基于噬菌體展示技術(shù)的草魚呼腸孤病毒單鏈抗體淘選與特性研究一、引言1.1研究背景與意義草魚（Ctenopharyngodonidella）作為中國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，2015年其產(chǎn)量高達(dá)580萬(wàn)噸，在世界淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量中占比超過(guò)13％。然而，草魚呼腸孤病毒（GrassCarpReovirus，GCRV）引發(fā)的出血性疾病，成為草魚養(yǎng)殖業(yè)的重大威脅。這種病毒是引起我國(guó)大面積草魚幼魚出血病暴發(fā)的主要病原體，死亡率可高達(dá)80%。除草魚外，GCRV還能感染青魚、麥穗魚、布氏條、稀有鮈鯽、鰱等多種魚類，給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失。例如在江蘇、安徽、福建等多個(gè)省份的草魚養(yǎng)殖區(qū)域，都曾因GCRV的爆發(fā)，導(dǎo)致大量草魚死亡，養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)受損嚴(yán)重。目前，對(duì)于草魚出血病的防治仍以預(yù)防為主，對(duì)該病毒與宿主細(xì)胞作用的分子機(jī)理研究尚不完善，亟待深入探索，以尋求草魚出血病防治的新突破。噬菌體展示技術(shù)作為一種強(qiáng)大的生物技術(shù)工具，近年來(lái)在抗體篩選領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展。它將各種多肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式表達(dá)并展示在噬菌體表面，同時(shí)將其遺傳密碼包含于噬菌體內(nèi)部，使得蛋白質(zhì)的功能與其基因密碼有機(jī)連接在一起。該技術(shù)具有淘選高效率的優(yōu)勢(shì)，能夠在極低的存在水平下，挑選到高親和力噬菌體；并且所挑選到的噬菌體可通過(guò)感染細(xì)菌得到富集，便于后續(xù)研究；展示的多肽或蛋白質(zhì)與其基因密碼的連接，也使得結(jié)合肽或蛋白質(zhì)的序列分析既快速又簡(jiǎn)便。利用噬菌體展示技術(shù)淘選草魚呼腸孤病毒的單鏈抗體，具有多方面的重要意義。從病毒研究角度來(lái)看，獲得的單鏈抗體可作為特異性探針，用于深入研究GCRV的結(jié)構(gòu)與功能，有助于揭示病毒的感染機(jī)制、復(fù)制過(guò)程以及與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)理。在病害防治方面，單鏈抗體為開發(fā)新型診斷方法和治療策略提供了可能。在診斷領(lǐng)域，可基于單鏈抗體建立高靈敏度、高特異性的免疫學(xué)檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)GCRV的早期快速檢測(cè)，為病害防控爭(zhēng)取寶貴時(shí)間；在治療領(lǐng)域，單鏈抗體有可能發(fā)展成為生物治療藥物，通過(guò)特異性結(jié)合病毒，阻斷病毒的感染過(guò)程，為草魚出血病的治療提供新的手段。此外，噬菌體展示技術(shù)淘選單鏈抗體的研究，也將豐富水產(chǎn)病毒學(xué)和免疫學(xué)的理論知識(shí)，為其他水產(chǎn)動(dòng)物病毒病害的研究和防治提供借鑒和參考。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀噬菌體展示技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，在病毒單鏈抗體淘選領(lǐng)域取得了豐碩成果。在動(dòng)物病毒研究方面，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種病毒單鏈抗體的篩選。例如，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，針對(duì)狂犬病毒，科研人員利用噬菌體展示技術(shù)成功獲得了抗狂犬病毒的單鏈抗體，這為狂犬病的診斷和治療提供了新的有力工具；對(duì)于HIV-1，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選出的抗HIV-1囊膜糖蛋白的單鏈抗體，能夠?qū)Ｒ恍缘貧⑺辣籋IV-1感染并表達(dá)有g(shù)p120的淋巴細(xì)胞，為艾滋病的治療研究開辟了新方向。在植物病毒研究中，噬菌體展示技術(shù)同樣發(fā)揮了重要作用。有研究運(yùn)用該技術(shù)篩選出了針對(duì)植物RNA病毒的單鏈抗體，為植物病毒病的防控提供了新思路。這些成功案例充分展示了噬菌體展示技術(shù)在病毒單鏈抗體淘選方面的可行性和有效性，為草魚呼腸孤病毒單鏈抗體的淘選提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和借鑒。在草魚呼腸孤病毒研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)學(xué)者已開展了相關(guān)探索。中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所的研究人員以原核表達(dá)的VP7、全長(zhǎng)VP5、VP5的N端片段及C端片段為靶蛋白，利用已構(gòu)建的噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)進(jìn)行淘選。經(jīng)過(guò)3輪淘選后，成功獲得了7個(gè)針對(duì)VP7、VP5、VP5N和VP5C的單鏈抗體。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，識(shí)別原核表達(dá)的VP7的兩個(gè)單鏈抗體能夠成功識(shí)別天然GCRV病毒。這一研究成果為深入研究GCRV與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，也為后續(xù)基于單鏈抗體的草魚出血病診斷和治療方法的開發(fā)提供了重要的前期工作。然而，目前該領(lǐng)域的研究仍存在一定局限性。一方面，已獲得的單鏈抗體在親和力、特異性等性能方面還有提升空間，需要進(jìn)一步優(yōu)化篩選方法和條件，以獲得性能更優(yōu)良的單鏈抗體；另一方面，對(duì)于單鏈抗體在草魚體內(nèi)的應(yīng)用效果和安全性研究還不夠深入，距離實(shí)際應(yīng)用于草魚出血病的防治仍有較長(zhǎng)的路要走。