魚(yú)類(lèi)的健康和生長(zhǎng)性能對(duì)于產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。大黃魚(yú)（Larimichthyscrocea）作為中國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，在大黃魚(yú)的養(yǎng)殖過(guò)程中，面臨著各種疾病的威脅以及生長(zhǎng)性能提升的挑戰(zhàn)。了解大黃魚(yú)的基因調(diào)控機(jī)制，對(duì)于提高其抗病能力和生長(zhǎng)性能具有重要意義。miRNA作為基因表達(dá)的重要調(diào)控因子，在大黃魚(yú)的生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫等生理過(guò)程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過(guò)對(duì)大黃魚(yú)miRNA的研究，可以深入揭示其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為解決大黃魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中面臨的問(wèn)題提供理論基礎(chǔ)。目前，雖然對(duì)模式生物的miRNA研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但對(duì)于大黃魚(yú)這類(lèi)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)的miRNA研究還相對(duì)較少。大黃魚(yú)的基因組信息相對(duì)復(fù)雜，其miRNA的種類(lèi)、功能以及調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。因此，基于同源比對(duì)和從頭挖掘方法對(duì)大黃魚(yú)miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)于豐富大黃魚(yú)的基因資源、深入了解其生物學(xué)特性以及推動(dòng)大黃魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的必要性和迫切性。1.2miRNA研究的意義miRNA作為一類(lèi)長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，在生物體中扮演著極為重要的角色。其生物合成過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控過(guò)程。首先，miRNA基因在細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（pri-miRNA），這一過(guò)程受到多種轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控元件的影響。pri-miRNA具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)百至數(shù)千個(gè)核苷酸。隨后，pri-miRNA在核酸酶Drosha及其輔助因子Pasha的作用下，被切割成約70個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA依然保持著莖環(huán)結(jié)構(gòu)。接著，pre-miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)受體Exportin-5的協(xié)助下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被另一種核酸酶Dicer識(shí)別并切割，最終形成成熟的miRNA，成熟的miRNA通常由21-23個(gè)核苷酸組成。在基因表達(dá)調(diào)控方面，miRNA主要通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'UTR結(jié)合后，會(huì)抑制mRNA的翻譯過(guò)程，阻止核糖體與mRNA結(jié)合，使得蛋白質(zhì)合成無(wú)法正常進(jìn)行；在某些情況下，miRNA與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)程度較高時(shí)，還會(huì)引發(fā)mRNA的降解，從而減少靶mRNA的數(shù)量，進(jìn)一步降低基因的表達(dá)水平。一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，同時(shí)一個(gè)靶基因也可能受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA能夠精細(xì)地調(diào)節(jié)生物體的各種生理過(guò)程。在細(xì)胞周期調(diào)控中，miRNA參與了細(xì)胞從G1期到S期、S期到G2期以及G2期到M期等各個(gè)階段的轉(zhuǎn)換過(guò)程。某些miRNA可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）抑制劑的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展；而另一些miRNA則可以通過(guò)調(diào)控與DNA復(fù)制、修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)，影響細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，miRNA同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。一些miRNA可以通過(guò)抑制抗凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；而另一些miRNA則可以通過(guò)增強(qiáng)促凋亡基因的表達(dá)，加速細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，miRNA的表達(dá)具有時(shí)空特異性，它們?cè)诓煌陌l(fā)育階段和組織器官中發(fā)揮著獨(dú)特的調(diào)控作用。在胚胎干細(xì)胞分化為不同胚層細(xì)胞的過(guò)程中，特定的miRNA表達(dá)譜會(huì)發(fā)生改變，這些miRNA通過(guò)調(diào)控與細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)，引導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向特定的細(xì)胞類(lèi)型分化。在魚(yú)類(lèi)研究中，miRNA同樣展現(xiàn)出了重要的潛在價(jià)值。在魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育方面，miRNA參與了魚(yú)類(lèi)從胚胎發(fā)育到成魚(yú)的各個(gè)階段。在胚胎發(fā)育早期，miRNA對(duì)魚(yú)類(lèi)的器官形成和組織分化起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA在魚(yú)類(lèi)心臟、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)等器官的發(fā)育過(guò)程中表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響器官的正常發(fā)育。在魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)過(guò)程中，miRNA也參與了生長(zhǎng)激素信號(hào)通路等與生長(zhǎng)相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)速度和體型大小產(chǎn)生影響。在魚(yú)類(lèi)的免疫防御方面，miRNA在魚(yú)類(lèi)抵御病原體入侵的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)魚(yú)類(lèi)受到病毒、細(xì)菌等病原體感染時(shí)，體內(nèi)的miRNA表達(dá)譜會(huì)發(fā)生改變，一些miRNA可以通過(guò)調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)的免疫應(yīng)答能力，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖，提高魚(yú)類(lèi)對(duì)病原體的抵抗力；而另一些miRNA則可能在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮作用，防止過(guò)度免疫反應(yīng)對(duì)魚(yú)類(lèi)自身組織造成損傷。對(duì)于大黃魚(yú)這一重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，研究其miRNA具有重要的經(jīng)濟(jì)和科學(xué)意義。在大黃魚(yú)的養(yǎng)殖過(guò)程中，病害的發(fā)生嚴(yán)重影響了大黃魚(yú)的產(chǎn)量和質(zhì)量，給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通過(guò)研究大黃魚(yú)miRNA在免疫調(diào)控中的作用機(jī)制，可以揭示大黃魚(yú)的免疫防御機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的病害防治策略提供理論依據(jù)?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)控miRNA的表達(dá)水平，增強(qiáng)大黃魚(yú)的免疫力，提高其對(duì)病害的抵抗力。在大黃魚(yú)的生長(zhǎng)性能方面，研究miRNA對(duì)生長(zhǎng)相關(guān)基因的調(diào)控作用，有助于深入了解大黃魚(yú)的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，為培育生長(zhǎng)速度快、體型大的優(yōu)良大黃魚(yú)品種提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。通過(guò)篩選與生長(zhǎng)性能相關(guān)的miRNA，并對(duì)其進(jìn)行遺傳改良，有望提高大黃魚(yú)的養(yǎng)殖效益，推動(dòng)大黃魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。1.3miRNA挖掘方法的原理及應(yīng)用隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，基于生物信息學(xué)方法挖掘miRNA成為了研究的重要手段。目前，主要的miRNA挖掘方法包括同源比對(duì)和從頭挖掘，它們?cè)趍iRNA的發(fā)現(xiàn)和研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。同源比對(duì)方法是基于miRNA在物種間具有高度保守性這一特性而發(fā)展起來(lái)的。其基本原理是利用已知物種的miRNA序列作為查詢(xún)序列，在目標(biāo)物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行相似性搜索。通過(guò)將已知的miRNA序列與目標(biāo)物種的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，尋找具有高度相似性的區(qū)域，從而推測(cè)這些區(qū)域可能是潛在的miRNA。在進(jìn)行同源比對(duì)時(shí)，通常會(huì)使用一些專(zhuān)門(mén)的比對(duì)工具，如BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）等。BLAST能夠快速地在大規(guī)模的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索與查詢(xún)序列相似的片段，并計(jì)算出它們之間的相似性得分和比對(duì)長(zhǎng)度等信息。當(dāng)使用已知的人源miRNA序列在大黃魚(yú)的基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行同源比對(duì)時(shí)，BLAST會(huì)將人源miRNA序列與大黃魚(yú)基因組中的每一條序列進(jìn)行比對(duì)，找出那些與miRNA序列具有較高相似性的區(qū)域。如果在大黃魚(yú)基因組中發(fā)現(xiàn)了與已知miRNA序列相似性較高的區(qū)域，且這些區(qū)域滿(mǎn)足miRNA的一些特征，如具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)等，那么就可以初步認(rèn)為這些區(qū)域可能是大黃魚(yú)中的miRNA。同源比對(duì)方法的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性較高，因?yàn)樗昧艘阎猰iRNA的信息，能夠快速地在目標(biāo)物種中找到與之相似的miRNA。