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在利用噬菌體展示技術(shù)，成功淘選針對(duì)草魚呼腸孤病毒的單鏈抗體，并對(duì)其特性進(jìn)行深入分析，為草魚出血病的診斷和治療提供關(guān)鍵技術(shù)支持和物質(zhì)基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下：構(gòu)建噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)：從免疫后的動(dòng)物脾臟中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因片段，使用合適的Linker將VH和VL連接，構(gòu)建成單鏈抗體基因（scFv）。將scFv基因克隆到噬菌體展示載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)。對(duì)文庫(kù)的庫(kù)容、多樣性等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估，確保文庫(kù)質(zhì)量滿足后續(xù)淘選需求。淘選草魚呼腸孤病毒單鏈抗體：以純化的草魚呼腸孤病毒或其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白為靶標(biāo)，對(duì)構(gòu)建好的噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)進(jìn)行多輪淘選。每輪淘選后，通過(guò)感染大腸桿菌對(duì)結(jié)合的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，提高特異性噬菌體的比例。經(jīng)過(guò)多輪淘選后，從富集的噬菌體克隆中篩選出與草魚呼腸孤病毒特異性結(jié)合的單鏈抗體。單鏈抗體的鑒定與特性分析：對(duì)篩選獲得的單鏈抗體進(jìn)行一系列鑒定和特性分析。通過(guò)ELISA、Westernblot等方法檢測(cè)單鏈抗體與草魚呼腸孤病毒的結(jié)合活性和特異性；測(cè)定單鏈抗體的親和力，評(píng)估其與病毒的結(jié)合強(qiáng)度；分析單鏈抗體的氨基酸序列，研究其結(jié)構(gòu)特征；進(jìn)行單鏈抗體的可溶性表達(dá)和純化，為后續(xù)應(yīng)用研究提供足夠的抗體樣品；通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，初步探究單鏈抗體在阻斷病毒感染、中和病毒活性等方面的生物學(xué)功能。二、噬菌體展示技術(shù)與草魚呼腸孤病毒概述2.1噬菌體展示技術(shù)原理與分類2.1.1技術(shù)原理噬菌體展示技術(shù)是一種將外源蛋白或多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面的生物技術(shù)。其核心原理基于基因與蛋白的緊密關(guān)聯(lián)。在該技術(shù)中，外源蛋白或多肽的DNA序列被巧妙地插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的特定位置。當(dāng)噬菌體進(jìn)行復(fù)制和組裝時(shí)，外源基因會(huì)隨著外殼蛋白的表達(dá)而一同表達(dá)，進(jìn)而使外源蛋白或多肽融合在噬菌體的表面，實(shí)現(xiàn)展示。例如，將編碼抗體片段的基因插入噬菌體外殼蛋白基因中，隨著噬菌體的繁殖，抗體片段就會(huì)展示在噬菌體表面。這種展示方式使得蛋白質(zhì)的功能與其編碼基因緊密相連，為后續(xù)的篩選和分析提供了極大的便利。在實(shí)際操作中，首先構(gòu)建一個(gè)包含大量不同外源基因的噬菌體文庫(kù)，這個(gè)文庫(kù)就像是一個(gè)巨大的“分子庫(kù)”，里面存儲(chǔ)著各種各樣的蛋白質(zhì)信息。然后，將這個(gè)文庫(kù)與特定的靶標(biāo)分子進(jìn)行孵育，靶標(biāo)分子可以是病毒、細(xì)菌、蛋白質(zhì)等。在孵育過(guò)程中，噬菌體表面展示的蛋白質(zhì)會(huì)與靶標(biāo)分子進(jìn)行相互作用。那些能夠與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的噬菌體就會(huì)被保留下來(lái)，而不能結(jié)合的噬菌體則會(huì)被洗去。接著，通過(guò)感染宿主細(xì)胞，被保留下來(lái)的噬菌體可以進(jìn)行擴(kuò)增，從而得到大量與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的噬菌體。經(jīng)過(guò)多輪這樣的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”過(guò)程，與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的噬菌體就會(huì)得到高度富集，最終可以從這些富集體中篩選出具有特定功能的蛋白質(zhì)或多肽。例如，在篩選抗草魚呼腸孤病毒的單鏈抗體時(shí)，將噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)與草魚呼腸孤病毒進(jìn)行孵育，那些表面展示的單鏈抗體能夠與病毒特異性結(jié)合的噬菌體就會(huì)被篩選出來(lái)，經(jīng)過(guò)多輪淘選后，就可以獲得高親和力的抗草魚呼腸孤病毒單鏈抗體。2.1.2分類及特點(diǎn)單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)：?jiǎn)捂溄z狀噬菌體如M13噬菌體，其基因組為單鏈DNA。該系統(tǒng)主要利用PⅢ和PⅧ兩種外殼蛋白來(lái)構(gòu)建展示系統(tǒng)。PⅢ是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，每個(gè)病毒顆粒有3-5個(gè)拷貝。PⅢ在結(jié)構(gòu)上可分為N1、N2和CT三個(gè)功能區(qū)域，這三個(gè)區(qū)域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中，N1和N2與噬菌體吸附大腸桿菌菌毛及穿透細(xì)胞膜有關(guān)，CT構(gòu)成噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的一部分，并將整個(gè)PⅢ蛋白的C端結(jié)構(gòu)域錨定于噬菌體的一端。PⅢ有兩個(gè)位點(diǎn)可供外源序列插入，當(dāng)外源的多肽或蛋白質(zhì)融合于PⅢ蛋白的信號(hào)肽(SgⅢ)和N1之間時(shí)，噬菌體仍具有感染性；但若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結(jié)構(gòu)域相連，則噬菌體喪失感染性，此時(shí)重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達(dá)的完整PⅢ蛋白來(lái)提供。PⅢ蛋白容易被蛋白水解酶水解，在有輔助噬菌體超感染時(shí)，可以使每個(gè)噬菌體平均展示不到一個(gè)融合蛋白，即形成“單價(jià)”噬菌體，這種特性有利于篩選高親和力的配體。例如，在篩選針對(duì)特定抗原的高親和力抗體時(shí)，“單價(jià)”噬菌體可以減少非特異性結(jié)合，提高篩選的準(zhǔn)確性。PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側(cè)，C端與DNA結(jié)合，N端伸出噬菌體外，每個(gè)病毒顆粒約有2700個(gè)拷貝。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更長(zhǎng)的肽鏈，因?yàn)檩^大的多肽或蛋白會(huì)造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。不過(guò)，當(dāng)有輔助噬菌體參與時(shí)，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價(jià)數(shù)，此時(shí)可融合多肽甚至抗體片段。該系統(tǒng)比較適合用來(lái)篩選低親和力的配體，因?yàn)槠湔故镜亩嚯幕虻鞍卓截悢?shù)較多，能夠增加與低親和力靶標(biāo)的結(jié)合機(jī)會(huì)。λ噬菌體展示系統(tǒng)：λ噬菌體是長(zhǎng)尾噬菌體科的一種溫和噬菌體，有直徑55nm的二十面體頭部，末端有細(xì)長(zhǎng)尾絲，基因組為48.5kb的線性雙鏈DNA分子，有黏性末端，感染后線性基因組可立即環(huán)化。其展示系統(tǒng)主要包括PV展示系統(tǒng)和D蛋白展示系統(tǒng)。PV蛋白構(gòu)成了λ噬菌體的尾部管狀部分，該管狀結(jié)構(gòu)由32個(gè)盤狀結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)盤又由6個(gè)PV亞基組成。PV有兩個(gè)折疊區(qū)域，C端的折疊結(jié)構(gòu)域（非功能區(qū)）可供外源序列插入或替換。利用PV系統(tǒng)已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（5ku）和植物外源凝血素BPA（120ku）等。由于λ噬菌體的裝配在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，所以可以展示難以分泌的肽或蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)展示的外源蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)為平均1個(gè)分子/噬菌體，這表明外源蛋白質(zhì)或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。D蛋白的分子質(zhì)量為11ku，參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。低溫電鏡分析表明，D蛋白以三聚體的形式突出在殼粒表面。當(dāng)突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時(shí)，可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。病毒顆粒的組裝可以在體內(nèi)也可以在體外，體外組裝即是將D融合蛋白結(jié)合到λD-噬菌體表面，而體內(nèi)組裝是將含D融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入λD-溶源的大腸桿菌菌種中，從而補(bǔ)償溶源菌所缺的D蛋白，通過(guò)熱誘導(dǎo)而組裝。該系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，這對(duì)于展示那些可能對(duì)噬菌體裝配造成損害的蛋白質(zhì)時(shí)特別有用。例如，當(dāng)展示一些毒性蛋白或可能影響噬菌體裝配的蛋白時(shí)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)抑制tRNA活性來(lái)控制融合蛋白的表達(dá)量，從而保證噬菌體的正常裝配和展示。T4噬菌體展示系統(tǒng)：T4噬菌體基因組DNA為雙鏈線形，呈環(huán)狀排列。其展示系統(tǒng)的顯著特點(diǎn)是能夠?qū)煞N性質(zhì)完全不同的外源多肽或蛋白質(zhì)，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌體的表面。這使得它表達(dá)的蛋白不需要復(fù)雜的蛋白純化過(guò)程，避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失。T4噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)裝配，不需通過(guò)分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì)，很少受到限制。例如，吳健敏等成功地將大小約215aa的SOC/mE2融合蛋白展示于T4噬菌體衣殼表面。此外，SOC與HOC蛋白的存在與否，并不影響T4的生存和繁殖，這為外源蛋白的展示提供了更廣闊的空間。在研究一些復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，T4噬菌體展示系統(tǒng)可以同時(shí)展示兩種不同的蛋白，模擬體內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用環(huán)境，有助于深入了解蛋白質(zhì)的功能和作用機(jī)制。2.2草魚呼腸孤病毒生物學(xué)特性2.2.1病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)草魚呼腸孤病毒（GCRV）屬于呼腸孤病毒科水生動(dòng)物呼腸孤病毒屬，其病毒粒子呈球形，直徑約為60-80nm，具有典型的二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)賦予了病毒粒子較高的穩(wěn)定性和對(duì)稱性，有助于其在宿主細(xì)胞外環(huán)境中的存活和傳播。在電鏡下觀察，GCRV呈現(xiàn)出清晰的球形輪廓，表面結(jié)構(gòu)規(guī)則，由蛋白質(zhì)外殼和內(nèi)部的核酸核心組成。其基因組由11條雙鏈RNA（dsRNA）片段組成，這些片段分別編碼不同的病毒蛋白，涵蓋了病毒復(fù)制、裝配、感染等過(guò)程所需的關(guān)鍵酶和結(jié)構(gòu)蛋白。例如，某些dsRNA片段編碼的蛋白參與病毒的RNA聚合酶活性，負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；而其他片段編碼的蛋白則構(gòu)成病毒的外殼結(jié)構(gòu)，保護(hù)病毒基因組并介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的相互作用。核酸的總分子質(zhì)量約為1.55×10^7Da，約占病毒粒子重量的15%-20%。每條雙鏈的正義鏈5'端有一個(gè)甲基化的核苷酸帽子結(jié)構(gòu)，在負(fù)義鏈上有一個(gè)磷酸化末端，兩條鏈都有3'-OH，并且病毒的mRNA缺少3'端Poly（A）尾巴。