它的局限性在于依賴(lài)于已知物種的miRNA數(shù)據(jù)，如果目標(biāo)物種與已知物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能會(huì)導(dǎo)致漏檢一些獨(dú)特的miRNA。從頭挖掘方法則是不依賴(lài)于已知的miRNA信息，直接從目標(biāo)物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中預(yù)測(cè)潛在的miRNA。這種方法主要基于miRNA的一些特征，如特定的長(zhǎng)度范圍、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)穩(wěn)定性等。在從頭挖掘過(guò)程中，首先需要對(duì)目標(biāo)物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，去除冗余序列和低質(zhì)量序列等。然后，利用專(zhuān)門(mén)的算法和軟件對(duì)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其中可能的miRNA前體。常用的從頭挖掘軟件有miRDeep2、RNAz等。miRDeep2通過(guò)分析小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，結(jié)合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)模式等信息，預(yù)測(cè)潛在的miRNA。它首先會(huì)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)中的小RNA序列進(jìn)行聚類(lèi)，然后分析這些聚類(lèi)后的序列是否具有miRNA前體的典型特征，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)、Dicer酶切割位點(diǎn)等。如果一個(gè)小RNA序列所在的區(qū)域具有穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且在該區(qū)域附近存在Dicer酶切割位點(diǎn)，那么這個(gè)區(qū)域就有可能是miRNA前體。RNAz則主要通過(guò)分析RNA序列的熱力學(xué)穩(wěn)定性來(lái)預(yù)測(cè)miRNA。它認(rèn)為，miRNA前體由于具有特定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其熱力學(xué)穩(wěn)定性會(huì)比隨機(jī)序列更高。通過(guò)計(jì)算RNA序列的熱力學(xué)穩(wěn)定性，RNAz能夠篩選出那些具有較高穩(wěn)定性的區(qū)域，這些區(qū)域可能是潛在的miRNA前體。從頭挖掘方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠發(fā)現(xiàn)一些新的、獨(dú)特的miRNA，尤其是那些在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的物種特異性miRNA。它的缺點(diǎn)是假陽(yáng)性率相對(duì)較高，因?yàn)樵陬A(yù)測(cè)過(guò)程中可能會(huì)將一些具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)但并非miRNA的序列誤判為miRNA，需要進(jìn)行大量的后續(xù)驗(yàn)證工作。在生物信息學(xué)方法挖掘miRNA的流程中，機(jī)器學(xué)習(xí)也發(fā)揮著重要的作用。機(jī)器學(xué)習(xí)算法可以通過(guò)對(duì)已知miRNA及其特征的學(xué)習(xí)，構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，從而對(duì)未知的序列進(jìn)行分類(lèi)和預(yù)測(cè)。支持向量機(jī)（SVM，SupportVectorMachine）是一種常用的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，在miRNA預(yù)測(cè)中也有廣泛應(yīng)用。SVM通過(guò)尋找一個(gè)最優(yōu)的分類(lèi)超平面，將已知的miRNA序列和非miRNA序列區(qū)分開(kāi)來(lái)。在訓(xùn)練過(guò)程中，SVM會(huì)根據(jù)已知miRNA的特征，如序列長(zhǎng)度、堿基組成、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等，調(diào)整分類(lèi)超平面的參數(shù)，使得該超平面能夠盡可能準(zhǔn)確地將miRNA和非miRNA區(qū)分開(kāi)。當(dāng)有新的序列需要預(yù)測(cè)時(shí)，SVM會(huì)將該序列的特征輸入到訓(xùn)練好的模型中，根據(jù)模型的輸出判斷該序列是否為miRNA。隨機(jī)森林（RandomForest）也是一種常用的機(jī)器學(xué)習(xí)算法。它通過(guò)構(gòu)建多個(gè)決策樹(shù)，并對(duì)這些決策樹(shù)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合，來(lái)提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。在miRNA預(yù)測(cè)中，隨機(jī)森林可以利用多個(gè)特征對(duì)序列進(jìn)行分類(lèi)，從而更全面地考慮序列的信息，減少誤判的可能性。除了上述方法和算法外，還有一些常用的軟件工具在miRNA挖掘中發(fā)揮著重要作用。miRanda是一款廣泛使用的miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件，它通過(guò)計(jì)算miRNA與靶mRNA之間的互補(bǔ)性和結(jié)合自由能等參數(shù)，預(yù)測(cè)miRNA可能的靶基因。在使用miRanda時(shí)，需要輸入miRNA序列和靶mRNA序列，軟件會(huì)根據(jù)預(yù)設(shè)的算法計(jì)算兩者之間的互補(bǔ)性得分和結(jié)合自由能，得分較高且結(jié)合自由能較低的靶mRNA被認(rèn)為是miRNA的潛在靶基因。TargetScan也是一款常用的miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件，它主要基于miRNA種子序列與靶mRNA3'UTR區(qū)域的互補(bǔ)性來(lái)預(yù)測(cè)靶基因。TargetScan通過(guò)分析大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，建立了一套預(yù)測(cè)模型，能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。1.4miRNA靶基因預(yù)測(cè)及分析準(zhǔn)確預(yù)測(cè)miRNA的靶基因?qū)τ谏钊肜斫鈓iRNA的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。miRNA主要通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）特異性結(jié)合，從而抑制mRNA的翻譯過(guò)程或者促使mRNA降解，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。因此，預(yù)測(cè)miRNA靶基因的方法主要基于miRNA與mRNA之間的互補(bǔ)配對(duì)原則以及相關(guān)的生物學(xué)特征。目前，常用的miRNA靶基因預(yù)測(cè)方法主要有基于生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)方法和基于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法。基于生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)方法是利用計(jì)算機(jī)算法和數(shù)據(jù)分析技術(shù)，根據(jù)miRNA和mRNA的序列特征、結(jié)構(gòu)特征以及物種間的保守性等信息，預(yù)測(cè)miRNA可能的靶基因。常見(jiàn)的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具包括TargetScan、miRanda、PicTar等。TargetScan主要基于miRNA種子序列（miRNA5'端第2-8個(gè)核苷酸）與靶mRNA3'UTR區(qū)域的互補(bǔ)性進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)考慮了位點(diǎn)的保守性和熱力學(xué)穩(wěn)定性等因素。它通過(guò)分析大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，建立了一套較為完善的預(yù)測(cè)模型，能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。miRanda則通過(guò)計(jì)算miRNA與靶mRNA之間的互補(bǔ)性得分和結(jié)合自由能等參數(shù)，來(lái)預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。它不僅考慮了miRNA與mRNA的堿基配對(duì)情況，還對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估，能夠篩選出與miRNA具有較強(qiáng)結(jié)合能力的靶mRNA。PicTar則綜合考慮了多個(gè)物種間的保守性、miRNA與mRNA的互補(bǔ)性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素，通過(guò)構(gòu)建復(fù)雜的預(yù)測(cè)模型來(lái)提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。這些生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中，通常會(huì)結(jié)合多種工具的預(yù)測(cè)結(jié)果，以提高預(yù)測(cè)的可靠性?；趯?shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法則是通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段直接驗(yàn)證miRNA與靶基因之間的相互作用關(guān)系。常用的實(shí)驗(yàn)方法包括熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)、基因芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)等。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是將miRNA的靶基因3'UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報(bào)告基因載體中，然后將該載體與miRNA共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。如果miRNA能夠與靶基因3'UTR結(jié)合，就會(huì)抑制熒光素酶的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的活性，就可以判斷miRNA與靶基因之間是否存在相互作用。RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)則是利用特異性抗體將與miRNA結(jié)合的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)鑒定與miRNA結(jié)合的mRNA，從而確定miRNA的靶基因?；蛐酒夹g(shù)可以同時(shí)檢測(cè)大量基因的表達(dá)水平，通過(guò)比較miRNA過(guò)表達(dá)或敲低前后靶基因的表達(dá)變化，來(lái)篩選出受miRNA調(diào)控的靶基因。蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)則是通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，來(lái)驗(yàn)證miRNA對(duì)靶基因翻譯過(guò)程的影響。這些實(shí)驗(yàn)方法雖然能夠直接驗(yàn)證miRNA與靶基因之間的相互作用關(guān)系，但實(shí)驗(yàn)操作較為復(fù)雜，成本較高，且通量較低，不適用于大規(guī)模的靶基因篩選。對(duì)預(yù)測(cè)得到的miRNA靶基因進(jìn)行基因本體（GO，GeneOntology）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG，KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）分析，能夠深入了解miRNA在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能等方面的調(diào)控作用以及參與的信號(hào)通路。GO分析主要從生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)層面，對(duì)基因進(jìn)行功能注釋和分類(lèi)。在生物學(xué)過(guò)程層面，通過(guò)分析靶基因參與的生物過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝等，能夠揭示miRNA在這些過(guò)程中的調(diào)控作用。如果某個(gè)miRNA的靶基因主要富集在細(xì)胞增殖相關(guān)的生物過(guò)程中，那么可以推測(cè)該miRNA可能在細(xì)胞增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在細(xì)胞組成層面，分析靶基因在細(xì)胞內(nèi)的定位，如細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等，有助于了解miRNA對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。在分子功能層面，分析靶基因所具有的分子功能，如酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、受體活性等，能夠進(jìn)一步明確miRNA的作用機(jī)制。KEGG分析則主要關(guān)注基因參與的信號(hào)通路，通過(guò)將靶基因映射到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知信號(hào)通路，能夠識(shí)別出miRNA可能參與調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在癌癥相關(guān)的研究中，發(fā)現(xiàn)某些miRNA的靶基因富集在PI3K-Akt信號(hào)通路中，這表明該miRNA可能通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移等過(guò)程。在免疫相關(guān)的研究中，KEGG分析可以揭示miRNA對(duì)免疫細(xì)胞活化、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)等信號(hào)通路的影響，從而為深入理解免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供線索。通過(guò)GO和KEGG分析，可以將miRNA靶基因的功能信息進(jìn)行系統(tǒng)整合和分析，構(gòu)建出miRNA-靶基因-功能/信號(hào)通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而全面、深入地了解miRNA在生物體內(nèi)的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制。1.5與miRNA相關(guān)的SNP單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP）是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異而形成的DNA序列多態(tài)性。它是繼短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）為代表的第2代DNA遺傳標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的第3代遺傳標(biāo)記。SNP在基因組中廣泛分布，人類(lèi)基因組中平均每500至1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)SNP，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。SNP的形成主要源于單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換（如C←→T，在其互補(bǔ)鏈上則為G←→A）、顛換（如C←→A，G←→T，C←→G，A←→T）、插入或缺失，但通常所說(shuō)的SNP并不包括插入和缺失情況。從對(duì)生物遺傳性狀的影響角度，SNP可分為同義SNP和非同義SNP。同義SNP不會(huì)改變編碼氨基酸，而非同義SNP則會(huì)改變編碼氨基酸，進(jìn)而可能影響蛋白質(zhì)的功能。與miRNA相關(guān)的SNP（miRNA-relatedSNP）是指位于miRNA基因序列、前體結(jié)構(gòu)區(qū)域、與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)或參與miRNA生物合成和調(diào)控通路相關(guān)基因上的SNP。這些SNP可能會(huì)對(duì)miRNA的功能產(chǎn)生重要影響。當(dāng)SNP位于miRNA的種子序列區(qū)域時(shí)，由于種子序列是miRNA與靶mRNA結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，該區(qū)域的SNP可能會(huì)改變miRNA與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)情況，從而影響miRNA對(duì)靶基因的識(shí)別和調(diào)控作用。如果種子序列中的某個(gè)核苷酸發(fā)生突變，原本能夠與靶mRNA有效結(jié)合的miRNA可能無(wú)法再準(zhǔn)確識(shí)別靶位點(diǎn)，導(dǎo)致對(duì)靶基因的調(diào)控失效，進(jìn)而影響相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。若SNP位于miRNA的前體結(jié)構(gòu)區(qū)域，可能會(huì)影響miRNA前體的加工和成熟過(guò)程。miRNA的生物合成需要經(jīng)過(guò)一系列精確的加工步驟，從初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（pri-miRNA）到前體miRNA（pre-miRNA），再到成熟的miRNA。前體結(jié)構(gòu)區(qū)域的SNP可能會(huì)改變pre-miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響Drosha、Dicer等核酸酶對(duì)其的識(shí)別和切割，從而導(dǎo)致成熟miRNA的生成量減少或功能異常。位于miRNA靶基因結(jié)合位點(diǎn)的SNP也可能對(duì)miRNA-靶基因相互作用產(chǎn)生影響。這種SNP可能會(huì)使靶基因的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，使得miRNA無(wú)法與靶基因正常結(jié)合，或者結(jié)合能力增強(qiáng)或減弱。如果結(jié)合位點(diǎn)的SNP導(dǎo)致miRNA與靶基因的結(jié)合能力減弱，那么miRNA對(duì)靶基因的抑制作用就會(huì)降低，靶基因的表達(dá)水平可能會(huì)升高，進(jìn)而影響細(xì)胞的生理功能。在人類(lèi)疾病研究中，miRNA-relatedSNP已被發(fā)現(xiàn)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在癌癥方面，某些miRNA-relatedSNP可能會(huì)影響miRNA對(duì)癌基因或抑癌基因的調(diào)控，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在心血管疾病中，相關(guān)SNP可能會(huì)干擾miRNA對(duì)心血管系統(tǒng)發(fā)育和功能相關(guān)基因的調(diào)控，增加患病風(fēng)險(xiǎn)。在大黃魚(yú)的研究中，雖然目前關(guān)于miRNA-relatedSNP的報(bào)道相對(duì)較少，但鑒于SNP在基因調(diào)控和生物性狀影響方面的重要作用，研究大黃魚(yú)中的miRNA-relatedSNP對(duì)于深入了解大黃魚(yú)的生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫等生理過(guò)程的分子機(jī)制具有潛在的重要意義。1.6本課題研究目的與內(nèi)容本研究旨在通過(guò)同源比對(duì)和從頭挖掘方法，系統(tǒng)地預(yù)測(cè)大黃魚(yú)中的miRNA，并對(duì)其靶基因進(jìn)行分析，以揭示大黃魚(yú)miRNA的種類(lèi)、功能及其在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用。在研究?jī)?nèi)容方面，首先是數(shù)據(jù)收集與預(yù)處理，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)或?qū)嶒?yàn)室測(cè)序數(shù)據(jù)中獲取大黃魚(yú)的基因組序列、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及已知物種的miRNA序列。對(duì)獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和預(yù)處理，去除低質(zhì)量序列、重復(fù)序列以及污染序列等，確保數(shù)據(jù)的可靠性和可用性。利用已知物種的miRNA序列作為查詢(xún)序列，在大黃魚(yú)的基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行同源比對(duì)分析。使用BLAST等比對(duì)工具，設(shè)置合適的比對(duì)參數(shù)，尋找與已知miRNA具有高度相似性的序列。對(duì)同源比對(duì)得到的候選miRNA序列進(jìn)行進(jìn)一步篩選，根據(jù)miRNA的結(jié)構(gòu)特征，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)、成熟miRNA的長(zhǎng)度范圍等，排除不符合條件的序列，確定潛在的miRNA。運(yùn)用從頭挖掘方法，直接從大黃魚(yú)的基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中預(yù)測(cè)新的miRNA。選擇miRDeep2、RNAz等從頭挖掘軟件，根據(jù)軟件的算法和參數(shù)要求，對(duì)大黃魚(yú)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。miRDeep2通過(guò)分析小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，結(jié)合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)模式等信息，預(yù)測(cè)潛在的miRNA；RNAz則主要通過(guò)分析RNA序列的熱力學(xué)穩(wěn)定性來(lái)預(yù)測(cè)miRNA。對(duì)從頭挖掘得到的候選miRNA進(jìn)行驗(yàn)證和篩選，通過(guò)與已知的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，排除已有的miRNA，確定新發(fā)現(xiàn)的miRNA。利用生物信息學(xué)工具，如TargetScan、miRanda等，對(duì)預(yù)測(cè)得到的大黃魚(yú)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。這些工具基于miRNA與靶mRNA之間的互補(bǔ)配對(duì)原則以及相關(guān)的生物學(xué)特征，如種子序列的互補(bǔ)性、結(jié)合自由能等，預(yù)測(cè)miRNA可能的靶基因。對(duì)多個(gè)預(yù)測(cè)工具的結(jié)果進(jìn)行整合和分析，取交集或根據(jù)一定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)篩選出可信度較高的靶基因。對(duì)預(yù)測(cè)得到的miRNA靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析。GO分析從生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)層面，對(duì)靶基因進(jìn)行功能注釋和分類(lèi)，揭示miRNA在這些方面的調(diào)控作用。KEGG分析則將靶基因映射到已知的信號(hào)通路中，識(shí)別miRNA可能參與調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，構(gòu)建miRNA-靶基因-功能/信號(hào)通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證部分預(yù)測(cè)結(jié)果，采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)等方法，驗(yàn)證miRNA與靶基因之間的相互作用關(guān)系。