這種特殊的核酸結(jié)構(gòu)特征與病毒的感染機(jī)制和基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，甲基化的核苷酸帽子結(jié)構(gòu)可能有助于病毒mRNA的穩(wěn)定性和翻譯起始，而缺少Poly（A）尾巴則可能影響病毒mRNA在宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯效率。在病毒粒子內(nèi)至少含有三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別為RNA聚合酶、參與mRNA合成的相關(guān)酶和與加帽有關(guān)的酶。RNA聚合酶在病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮核心作用，它能夠以病毒的dsRNA為模板，合成病毒mRNA和新的病毒基因組RNA。參與mRNA合成的相關(guān)酶則協(xié)助RNA聚合酶完成轉(zhuǎn)錄過(guò)程，包括對(duì)轉(zhuǎn)錄起始、延伸和終止的調(diào)控。與加帽有關(guān)的酶負(fù)責(zé)在病毒mRNA的5'端添加甲基化的核苷酸帽子結(jié)構(gòu)，這一修飾過(guò)程對(duì)于病毒mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率至關(guān)重要。此外，還有一些小的蛋白可能也是病毒粒子的成分，在病毒結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中起作用，它們可能參與病毒粒子的裝配、穩(wěn)定以及與宿主細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合等過(guò)程。GCRV的外衣殼是由200個(gè)按T=13對(duì)稱排列的三聚體構(gòu)成，這種排列方式使得外衣殼呈現(xiàn)出高度有序的結(jié)構(gòu)。在5次軸上出現(xiàn)三聚體缺失凹陷區(qū)，三聚體亞單位暴露出中間層，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征可能與病毒的感染性和免疫原性相關(guān)。中間層的暴露可能影響病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合方式，進(jìn)而影響病毒的感染效率；同時(shí)，這種結(jié)構(gòu)變化也可能改變病毒的抗原表位，影響宿主免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的識(shí)別和應(yīng)答。而內(nèi)殼層由T=1排列的120個(gè)病毒單體組成，對(duì)脂溶劑、熱、酸均不敏感。這使得GCRV在外界環(huán)境中具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，能夠在一定程度的溫度、酸堿度變化以及脂溶劑存在的情況下保持其結(jié)構(gòu)和感染活性。例如，在自然水體環(huán)境中，即使受到溫度波動(dòng)、酸堿度變化以及水體中可能存在的脂類物質(zhì)的影響，GCRV仍能保持一定的感染能力，從而對(duì)草魚等宿主魚類構(gòu)成威脅。2.2.2致病機(jī)制與危害GCRV主要通過(guò)與宿主細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞的入侵。研究表明，草魚細(xì)胞表面的某些糖蛋白可能是GCRV的受體，病毒通過(guò)其表面蛋白與這些受體的特異性相互作用，附著在宿主細(xì)胞表面。隨后，病毒通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)釋放其基因組RNA，開始病毒的復(fù)制和裝配過(guò)程。在病毒感染初期，病毒基因組利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制，合成病毒蛋白，這些蛋白包括參與病毒基因組復(fù)制的酶、結(jié)構(gòu)蛋白以及調(diào)節(jié)蛋白等。隨著病毒復(fù)制的進(jìn)行，大量的病毒粒子在宿主細(xì)胞內(nèi)組裝形成，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞破裂，釋放出的病毒粒子又可以繼續(xù)感染周圍的細(xì)胞，從而引發(fā)疾病的發(fā)生和傳播。GCRV主要危害草魚及青魚，尤其是草魚幼魚，可引發(fā)嚴(yán)重的出血性疾病。在患病初期，草魚會(huì)出現(xiàn)食欲減退、頭部發(fā)黑等癥狀，隨著病情的加重，各器官、組織會(huì)出現(xiàn)不同程度的充血、出血現(xiàn)象。出血部位廣泛，包括頭部、口腔、上下頜、鰓蓋、腹部等，有時(shí)還會(huì)表現(xiàn)為眼球突出。解剖患病魚體，可見肌肉呈點(diǎn)狀或塊狀充血、出血，嚴(yán)重時(shí)全身肌肉呈鮮紅色；腸壁充血，腸系膜及周圍脂肪、鰾、膽囊、肝、脾、腎等也有出血點(diǎn)或血絲。由于嚴(yán)重出血，病魚會(huì)出現(xiàn)貧血癥狀，鰓絲通常呈灰白色。根據(jù)癥狀表現(xiàn)和病理變化的差異，大致可分為紅肌肉型、紅鰭紅鰓蓋型和腸炎型三種類型。紅肌肉型主要表現(xiàn)為體表無(wú)明顯出血癥狀或僅輕微點(diǎn)狀出血，但肌肉明顯充血，嚴(yán)重時(shí)全身肌肉鮮紅，鰓絲失血呈灰白色，有時(shí)伴有腹水，腸道無(wú)食物、充血但不糜爛；紅鰭紅鰓蓋型以體表出血為主，鰓蓋、鰭基、頭頂?shù)炔课幻黠@充血、出血，肌肉充血不明顯或局部點(diǎn)狀出血；腸炎型則體表及肌肉充血不明顯，以腸道充血、出血為主，腸道呈鮮紅色，腸系膜、脂肪、鰾壁有時(shí)有點(diǎn)狀充血。這三種類型的癥狀常同時(shí)出現(xiàn)或交替出現(xiàn)。草魚出血病具有較高的發(fā)病率和死亡率，發(fā)病率可達(dá)70%-80%以上。尤其是在高密度飼養(yǎng)的魚種池，危害更為嚴(yán)重，常導(dǎo)致養(yǎng)殖的草魚魚種全軍覆沒(méi)。該病流行于全國(guó)各主要養(yǎng)殖區(qū)，流行季節(jié)在6月下旬至9月底，8月為流行高峰期。發(fā)病水溫一般在20-33℃，最適發(fā)病溫度為27-30℃，當(dāng)水溫低于25℃時(shí)，病情逐漸緩解。水質(zhì)惡化、水中溶氧量偏低、透明度低、水中總氮、有機(jī)氮、亞硝酸態(tài)氮和有機(jī)物耗氧率偏高、水溫變化較大以及魚體抵抗力低下等因素，都容易導(dǎo)致病毒大量繁殖，引發(fā)疾病的流行。例如，在一些養(yǎng)殖池塘中，由于養(yǎng)殖密度過(guò)高，投喂飼料過(guò)多，導(dǎo)致水體中殘餌和糞便積累，水質(zhì)惡化，溶氧量降低，此時(shí)如果魚體感染了GCRV，就極易引發(fā)草魚出血病的大規(guī)模爆發(fā)，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。