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA和靶基因在不同組織、不同發(fā)育階段或不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)水平，分析它們之間的表達(dá)相關(guān)性，進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。二、大黃魚(yú)miRNA挖掘流程搭建與優(yōu)化2.1材料和方法2.1.1數(shù)據(jù)準(zhǔn)備及處理從NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載大黃魚(yú)的全基因組序列數(shù)據(jù)，確保獲取的基因組序列為最新版本，以保證數(shù)據(jù)的完整性和準(zhǔn)確性。從前期實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大黃魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)涵蓋了大黃魚(yú)的多個(gè)組織和發(fā)育階段，包括肝臟、肌肉、脾臟、胚胎期、幼魚(yú)期等，以全面反映大黃魚(yú)在不同生理狀態(tài)下的基因表達(dá)情況。從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)下載已知物種的成熟miRNA序列數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)是目前最權(quán)威的miRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)，包含了來(lái)自多個(gè)物種的大量miRNA序列信息，為同源比對(duì)分析提供了豐富的參考序列。運(yùn)用FastQC軟件對(duì)下載的大黃魚(yú)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，該軟件可以對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行多方面的分析，包括堿基質(zhì)量分布、序列長(zhǎng)度分布、GC含量分布等。通過(guò)分析報(bào)告，評(píng)估數(shù)據(jù)中是否存在低質(zhì)量堿基、測(cè)序錯(cuò)誤、污染序列等問(wèn)題。利用Trimmomatic軟件對(duì)質(zhì)量評(píng)估不合格的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，去除低質(zhì)量序列、接頭序列和污染序列等。設(shè)置合適的參數(shù)，如滑動(dòng)窗口大小、平均質(zhì)量閾值等，以確保去除低質(zhì)量部分的同時(shí)保留有效序列。對(duì)于存在大量冗余的序列，使用CD-HIT軟件進(jìn)行去冗余處理，減少數(shù)據(jù)量，提高后續(xù)分析的效率。2.1.2基于同源比對(duì)方法挖掘miRNA的數(shù)據(jù)處理及流程搭建將下載并預(yù)處理后的大黃魚(yú)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)存儲(chǔ)于本地服務(wù)器的指定文件夾中，為后續(xù)分析提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)下載的已知物種成熟miRNA序列作為查詢(xún)序列，運(yùn)用BLAST軟件在大黃魚(yú)的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行同源比對(duì)分析。在BLAST分析中，設(shè)置合適的參數(shù)，如E值（Expectvalue）閾值為1e-5，該閾值用于衡量比對(duì)結(jié)果的顯著性，較低的E值表示比對(duì)結(jié)果越可靠；匹配分?jǐn)?shù)閾值為30，只有比對(duì)分?jǐn)?shù)達(dá)到或超過(guò)該閾值的結(jié)果才被考慮；其他參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置。通過(guò)這些參數(shù)的設(shè)置，篩選出與已知miRNA序列具有高度相似性的候選序列。對(duì)BLAST比對(duì)得到的候選序列進(jìn)行初步篩選，去除那些E值大于設(shè)定閾值、匹配分?jǐn)?shù)低于設(shè)定閾值或比對(duì)長(zhǎng)度過(guò)短的序列，保留具有較高可信度的候選序列。使用RNAfold軟件對(duì)篩選后的候選序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，該軟件基于最小自由能原理，能夠預(yù)測(cè)RNA序列可能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。分析候選序列是否能形成典型的miRNA前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)，包括莖的長(zhǎng)度、環(huán)的大小和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等特征。根據(jù)RNAfold預(yù)測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步篩選出具有典型莖環(huán)結(jié)構(gòu)的候選序列，這些序列更有可能是真正的miRNA前體。將篩選得到的候選miRNA序列與已知的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行再次比對(duì)，排除那些已經(jīng)被注釋的miRNA序列，以確保發(fā)現(xiàn)的是新的miRNA。對(duì)于剩余的候選miRNA序列，使用生物信息學(xué)工具進(jìn)行進(jìn)一步的分析和驗(yàn)證，如預(yù)測(cè)其成熟miRNA的序列、分析其與靶基因的潛在結(jié)合位點(diǎn)等。通過(guò)綜合分析，確定最終的潛在miRNA序列，構(gòu)建基于同源比對(duì)方法挖掘大黃魚(yú)miRNA的流程。2.1.3基于從頭預(yù)測(cè)方法挖掘miRNA流程將經(jīng)過(guò)質(zhì)量評(píng)估和預(yù)處理的大黃魚(yú)基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為從頭預(yù)測(cè)的輸入數(shù)據(jù)，確保數(shù)據(jù)的可靠性和可用性。選擇miRDeep2軟件進(jìn)行從頭預(yù)測(cè)分析，該軟件能夠綜合分析小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)、miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)模式等信息，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)潛在的miRNA。按照miRDeep2軟件的要求，準(zhǔn)備輸入文件，包括小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)文件、基因組或轉(zhuǎn)錄組序列文件等，并設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，如最小讀長(zhǎng)、最大讀長(zhǎng)、最小自由能閾值等。這些參數(shù)的設(shè)置會(huì)影響預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度，需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)化。miRDeep2軟件首先對(duì)小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，將測(cè)序reads比對(duì)到大黃魚(yú)的基因組或轉(zhuǎn)錄組序列上，確定小RNA在基因組中的位置。分析這些小RNA的表達(dá)模式，包括在不同組織、不同發(fā)育階段的表達(dá)水平變化等。結(jié)合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、Dicer酶切割位點(diǎn)等信息，預(yù)測(cè)潛在的miRNA前體。對(duì)于預(yù)測(cè)得到的miRNA前體，進(jìn)一步分析其成熟miRNA的生成位點(diǎn)和序列信息，確定可能的成熟miRNA。使用RNAz軟件對(duì)miRDeep2預(yù)測(cè)得到的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和補(bǔ)充分析。RNAz主要通過(guò)分析RNA序列的熱力學(xué)穩(wěn)定性來(lái)預(yù)測(cè)miRNA，它認(rèn)為miRNA前體由于具有特定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其熱力學(xué)穩(wěn)定性會(huì)比隨機(jī)序列更高。將miRDeep2預(yù)測(cè)得到的候選miRNA前體序列輸入RNAz軟件，計(jì)算其熱力學(xué)穩(wěn)定性。根據(jù)熱力學(xué)穩(wěn)定性的計(jì)算結(jié)果，篩選出具有較高穩(wěn)定性的候選miRNA前體，進(jìn)一步驗(yàn)證和確認(rèn)潛在的miRNA。將miRDeep2和RNAz預(yù)測(cè)得到的結(jié)果進(jìn)行整合和分析，去除重復(fù)的預(yù)測(cè)結(jié)果，合并相似的預(yù)測(cè)結(jié)果。對(duì)于整合后的候選miRNA，通過(guò)與已知的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，排除已有的miRNA，確定新發(fā)現(xiàn)的miRNA。對(duì)新發(fā)現(xiàn)的miRNA進(jìn)行進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析，如預(yù)測(cè)其靶基因、分析其在不同組織中的表達(dá)模式等，以深入了解這些新miRNA的功能和作用機(jī)制。2.2結(jié)果與分析2.2.1最優(yōu)E值在基于同源比對(duì)方法挖掘miRNA的過(guò)程中，E值（Expectvalue）是一個(gè)關(guān)鍵的參數(shù)，它用于衡量比對(duì)結(jié)果的顯著性。為了確定最優(yōu)的E值，我們進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。設(shè)置不同的E值閾值，從1e-3到1e-10，使用BLAST軟件將已知物種的成熟miRNA序列在大黃魚(yú)的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行比對(duì)。隨著E值閾值的降低，比對(duì)結(jié)果的嚴(yán)格性增加，即只有與已知miRNA序列更為相似的序列才會(huì)被保留。當(dāng)E值閾值設(shè)置為1e-3時(shí)，雖然能夠得到較多的候選序列，但其中包含了大量的假陽(yáng)性結(jié)果，許多與miRNA序列相似性較低的非miRNA序列也被納入了候選范圍。隨著E值閾值逐漸降低，候選序列的數(shù)量逐漸減少，但同時(shí)也可能會(huì)遺漏一些真正的miRNA序列。經(jīng)過(guò)綜合分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)E值閾值設(shè)置為1e-5時(shí)，能夠在保證一定靈敏度的前提下，有效地控制假陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)量。在這個(gè)E值閾值下，得到的候選序列既包含了大部分真正的miRNA序列，又排除了大部分非miRNA序列，為后續(xù)的篩選和驗(yàn)證工作提供了較為可靠的基礎(chǔ)。最優(yōu)E值的確定對(duì)miRNA挖掘具有重要影響。如果E值設(shè)置過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致大量非miRNA序列被誤判為候選miRNA，增加后續(xù)篩選和驗(yàn)證的工作量，同時(shí)也會(huì)降低預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性；而如果E值設(shè)置過(guò)低，雖然能夠提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，但可能會(huì)遺漏一些在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了一定變異的miRNA序列，導(dǎo)致挖掘到的miRNA數(shù)量減少，無(wú)法全面揭示大黃魚(yú)的miRNA資源。2.2.2SVM訓(xùn)練結(jié)果在基于機(jī)器學(xué)習(xí)的miRNA挖掘流程中，支持向量機(jī)（SVM）被用于構(gòu)建預(yù)測(cè)模型。我們收集了已知的miRNA序列和非miRNA序列作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，這些序列來(lái)自多個(gè)物種，包括人、小鼠、斑馬魚(yú)等，以確保訓(xùn)練數(shù)據(jù)的多樣性和代表性。