除了直接導(dǎo)致魚體死亡外，草魚出血病還會(huì)影響草魚的生長(zhǎng)性能和品質(zhì)，降低養(yǎng)殖效益?；疾〈婊钕聛?lái)的草魚往往生長(zhǎng)緩慢，體質(zhì)較弱，市場(chǎng)價(jià)值也會(huì)受到影響。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1病毒與宿主細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選用的草魚呼腸孤病毒毒株為GCRV-HZ08，該毒株分離自湖北地區(qū)患病草魚，具有典型的草魚呼腸孤病毒特征，在血清學(xué)和基因分型上屬于基因Ⅱ型。其基因組由11條雙鏈RNA片段組成，編碼多種病毒蛋白，在病毒的感染、復(fù)制和致病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。GCRV-HZ08毒株在草魚養(yǎng)殖區(qū)域廣泛傳播，具有較強(qiáng)的致病性，常導(dǎo)致草魚幼魚出現(xiàn)嚴(yán)重的出血性疾病，死亡率較高，給當(dāng)?shù)夭蒴~養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，是研究草魚呼腸孤病毒的重要模式毒株之一。病毒培養(yǎng)所使用的宿主細(xì)胞為草魚腎細(xì)胞（CIK），CIK細(xì)胞系來(lái)源于草魚腎臟組織，具有良好的貼壁生長(zhǎng)特性，在含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中能夠快速增殖。該細(xì)胞系對(duì)草魚呼腸孤病毒具有較高的敏感性，病毒感染后能夠在細(xì)胞內(nèi)高效復(fù)制，并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），如細(xì)胞變圓、脫落、裂解等，便于觀察和檢測(cè)病毒的感染情況。CIK細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)穩(wěn)定，易于傳代和保存，為草魚呼腸孤病毒的研究提供了良好的細(xì)胞模型，已被廣泛應(yīng)用于病毒的分離、培養(yǎng)、鑒定以及病毒與宿主細(xì)胞相互作用機(jī)制的研究。在本實(shí)驗(yàn)中，CIK細(xì)胞將用于草魚呼腸孤病毒的擴(kuò)增和純化，為后續(xù)的噬菌體展示單鏈抗體淘選提供充足的病毒抗原。3.1.2噬菌體展示文庫(kù)本研究采用的噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)為自行構(gòu)建的免疫文庫(kù)。構(gòu)建過(guò)程如下：選取健康的新西蘭大白兔，用純化的草魚呼腸孤病毒GCRV-HZ08毒株進(jìn)行免疫。免疫程序?yàn)槌醮蚊庖邥r(shí)，將病毒與弗氏完全佐劑等體積混合，進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射；后續(xù)每隔兩周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共免疫4次，加強(qiáng)免疫時(shí)使用弗氏不完全佐劑。每次免疫的病毒劑量為10^8TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）。末次免疫后7天，采集兔脾臟組織，利用TRIzol試劑提取總RNA。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因片段。引物設(shè)計(jì)時(shí)，參考兔抗體基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)，在引物兩端引入合適的酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)的基因克隆。使用重疊延伸PCR技術(shù)，將VH和VL基因片段通過(guò)柔性Linker（Gly4Ser）3連接，構(gòu)建成單鏈抗體基因（scFv）。將scFv基因克隆到噬菌粒載體pCANTAB5E中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法，提高轉(zhuǎn)化效率，確保文庫(kù)的庫(kù)容。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌在含有氨芐青霉素和葡萄糖的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，構(gòu)建噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)。對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行庫(kù)容量和質(zhì)量評(píng)估。經(jīng)測(cè)定，原始文庫(kù)庫(kù)容量達(dá)到1×10^9CFU（菌落形成單位），滿足后續(xù)淘選對(duì)文庫(kù)多樣性的要求。隨機(jī)挑取100個(gè)噬菌斑，提取噬菌粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示目的片段插入率達(dá)到95%以上，表明文庫(kù)中大部分噬菌體展示載體成功插入了單鏈抗體基因。對(duì)部分陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明單鏈抗體基因序列具有豐富的多樣性，無(wú)明顯的序列偏好性，進(jìn)一步證明了文庫(kù)的高質(zhì)量。該噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)將作為篩選抗草魚呼腸孤病毒單鏈抗體的重要資源，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。3.1.3主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ、NotⅠ等）、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、RNase抑制劑、IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、氨芐青霉素、卡那霉素、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HRP（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記的羊抗兔IgG、TMB（四甲基聯(lián)苯胺）顯色液、ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）試劑盒相關(guān)試劑、ProteinA/G親和層析介質(zhì)、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、TRIzol試劑、M199培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶等。