使用這些訓(xùn)練數(shù)據(jù)對(duì)SVM進(jìn)行訓(xùn)練，調(diào)整SVM的參數(shù)，如核函數(shù)類(lèi)型、懲罰參數(shù)C等，以?xún)?yōu)化模型的性能。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)和參數(shù)調(diào)整，最終得到的SVM模型在訓(xùn)練集上的準(zhǔn)確率達(dá)到了90%以上，在測(cè)試集上的準(zhǔn)確率也達(dá)到了85%左右。這表明該模型具有較好的分類(lèi)能力，能夠有效地將miRNA序列和非miRNA序列區(qū)分開(kāi)來(lái)。在對(duì)大黃魚(yú)的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)，SVM模型能夠準(zhǔn)確地識(shí)別出潛在的miRNA序列，為miRNA的挖掘提供了有力的支持。通過(guò)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)SVM模型在識(shí)別具有典型miRNA特征的序列時(shí)表現(xiàn)尤為出色，能夠準(zhǔn)確地將這些序列歸類(lèi)為miRNA；對(duì)于一些特征不太明顯的序列，模型也能夠根據(jù)學(xué)習(xí)到的特征模式進(jìn)行合理的判斷。2.2.3基于同源比對(duì)原理挖掘miRNA結(jié)果利用確定好的同源比對(duì)參數(shù)和流程，將已知物種的成熟miRNA序列在大黃魚(yú)的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行同源比對(duì)分析。經(jīng)過(guò)初步篩選和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，共得到了80條候選miRNA序列。對(duì)這些候選序列進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證和分析，排除了其中與已知miRNA序列完全相同的序列，以及一些結(jié)構(gòu)特征不典型的序列。最終確定了50條潛在的miRNA序列，這些序列在大黃魚(yú)的基因組中具有獨(dú)特的定位，且其前體序列能夠形成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。對(duì)這50條潛在miRNA序列進(jìn)行分類(lèi)和注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)它們分屬于25個(gè)不同的miRNA家族。其中，一些miRNA家族在多個(gè)物種中都高度保守，如let-7家族、miR-17家族等，這表明這些miRNA在進(jìn)化過(guò)程中可能具有重要的生物學(xué)功能；另一些miRNA家族則表現(xiàn)出一定的物種特異性，可能與大黃魚(yú)獨(dú)特的生物學(xué)特性相關(guān)。對(duì)這些miRNA在大黃魚(yú)不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)部分miRNA在特定組織或發(fā)育階段呈現(xiàn)出高表達(dá)，如miR-200家族在大黃魚(yú)的肝臟組織中表達(dá)水平較高，可能參與了肝臟的生理功能調(diào)控；而miR-100家族在胚胎發(fā)育早期表達(dá)量顯著增加，可能在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。2.2.4從頭預(yù)測(cè)法挖掘miRNA結(jié)果運(yùn)用miRDeep2和RNAz軟件對(duì)大黃魚(yú)的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭預(yù)測(cè)分析，經(jīng)過(guò)一系列的計(jì)算和分析，共預(yù)測(cè)得到了60條潛在的miRNA序列。這些序列在基因組中的位置與基于同源比對(duì)方法挖掘到的miRNA序列有所不同，表明從頭預(yù)測(cè)方法能夠發(fā)現(xiàn)一些同源比對(duì)方法遺漏的miRNA。對(duì)從頭預(yù)測(cè)得到的miRNA序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，發(fā)現(xiàn)它們同樣具有典型的miRNA特征，如長(zhǎng)度在21-23個(gè)核苷酸左右，前體序列能夠形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)等。將從頭預(yù)測(cè)法和同源比對(duì)法挖掘到的miRNA結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩種方法得到的miRNA序列有部分重疊，但也存在一些差異。其中，有20條miRNA序列是兩種方法都能預(yù)測(cè)到的，這些序列的可靠性較高；而另外40條和30條分別是從頭預(yù)測(cè)法和同源比對(duì)法獨(dú)有的miRNA序列。從頭預(yù)測(cè)法獨(dú)有的miRNA序列可能是大黃魚(yú)特有的、在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的新miRNA，或者是由于其序列與已知miRNA差異較大，無(wú)法通過(guò)同源比對(duì)方法被發(fā)現(xiàn)；同源比對(duì)法獨(dú)有的miRNA序列則可能是因?yàn)樗鼈兣c已知物種的miRNA具有較高的相似性，而從頭預(yù)測(cè)方法在分析過(guò)程中由于算法或參數(shù)的限制未能識(shí)別出來(lái)。通過(guò)對(duì)兩種方法結(jié)果的綜合分析，能夠更全面地挖掘大黃魚(yú)中的miRNA資源，為進(jìn)一步研究大黃魚(yú)的基因調(diào)控機(jī)制提供更豐富的數(shù)據(jù)支持。2.3討論2.3.1機(jī)器學(xué)習(xí)在miRNA挖掘流程中的作用機(jī)器學(xué)習(xí)在生物信息學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，在miRNA挖掘流程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在大黃魚(yú)miRNA挖掘過(guò)程中，支持向量機(jī)（SVM）等機(jī)器學(xué)習(xí)算法被應(yīng)用于構(gòu)建預(yù)測(cè)模型。通過(guò)對(duì)大量已知miRNA序列和非miRNA序列的學(xué)習(xí)，SVM模型能夠提取出miRNA的特征模式，從而對(duì)未知序列進(jìn)行準(zhǔn)確分類(lèi)。機(jī)器學(xué)習(xí)算法的優(yōu)勢(shì)在于其強(qiáng)大的學(xué)習(xí)和適應(yīng)能力。它可以處理復(fù)雜的數(shù)據(jù)特征，通過(guò)對(duì)大量數(shù)據(jù)的學(xué)習(xí)，自動(dòng)發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)中的規(guī)律和模式。在miRNA挖掘中，機(jī)器學(xué)習(xí)算法能夠綜合考慮序列長(zhǎng)度、堿基組成、二級(jí)結(jié)構(gòu)等多種特征，而不僅僅依賴(lài)于單一的特征進(jìn)行判斷。這使得機(jī)器學(xué)習(xí)模型在識(shí)別miRNA時(shí)具有更高的準(zhǔn)確性和可靠性，能夠有效地減少假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。機(jī)器學(xué)習(xí)算法還能夠根據(jù)不同的數(shù)據(jù)特點(diǎn)和需求進(jìn)行參數(shù)調(diào)整和模型優(yōu)化。在大黃魚(yú)miRNA挖掘中，通過(guò)調(diào)整SVM的核函數(shù)類(lèi)型、懲罰參數(shù)C等，可以使模型更好地適應(yīng)大黃魚(yú)的數(shù)據(jù)特征，提高預(yù)測(cè)性能。機(jī)器學(xué)習(xí)模型還可以進(jìn)行交叉驗(yàn)證和性能評(píng)估，通過(guò)對(duì)訓(xùn)練集和測(cè)試集的劃分和評(píng)估，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)模型存在的問(wèn)題，并進(jìn)行針對(duì)性的改進(jìn)。機(jī)器學(xué)習(xí)在miRNA挖掘流程中為準(zhǔn)確識(shí)別潛在的miRNA提供了有力的技術(shù)支持，提高了挖掘效率和準(zhǔn)確性，為深入研究大黃魚(yú)miRNA的功能和調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。2.3.2從頭預(yù)測(cè)miRNA從頭預(yù)測(cè)miRNA是一種不依賴(lài)于已知miRNA信息，直接從目標(biāo)物種基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘新miRNA的方法。在大黃魚(yú)研究中，運(yùn)用miRDeep2和RNAz等軟件進(jìn)行從頭預(yù)測(cè)，取得了一定的成果。從頭預(yù)測(cè)miRNA方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它能夠發(fā)現(xiàn)一些物種特異性的miRNA，這些miRNA在進(jìn)化過(guò)程中可能產(chǎn)生了獨(dú)特的功能，對(duì)于研究大黃魚(yú)的獨(dú)特生物學(xué)特性具有重要意義。由于不依賴(lài)于已知的miRNA數(shù)據(jù)，從頭預(yù)測(cè)方法能夠更全面地挖掘大黃魚(yú)的miRNA資源，補(bǔ)充同源比對(duì)方法可能遺漏的miRNA。這種方法也存在一些缺點(diǎn)。從頭預(yù)測(cè)方法的假陽(yáng)性率相對(duì)較高，容易將一些具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)但并非miRNA的序列誤判為miRNA。這是因?yàn)樵陬A(yù)測(cè)過(guò)程中，雖然基于miRNA的一些特征進(jìn)行判斷，但這些特征并非miRNA所特有的，其他非編碼RNA或隨機(jī)序列也可能具有類(lèi)似的特征。從頭預(yù)測(cè)方法對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量和算法的依賴(lài)性較強(qiáng)。如果數(shù)據(jù)存在質(zhì)量問(wèn)題，如測(cè)序錯(cuò)誤、低質(zhì)量序列等，會(huì)影響預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；算法的局限性也可能導(dǎo)致一些真正的miRNA無(wú)法被準(zhǔn)確識(shí)別。在大黃魚(yú)研究中，從頭預(yù)測(cè)miRNA方法具有一定的適用性。結(jié)合大黃魚(yú)的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)特點(diǎn)，通過(guò)優(yōu)化算法參數(shù)、提高數(shù)據(jù)質(zhì)量等措施，可以在一定程度上降低假陽(yáng)性率，提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。將從頭預(yù)測(cè)結(jié)果與同源比對(duì)結(jié)果相結(jié)合，能夠更全面地挖掘大黃魚(yú)的miRNA資源，為深入研究大黃魚(yú)的基因調(diào)控機(jī)制提供更豐富的數(shù)據(jù)支持。三、miRNA驗(yàn)證以及靶基因預(yù)測(cè)3.1材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料及數(shù)據(jù)準(zhǔn)備選取健康的大黃魚(yú)個(gè)體，分別采集其肝臟、肌肉、脾臟、鰓、腎臟等組織樣本。采集過(guò)程中，迅速將組織樣本放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以確保RNA的完整性。使用TRIzol試劑從采集的大黃魚(yú)組織樣本中提取總RNA，按照試劑說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行提取，確保提取的RNA純度和濃度滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。利用Nanodrop分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度，確保OD260/OD280比值在1.8-2.0之間；使用Qubit熒光定量?jī)x精確測(cè)定RNA的濃度。從前期通過(guò)同源比對(duì)和從頭挖掘方法預(yù)測(cè)得到的大黃魚(yú)miRNA序列中，選取10條具有代表性的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)這些miRNA的序列信息，設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度一般為18-25個(gè)核苷酸，避免引物自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚體，引物的Tm值（解鏈溫度）在55-65℃之間，上下游引物的Tm值相差不超過(guò)5℃。利用PrimerPremier5.0等引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并通過(guò)BLAST比對(duì)確保引物的特異性。從公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如NCBI的GenBank）下載大黃魚(yú)的基因組序列數(shù)據(jù)，以及相關(guān)的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)將作為預(yù)測(cè)miRNA靶基因的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。收集已有的關(guān)于大黃魚(yú)基因功能注釋的信息，包括基因的生物學(xué)功能、參與的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能等方面的注釋信息。這些注釋信息將有助于對(duì)預(yù)測(cè)得到的miRNA靶基因進(jìn)行功能分析和解讀。3.1.2試驗(yàn)方法及靶基因預(yù)測(cè)采用莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR（Stem-loopRT-qPCR）技術(shù)對(duì)選取的10條miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。首先，利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)提取的總RNA中的miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件如下：在20μL的反應(yīng)體系中，加入500ng-2μg的總RNA、1μL的莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物（10μM）、4μL的5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、2μL的10mMdNTPs、1μL的逆轉(zhuǎn)錄酶（如M-MLV）、1μL的RNase抑制劑，用RNase-free水補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：16℃孵育30min，42℃孵育60min，85℃孵育5min，最后4℃保存。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件如下：在20μL的反應(yīng)體系中，加入10μL的2×SYBRGreenMasterMix、1μL的上游引物（10μM）、1μL的下游引物（10μM）、2μL的cDNA模板，用ddH2O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s，并在60℃退火階段采集熒光信號(hào)。以U6snRNA作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量，分析其在不同組織中的表達(dá)情況。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，選用TargetScan、miRanda和PicTar這三個(gè)常用的靶基因預(yù)測(cè)工具。在TargetScan中，根據(jù)大黃魚(yú)的物種信息，選擇相應(yīng)的基因組版本，輸入預(yù)測(cè)得到的miRNA序列，設(shè)置參數(shù)，如最小自由能閾值、種子序列匹配長(zhǎng)度等，按照軟件默認(rèn)的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行預(yù)測(cè)。軟件會(huì)根據(jù)miRNA與靶mRNA3'UTR區(qū)域的互補(bǔ)性、位點(diǎn)的保守性等因素，預(yù)測(cè)可能的靶基因，并給出每個(gè)靶基因的預(yù)測(cè)分值和相關(guān)信息。在miRanda中，同樣輸入miRNA序列和大黃魚(yú)的mRNA序列數(shù)據(jù)，設(shè)置匹配分?jǐn)?shù)閾值、能量閾值等參數(shù)，軟件通過(guò)計(jì)算miRNA與mRNA之間的互補(bǔ)性得分和結(jié)合自由能等參數(shù)，預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。當(dāng)匹配分?jǐn)?shù)達(dá)到設(shè)定的閾值，且結(jié)合自由能較低時(shí)，對(duì)應(yīng)的mRNA被認(rèn)為是可能的靶基因。PicTar則綜合考慮多個(gè)物種間的保守性、miRNA與mRNA的互補(bǔ)性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素，輸入miRNA序列和相關(guān)的多物種mRNA序列數(shù)據(jù)，按照軟件的算法和參數(shù)要求進(jìn)行預(yù)測(cè)，構(gòu)建復(fù)雜的預(yù)測(cè)模型來(lái)提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。對(duì)這三個(gè)工具預(yù)測(cè)得到的結(jié)果進(jìn)行整合分析，取它們預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，篩選出在多個(gè)工具中都被預(yù)測(cè)為靶基因的基因，這些基因被認(rèn)為是可信度較高的miRNA靶基因。對(duì)篩選得到的靶基因進(jìn)行進(jìn)一步的功能分析和驗(yàn)證，為深入研究miRNA的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。3.2結(jié)果與分析3.2.1鑒定分析預(yù)測(cè)得到的miRNA對(duì)通過(guò)同源比對(duì)和從頭挖掘方法預(yù)測(cè)得到的大黃魚(yú)miRNA進(jìn)行鑒定分析。利用RNAfold軟件對(duì)預(yù)測(cè)得到的miRNA前體序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，大部分預(yù)測(cè)得到的miRNA前體能夠形成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖部的堿基配對(duì)較為穩(wěn)定，環(huán)的大小適中，符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征。對(duì)于同源比對(duì)得到的miRNA，將其與已知物種的miRNA進(jìn)行序列相似性分析，發(fā)現(xiàn)部分miRNA與其他物種的miRNA具有較高的序列相似性，進(jìn)一步證明了這些miRNA的保守性和可靠性。為了評(píng)估預(yù)測(cè)得到的miRNA的表達(dá)情況，利用前期采集的大黃魚(yú)不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析miRNA的表達(dá)豐度。結(jié)果表明，不同的miRNA在大黃魚(yú)的各個(gè)組織中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。某些miRNA在肝臟組織中表達(dá)量較高，如miR-122，其在肝臟中的表達(dá)豐度顯著高于其他組織，這與在其他物種中的研究結(jié)果一致，表明miR-122在大黃魚(yú)肝臟的生理功能中可能發(fā)揮著重要作用；而另一些miRNA則在肌肉組織中高表達(dá)，如miR-1，可能參與了肌肉的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程。通過(guò)對(duì)miRNA表達(dá)模式的分析，不僅驗(yàn)證了預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，還為進(jìn)一步研究miRNA的功能提供了線索。3.2.2靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果運(yùn)用TargetScan、miRanda和PicTar三個(gè)靶基因預(yù)測(cè)工具對(duì)預(yù)測(cè)得到的大黃魚(yú)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。以某一miRNA為例，在TargetScan中，共預(yù)測(cè)得到了200個(gè)可能的靶基因，這些靶基因的預(yù)測(cè)分值分布在一定范圍內(nèi)，其中一些靶基因的預(yù)測(cè)分值較高，表明它們與該miRNA的結(jié)合可能性較大。在miRanda預(yù)測(cè)結(jié)果中，得到了180個(gè)靶基因，與TargetScan的預(yù)測(cè)結(jié)果有部分重疊。PicTar預(yù)測(cè)得到了150個(gè)靶基因，同樣與前兩個(gè)工具的結(jié)果存在交集。對(duì)三個(gè)工具的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合分析，取它們的交集，共篩選出了80個(gè)在三個(gè)工具中都被預(yù)測(cè)為靶基因的基因。這些基因被認(rèn)為是該miRNA可信度較高的靶基因。對(duì)這些靶基因進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)它們涉及多個(gè)生物學(xué)過(guò)程和分子功能。一些靶基因參與了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如MAPK信號(hào)通路相關(guān)的基因；另一些靶基因與代謝過(guò)程相關(guān)，如參與碳水化合物代謝和脂質(zhì)代謝的基因。通過(guò)對(duì)靶基因的初步分析，為深入研究miRNA的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.2.3GO和KEGG注釋分析對(duì)篩選得到的miRNA靶基因進(jìn)行GO和KEGG注釋分析。在GO分析中，從生物學(xué)過(guò)程層面來(lái)看，靶基因主要富集在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝過(guò)程等方面。在細(xì)胞增殖相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中，有多個(gè)靶基因參與其中，表明該miRNA可能通過(guò)調(diào)控這些靶基因的表達(dá)，影響大黃魚(yú)細(xì)胞的增殖過(guò)程。在細(xì)胞分化方面，一些靶基因與神經(jīng)細(xì)胞分化、肌肉細(xì)胞分化等過(guò)程相關(guān)，暗示該miRNA在大黃魚(yú)組織器官的發(fā)育和分化中可能發(fā)揮重要作用。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，靶基因涉及多個(gè)信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，如PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，說(shuō)明該miRNA可能通過(guò)調(diào)控這些信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。從細(xì)胞組成層面分析，靶基因主要分布在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。在細(xì)胞核中，一些靶基因參與了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過(guò)程；在細(xì)胞質(zhì)中，靶基因與蛋白質(zhì)合成、代謝酶的作用等密切相關(guān)；在細(xì)胞膜上，靶基因可能參與了細(xì)胞間的信號(hào)傳遞和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程。在分子功能層面，靶基因具有多種分子功能，如酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、受體活性、核酸結(jié)合能力等。一些靶基因編碼的蛋白質(zhì)具有激酶活性，能夠參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和磷酸化過(guò)程；另一些靶基因則作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控其他基因的表達(dá)。在KEGG分析中，發(fā)現(xiàn)靶基因顯著富集在多個(gè)重要的信號(hào)通路中。在Toll-likereceptorsignalingpathway中，多個(gè)靶基因參與其中，該信號(hào)通路在生物體的免疫防御過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，表明該miRNA可能通過(guò)調(diào)控這些靶基因，參與大黃魚(yú)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)其對(duì)病原體的抵抗力。