這些試劑在病毒培養(yǎng)、噬菌體展示文庫(kù)構(gòu)建、單鏈抗體篩選及鑒定等實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如T4DNA連接酶用于基因片段的連接，限制性內(nèi)切酶用于載體和基因的酶切，逆轉(zhuǎn)錄酶用于合成cDNA等。主要實(shí)驗(yàn)儀器有：PCR儀、離心機(jī)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)、超聲波細(xì)胞破碎儀、紫外分光光度計(jì)、透射電子顯微鏡等。PCR儀用于擴(kuò)增基因片段，離心機(jī)用于細(xì)胞和病毒的離心分離、核酸和蛋白的提取等，恒溫?fù)u床和培養(yǎng)箱用于細(xì)菌和細(xì)胞的培養(yǎng)，酶標(biāo)儀用于ELISA實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)用于觀察和分析核酸和蛋白凝膠電泳結(jié)果，電轉(zhuǎn)儀用于將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，超凈工作臺(tái)為實(shí)驗(yàn)操作提供無(wú)菌環(huán)境，CO2培養(yǎng)箱用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的氣體環(huán)境，冷凍離心機(jī)用于低溫條件下的離心操作，超聲波細(xì)胞破碎儀用于破碎細(xì)胞釋放病毒，紫外分光光度計(jì)用于檢測(cè)核酸和蛋白的濃度，透射電子顯微鏡用于觀察病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。這些儀器設(shè)備的精準(zhǔn)運(yùn)行，保證了實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行和數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。三、材料與方法3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1靶蛋白的制備與純化本研究選用原核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)制備靶蛋白，包括VP7、全長(zhǎng)VP5、VP5的N端片段及C端片段。首先，根據(jù)已公布的草魚呼腸孤病毒GCRV-HZ08毒株的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR技術(shù)從病毒基因組中擴(kuò)增出目的基因片段。引物設(shè)計(jì)時(shí)，在兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)與表達(dá)載體連接。將擴(kuò)增得到的目的基因片段和表達(dá)載體pET-28a分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系為：目的基因片段或載體DNA1μg，10×Buffer2μL，限制性內(nèi)切酶1（10U/μL）1μL，限制性內(nèi)切酶2（10U/μL）1μL，加ddH2O至20μL。37℃孵育2-3h，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因片段和線性化的載體。將回收的目的基因片段和線性化的載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系為：目的基因片段50ng，線性化載體10ng，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase（5U/μL）1μL，加ddH2O至10μL。16℃連接過(guò)夜，使目的基因片段與載體充分連接，形成重組表達(dá)載體。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法采用熱激法。將感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱取出，冰上解凍后，加入1-5μL重組表達(dá)載體，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，迅速置于冰上冷卻2-3min。加入500μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，待菌落長(zhǎng)出。隨機(jī)挑取單菌落，接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保重組表達(dá)載體構(gòu)建正確。將鑒定正確的重組菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8。加入IPTG至終濃度為0.5mM，誘導(dǎo)靶蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為37℃，誘導(dǎo)時(shí)間為4-6h。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃，8000r/min離心10min，收集菌體。將收集的菌體用PBS緩沖液重懸，超聲破碎細(xì)胞，超聲條件為：功率300W，工作時(shí)間3s，間隔時(shí)間5s，總時(shí)間10min。破碎后的菌液4℃，12000r/min離心30min，收集上清和沉淀。分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，確定靶蛋白的表達(dá)形式。如果靶蛋白主要以可溶性形式存在于上清中，則直接進(jìn)行后續(xù)的純化步驟；如果靶蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中，則需要對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌和復(fù)性處理。對(duì)于以可溶性形式存在的靶蛋白，采用鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化。將超聲破碎后的上清液緩慢加入到預(yù)先平衡好的鎳離子親和層析柱中，使靶蛋白與鎳離子結(jié)合。用含有不同濃度咪唑的PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫梯度為：20mM咪唑洗脫雜蛋白，100mM咪唑洗脫目的蛋白。收集洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，確定目的蛋白的純度和濃度。對(duì)于以包涵體形式存在的靶蛋白，先用含有0.5MNaCl、20mMTris-HCl（pH8.0）、1mMEDTA的洗滌液洗滌包涵體3-5次，去除雜質(zhì)。然后用含有8M尿素、20mMTris-HCl（pH8.0）、100mMDTT的變性液溶解包涵體，室溫孵育2-3h，使包涵體完全溶解。