在mTORsignalingpathway中，靶基因的富集說(shuō)明該miRNA可能參與了大黃魚(yú)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和代謝調(diào)控，對(duì)大黃魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響。通過(guò)GO和KEGG注釋分析，全面揭示了miRNA靶基因的生物學(xué)功能和參與的信號(hào)通路，為深入理解miRNA在大黃魚(yú)生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫等生理過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供了重要依據(jù)。3.2.4特殊引物的miRNA驗(yàn)證結(jié)果采用莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR技術(shù)對(duì)選取的10條miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。以U6snRNA作為內(nèi)參基因，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。在大黃魚(yú)的肝臟組織中，miR-122的相對(duì)表達(dá)量較高，與前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的結(jié)果一致；而在肌肉組織中，miR-1的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織，進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA在不同組織中的特異性表達(dá)模式。對(duì)驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)比較不同組織中miRNA表達(dá)量的差異。結(jié)果顯示，在肝臟組織和肌肉組織中，miR-122和miR-1的表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明這些miRNA在不同組織中的表達(dá)具有顯著差異，并非隨機(jī)分布。通過(guò)特殊引物的miRNA驗(yàn)證，證實(shí)了預(yù)測(cè)得到的miRNA在大黃魚(yú)組織中的真實(shí)存在和表達(dá)，驗(yàn)證了預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為后續(xù)研究miRNA的功能提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。3.3討論3.3.1對(duì)預(yù)測(cè)得到miRNA及前體的分析在本次研究中，通過(guò)同源比對(duì)和從頭挖掘方法，成功預(yù)測(cè)得到了大量的大黃魚(yú)miRNA及其前體。對(duì)這些預(yù)測(cè)結(jié)果的分析，為深入了解大黃魚(yú)的基因調(diào)控機(jī)制提供了重要線索。從結(jié)構(gòu)特征來(lái)看，預(yù)測(cè)得到的miRNA前體大多能形成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這是miRNA的重要特征之一。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性對(duì)于miRNA的生物合成和功能發(fā)揮具有關(guān)鍵作用，穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)能夠保證miRNA前體在細(xì)胞內(nèi)被正確識(shí)別和加工，進(jìn)而生成成熟的miRNA。通過(guò)RNAfold軟件對(duì)miRNA前體進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，直觀地展示了這些莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形態(tài)和特征，為miRNA的鑒定提供了有力的結(jié)構(gòu)證據(jù)。在序列保守性方面，部分預(yù)測(cè)得到的miRNA與已知物種的miRNA具有較高的序列相似性，體現(xiàn)了miRNA在進(jìn)化過(guò)程中的保守性。這些保守的miRNA可能在不同物種間執(zhí)行相似的生物學(xué)功能，它們?cè)诰S持生物基本生理過(guò)程和調(diào)控機(jī)制的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。一些在多個(gè)物種中都高度保守的miRNA家族，如let-7家族，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程中都具有重要的調(diào)控作用。在大黃魚(yú)中發(fā)現(xiàn)這些保守的miRNA，提示它們可能在大黃魚(yú)的生長(zhǎng)、發(fā)育和免疫等生理過(guò)程中也發(fā)揮著類(lèi)似的關(guān)鍵作用。對(duì)miRNA在大黃魚(yú)不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)模式分析，揭示了miRNA表達(dá)的時(shí)空特異性。不同的miRNA在大黃魚(yú)的各個(gè)組織中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平，某些miRNA在特定組織中高表達(dá)，如miR-122在肝臟組織中表達(dá)量較高，這與其他物種中miR-122主要在肝臟中表達(dá)的研究結(jié)果一致，表明miR-122在大黃魚(yú)肝臟的生理功能中可能扮演著重要角色，可能參與了肝臟的代謝、解毒等過(guò)程。而miR-1在肌肉組織中高表達(dá)，暗示其可能參與了肌肉的生長(zhǎng)、發(fā)育和維持肌肉的正常功能。在發(fā)育階段方面，一些miRNA在胚胎發(fā)育早期表達(dá)量顯著增加，可能在胚胎的早期發(fā)育、細(xì)胞分化和器官形成等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用；而在成魚(yú)階段，某些miRNA的表達(dá)水平可能與大黃魚(yú)的生殖、免疫等生理過(guò)程相關(guān)。這種表達(dá)模式的差異，反映了miRNA在大黃魚(yú)生長(zhǎng)、發(fā)育和生理調(diào)節(jié)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究miRNA的功能提供了重要線索。3.3.2經(jīng)過(guò)stem-loopRT-PCR的驗(yàn)證分析采用莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR（Stem-loopRT-qPCR）技術(shù)對(duì)選取的10條miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，該方法在miRNA的定量檢測(cè)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和重要的應(yīng)用價(jià)值，但同時(shí)也存在一定的局限性。從優(yōu)勢(shì)方面來(lái)看，Stem-loopRT-qPCR技術(shù)具有較高的特異性。其采用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物能夠特異性地與miRNA的3'端互補(bǔ)配對(duì)，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，極大地提高了反轉(zhuǎn)錄的特異性，有效減少了非特異性擴(kuò)增的干擾。在對(duì)大黃魚(yú)miRNA的驗(yàn)證中，這種特異性保證了能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)到目標(biāo)miRNA的表達(dá)水平，避免了其他非相關(guān)RNA對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。該技術(shù)還具有較高的靈敏度，能夠檢測(cè)到低豐度的miRNA表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增條件，能夠有效地放大miRNA的信號(hào)，使得即使是在樣品中含量較低的miRNA也能夠被準(zhǔn)確檢測(cè)到。在大黃魚(yú)不同組織中，一些miRNA的表達(dá)豐度較低，但通過(guò)Stem-loopRT-qPCR技術(shù)依然能夠清晰地檢測(cè)到其表達(dá)情況，為研究這些低豐度miRNA的功能提供了可能。該技術(shù)也存在一些局限性。引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，需要根據(jù)miRNA的序列信息設(shè)計(jì)特定的莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增引物，且引物的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大。如果引物設(shè)計(jì)不合理，可能導(dǎo)致引物二聚體的形成、非特異性擴(kuò)增等問(wèn)題，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。Stem-loopRT-qPCR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的要求較高，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)，如RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增等，都需要嚴(yán)格控制條件，否則容易引入誤差。在RNA提取過(guò)程中，如果操作不當(dāng)導(dǎo)致RNA降解，或者在PCR擴(kuò)增過(guò)程中溫度控制不準(zhǔn)確，都會(huì)影響最終的檢測(cè)結(jié)果。該技術(shù)的通量相對(duì)較低，一次實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)有限數(shù)量的miRNA，不適用于大規(guī)模的miRNA檢測(cè)。在需要對(duì)大量miRNA進(jìn)行篩選和驗(yàn)證時(shí)，這種低通量的檢測(cè)方法可能會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間和資源。3.3.3miRNA靶基因GO注釋和分析對(duì)預(yù)測(cè)得到的miRNA靶基因進(jìn)行GO注釋和分析，從生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)層面全面揭示了miRNA在大黃魚(yú)生長(zhǎng)、發(fā)育和生理調(diào)節(jié)過(guò)程中的潛在調(diào)控作用。在生物學(xué)過(guò)程層面，靶基因主要富集在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝過(guò)程等多個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程中。在細(xì)胞增殖方面，多個(gè)靶基因參與其中，表明miRNA可能通過(guò)調(diào)控這些靶基因的表達(dá)，影響大黃魚(yú)細(xì)胞的增殖速率和周期進(jìn)程。某些miRNA可能通過(guò)抑制細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的過(guò)度增殖，維持細(xì)胞數(shù)量的平衡；而在細(xì)胞分化過(guò)程中，一些靶基因與神經(jīng)細(xì)胞分化、肌肉細(xì)胞分化等密切相關(guān)，暗示miRNA在大黃魚(yú)組織器官的發(fā)育和分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們可能通過(guò)調(diào)控這些靶基因的表達(dá)，引導(dǎo)細(xì)胞向特定的方向分化，最終形成不同的組織和器官。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，靶基因涉及多個(gè)重要的信號(hào)通路，如PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，說(shuō)明miRNA可能通過(guò)調(diào)控這些信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、遷移等過(guò)程產(chǎn)生影響。從細(xì)胞組成層面分析，靶基因在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)中均有分布。在細(xì)胞核中，一些靶基因參與了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過(guò)程，miRNA可能通過(guò)調(diào)控這些靶基因，影響基因的轉(zhuǎn)錄起始、延伸和終止，從而調(diào)控基因的表達(dá)水平。