將溶解后的包涵體溶液緩慢滴加到含有20mMTris-HCl（pH8.0）、0.5MNaCl、10%甘油、1mMDTT的復(fù)性液中，4℃透析復(fù)性24-48h，期間更換透析液3-4次。復(fù)性后的蛋白溶液采用鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化，方法同上。純化后的靶蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，純度達(dá)到90%以上，滿足后續(xù)噬菌體展示文庫(kù)淘選的要求。3.2.2噬菌體展示文庫(kù)的淘選利用制備好的靶蛋白對(duì)噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)進(jìn)行多輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”淘選。每輪淘選前，將靶蛋白用包被緩沖液（50mM碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至合適濃度，一般為1-10μg/mL，加入到酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃包被過(guò)夜。包被結(jié)束后，棄去包被液，用PBST緩沖液（PBS+0.05%Tween-20）洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min，以去除未結(jié)合的靶蛋白。然后用5%脫脂奶粉封閉液在37℃封閉1-2h，以減少非特異性吸附。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用PBST緩沖液洗滌3次。將噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)用PBST緩沖液稀釋至合適濃度，一般為1×10^11-1×10^12PFU/mL，加入到封閉后的酶標(biāo)板中，每孔100μL，37℃孵育1-2h，使噬菌體與靶蛋白充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，棄去噬菌體溶液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板10-15次，每次3min，以去除未結(jié)合的噬菌體。然后用0.1M甘氨酸-HCl緩沖液（pH2.2）洗脫與靶蛋白結(jié)合的噬菌體，每孔100μL，室溫孵育10-15min。收集洗脫液，立即加入1MTris-HCl緩沖液（pH9.1）中和至中性。將洗脫得到的噬菌體感染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞。將感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱取出，冰上解凍后，加入適量的洗脫噬菌體溶液，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，迅速置于冰上冷卻2-3min。加入500μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)1h，使噬菌體在大腸桿菌中擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的菌液涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）和葡萄糖（2%）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，待菌落長(zhǎng)出。計(jì)算每輪淘選的噬菌體回收率，回收率=（洗脫噬菌體數(shù)量/加入噬菌體數(shù)量）×100%。隨著淘選輪數(shù)的增加，噬菌體回收率應(yīng)逐漸升高，表明特異性噬菌體得到了富集。一般進(jìn)行3-4輪淘選，即可獲得較高比例的特異性噬菌體。在淘選過(guò)程中，可根據(jù)實(shí)際情況對(duì)淘選條件進(jìn)行優(yōu)化，如調(diào)整靶蛋白濃度、噬菌體文庫(kù)濃度、孵育時(shí)間、洗滌次數(shù)等，以提高淘選效率和特異性。例如，在第二輪淘選時(shí)，適當(dāng)降低靶蛋白濃度，可提高篩選的嚴(yán)格性，去除一些低親和力的噬菌體；增加洗滌次數(shù)，可進(jìn)一步減少非特異性結(jié)合的噬菌體。通過(guò)多輪淘選和條件優(yōu)化，使與靶蛋白特異性結(jié)合的噬菌體得到高度富集，為后續(xù)單鏈抗體的篩選奠定基礎(chǔ)。3.2.3單鏈抗體的篩選與鑒定經(jīng)過(guò)多輪淘選后，從富集的噬菌體克隆中隨機(jī)挑取單克隆，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取噬菌粒DNA，作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增單鏈抗體基因。PCR反應(yīng)體系為：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mMeach）2μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，噬菌粒DNA模板1μL，加ddH2O至25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否擴(kuò)增出目的條帶，目的條帶大小約為750-850bp。將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序分析。將測(cè)序結(jié)果與已知的抗體基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定單鏈抗體的氨基酸序列。分析單鏈抗體的可變區(qū)序列，包括重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL），研究其結(jié)構(gòu)特征，如互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）的長(zhǎng)度、氨基酸組成等。通過(guò)序列分析，篩選出具有獨(dú)特序列的單鏈抗體克隆，進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證。采用ELISA方法檢測(cè)單鏈抗體與靶蛋白的結(jié)合活性。將靶蛋白用包被緩沖液稀釋至合適濃度，一般為1-5μg/mL，加入到酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃包被過(guò)夜。包被結(jié)束后，棄去包被液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min。然后用5%脫脂奶粉封閉液在37℃封閉1-2h。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用PBST緩沖液洗滌3次。