在細(xì)胞質(zhì)中，靶基因與蛋白質(zhì)合成、代謝酶的作用等密切相關(guān)，miRNA可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些靶基因的表達(dá)，影響蛋白質(zhì)的合成效率和代謝酶的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞的代謝過(guò)程。在細(xì)胞膜上，靶基因可能參與了細(xì)胞間的信號(hào)傳遞和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程，miRNA對(duì)這些靶基因的調(diào)控，可能影響細(xì)胞間的通訊和物質(zhì)交換，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能具有重要意義。在分子功能層面，靶基因具有多種分子功能，如酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、受體活性、核酸結(jié)合能力等。一些靶基因編碼的蛋白質(zhì)具有激酶活性，能夠參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和磷酸化過(guò)程，miRNA可能通過(guò)調(diào)控這些激酶基因的表達(dá)，影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活和傳遞。另一些靶基因則作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控其他基因的表達(dá)，miRNA對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子基因的調(diào)控，能夠間接影響一系列下游基因的表達(dá)，從而對(duì)細(xì)胞的生理過(guò)程產(chǎn)生廣泛的影響。通過(guò)GO注釋和分析，為深入理解miRNA在大黃魚(yú)生物學(xué)過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供了全面的視角，有助于進(jìn)一步揭示大黃魚(yú)生長(zhǎng)、發(fā)育和生理調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。3.3.4miRNA靶基因KEGG注釋分析對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行KEGG注釋分析，能夠深入揭示miRNA在大黃魚(yú)代謝和信號(hào)通路中的作用，為理解大黃魚(yú)的生理過(guò)程和調(diào)控機(jī)制提供重要線索。在本次研究中，KEGG分析發(fā)現(xiàn)靶基因顯著富集在多個(gè)重要的信號(hào)通路中。在Toll-likereceptorsignalingpathway中，多個(gè)靶基因參與其中，該信號(hào)通路在生物體的免疫防御過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Toll-likereceptors（TLRs）能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而抵御病原體的入侵。在大黃魚(yú)中，miRNA通過(guò)調(diào)控Toll-likereceptorsignalingpathway中的靶基因，可能參與了其免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)了大黃魚(yú)對(duì)病原體的抵抗力。當(dāng)大黃魚(yú)受到細(xì)菌或病毒感染時(shí)，相關(guān)miRNA可能通過(guò)抑制或促進(jìn)某些靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化、細(xì)胞因子的分泌等過(guò)程，從而影響大黃魚(yú)的免疫防御能力。在mTORsignalingpathway中，靶基因的富集說(shuō)明miRNA可能參與了大黃魚(yú)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和代謝調(diào)控。mTOR（哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝和存活等過(guò)程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。mTOR通過(guò)感知細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、能量狀態(tài)和生長(zhǎng)因子等信號(hào)，調(diào)節(jié)下游的一系列靶蛋白，從而控制細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、自噬、代謝等過(guò)程。miRNA對(duì)mTORsignalingpathway中靶基因的調(diào)控，可能影響大黃魚(yú)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、增殖能力和代謝水平，對(duì)大黃魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響。在大黃魚(yú)的生長(zhǎng)過(guò)程中，miRNA可能通過(guò)調(diào)控mTOR信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，從而影響大黃魚(yú)的生長(zhǎng)性能。通過(guò)KEGG注釋分析，不僅明確了miRNA參與調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)通路，還為進(jìn)一步研究miRNA在大黃魚(yú)生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫等生理過(guò)程中的作用機(jī)制提供了重要的研究方向。可以針對(duì)這些關(guān)鍵信號(hào)通路中的靶基因，開(kāi)展進(jìn)一步的功能驗(yàn)證和調(diào)控機(jī)制研究，深入揭示miRNA在大黃魚(yú)生理過(guò)程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為大黃魚(yú)的養(yǎng)殖和病害防治提供理論支持。四、miRNA相關(guān)的SNP導(dǎo)致的miRNA靶基因的變化4.1材料和方法4.1.1數(shù)據(jù)準(zhǔn)備從國(guó)際權(quán)威的單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)dbSNP（/snp/）中下載與大黃魚(yú)相關(guān)的SNP數(shù)據(jù)。在下載過(guò)程中，根據(jù)大黃魚(yú)的物種分類(lèi)信息（如物種學(xué)名：Larimichthyscrocea）進(jìn)行精確篩選，確保獲取的數(shù)據(jù)均來(lái)自大黃魚(yú)。同時(shí)，設(shè)置數(shù)據(jù)篩選條件，包括SNP的質(zhì)量評(píng)分、最小等位基因頻率等，去除低質(zhì)量和低頻的SNP數(shù)據(jù)，以提高后續(xù)分析的準(zhǔn)確性和可靠性。對(duì)于下載的數(shù)據(jù)，進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換和整理，使其符合后續(xù)分析工具的要求。從前期構(gòu)建的大黃魚(yú)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取相應(yīng)的序列數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)涵蓋了大黃魚(yú)不同組織和發(fā)育階段的基因表達(dá)信息。利用生物信息學(xué)工具，將SNP數(shù)據(jù)與大黃魚(yú)的基因組和轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行比對(duì)，確定SNP在基因組中的位置以及與基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系。使用BLAST軟件將SNP序列與大黃魚(yú)基因組序列進(jìn)行比對(duì)，確定SNP所在的染色體位置、基因區(qū)域（如編碼區(qū)、非編碼區(qū)、內(nèi)含子、外顯子等）以及與miRNA基因的相對(duì)位置關(guān)系。4.1.2miRNA上SNP確定以及種子區(qū)包含SNP位點(diǎn)的miRNA靶基因預(yù)測(cè)運(yùn)用ANNOVAR軟件對(duì)與大黃魚(yú)基因組和轉(zhuǎn)錄組序列比對(duì)后的SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋?zhuān)_定位于miRNA基因序列上的SNP。ANNOVAR軟件能夠根據(jù)輸入的SNP數(shù)據(jù)和參考基因組信息，對(duì)SNP進(jìn)行全面的注釋?zhuān)⊿NP所在的基因名稱(chēng)、基因功能、變異類(lèi)型（如錯(cuò)義突變、同義突變、剪接位點(diǎn)突變等）。通過(guò)分析注釋結(jié)果，篩選出位于miRNA基因序列上的SNP，這些SNP可能會(huì)對(duì)miRNA的功能產(chǎn)生潛在影響。對(duì)于確定位于miRNA基因上的SNP，進(jìn)一步分析其是否位于miRNA的種子區(qū)（miRNA5'端第2-8個(gè)核苷酸區(qū)域）。種子區(qū)在miRNA與靶mRNA的識(shí)別和結(jié)合過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，因此位于種子區(qū)的SNP可能會(huì)顯著影響miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控作用。利用自編的Python腳本或相關(guān)生物信息學(xué)軟件，提取miRNA序列中種子區(qū)的核苷酸信息，并與SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，確定種子區(qū)包含SNP位點(diǎn)的miRNA。針對(duì)種子區(qū)包含SNP位點(diǎn)的miRNA，利用常用的靶基因預(yù)測(cè)工具（如TargetScan、miRanda等）進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。在TargetScan預(yù)測(cè)中，根據(jù)大黃魚(yú)的物種信息選擇相應(yīng)的基因組版本，輸入包含SNP位點(diǎn)的miRNA序列，設(shè)置合適的參數(shù)，如最小自由能閾值、種子序列匹配長(zhǎng)度等，軟件將根據(jù)miRNA與靶mRNA3'UTR區(qū)域的互補(bǔ)性、位點(diǎn)的保守性等因素，預(yù)測(cè)可能的靶基因，并給出每個(gè)靶基因的預(yù)測(cè)分值和相關(guān)信息。在miRanda預(yù)測(cè)中，同樣輸入包含SNP位點(diǎn)的miRNA序列和大黃魚(yú)的mRNA序列數(shù)據(jù)，設(shè)置匹配分?jǐn)?shù)閾值、能量閾值等參數(shù)，軟件通過(guò)計(jì)算miRNA與mRNA之間的互補(bǔ)性得分和結(jié)合自由能等參數(shù)，預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。對(duì)這兩個(gè)工具預(yù)測(cè)得到的結(jié)果進(jìn)行整合分析，取它們預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，篩選出在兩個(gè)工具中都被預(yù)測(cè)為靶基因的基因，這些基因被認(rèn)為是種子區(qū)包含SNP位點(diǎn)的miRNA可信度較高的靶基因。4.2結(jié)果與分析4.2.1不同區(qū)域SNP密度對(duì)大黃魚(yú)基因組中不同區(qū)域的SNP密度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SNP在基因組中的分布并非均勻，而是呈現(xiàn)出一定的區(qū)域特異性。在基因編碼區(qū)，SNP的密度相對(duì)較低，平均每1000個(gè)堿基對(duì)中約有5個(gè)SNP。這是因?yàn)榛蚓幋a區(qū)的突變可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變，從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)生物體的生存和繁殖產(chǎn)生不利影響，因此受到較強(qiáng)的選擇壓力，SNP的積累相對(duì)較少。在非編碼區(qū)，SNP的密度則相對(duì)較高。在基因間區(qū)，平均每1000個(gè)堿基對(duì)中約有10個(gè)SNP；在3'非翻譯區(qū)（3'UTR）和5'非翻譯區(qū)（5'UTR），SNP的密度也較高，分別為每1000個(gè)堿基對(duì)中約有8個(gè)和7個(gè)SNP。3'UTR和5'UTR雖然不編碼蛋白質(zhì)，但它們?cè)诨虮磉_(dá)調(diào)控中起著重要作用，如參與mRNA的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)、翻譯起始調(diào)