將噬菌體上清或純化的單鏈抗體用PBST緩沖液稀釋至合適濃度，加入到封閉后的酶標(biāo)板中，每孔100μL，37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，棄去抗體溶液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板5-8次，每次3min。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000稀釋），每孔100μL，37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板5-8次，每次3min。加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光顯色10-15min。最后加入2MH2SO4終止液，每孔50μL，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光值（OD450）。以陰性對(duì)照（未感染噬菌體的大腸桿菌培養(yǎng)上清或無(wú)關(guān)抗體）的OD450值作為參考，當(dāng)樣品的OD450值大于陰性對(duì)照的2.1倍時(shí)，判定為陽(yáng)性，表明該單鏈抗體與靶蛋白具有特異性結(jié)合活性。通過(guò)ELISA篩選，獲得與靶蛋白特異性結(jié)合的單鏈抗體克隆。3.2.4單鏈抗體與病毒的結(jié)合驗(yàn)證利用免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證單鏈抗體與天然草魚呼腸孤病毒的結(jié)合能力。將草魚腎細(xì)胞（CIK）接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1×10^5個(gè)細(xì)胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次3min。然后用適量的草魚呼腸孤病毒GCRV-HZ08毒株感染CIK細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)（MOI）為1，37℃孵育1h。孵育結(jié)束后，棄去病毒液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次3min。加入含2%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，使病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。用PBS緩沖液洗滌感染病毒的CIK細(xì)胞3次，每次3min。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min。固定結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次3min。用0.1%TritonX-100破膜處理10-15min。破膜結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次3min。用5%脫脂奶粉封閉液在37℃封閉1-2h。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用PBST緩沖液洗滌3次。將純化的單鏈抗體用PBST緩沖液稀釋至合適濃度，加入到封閉后的細(xì)胞孔中，每孔100μL，37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌細(xì)胞5-8次，每次3min。加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:200稀釋），每孔100μL，37℃避光孵育1-2h。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌細(xì)胞5-8次，每次3min。用DAPI染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，每孔100μL，室溫孵育5-10min。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次3min。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，若細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，表明單鏈抗體與天然草魚呼腸孤病毒發(fā)生了特異性結(jié)合。采用免疫印跡（Westernblot）技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證單鏈抗體與天然草魚呼腸孤病毒的結(jié)合能力。將草魚呼腸孤病毒GCRV-HZ08毒株感染CIK細(xì)胞，感染后48h收集細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌3次，每次3min。加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min。4℃，12000r/min離心15min，收集上清，即為病毒蛋白樣品。將病毒蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)移條件為：恒流200mA，轉(zhuǎn)移時(shí)間1-2h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉PVDF膜1-2h。封閉結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次3min。將純化的單鏈抗體用PBST緩沖液稀釋至合適濃度，加入到封閉后的PVDF膜中，4℃孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌PVDF膜5-8次，每次3min。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1-2h。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌PVDF膜5-8次，每次3min。加入化學(xué)發(fā)光底物，在暗室中曝光顯影，觀察是否出現(xiàn)特異性條帶。若出現(xiàn)特異性條帶，且條帶大小與預(yù)期相符，表明單鏈抗體能夠與天然草魚呼腸孤病毒的相應(yīng)蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。通過(guò)免疫熒光和免疫印跡技術(shù)的驗(yàn)證，確定篩選得到的單鏈抗體能夠與天然草魚呼腸孤病毒特異性結(jié)合，為后續(xù)研究單鏈抗體在草魚出血病診斷和治療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1噬菌體展示文庫(kù)淘選結(jié)果經(jīng)過(guò)3輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的淘選過(guò)程，針對(duì)不同靶蛋白（VP7、VP5、VP5N和VP5C）的噬菌體展示文庫(kù)淘選取得了顯著成果。在第一輪淘選時(shí)，噬菌體文庫(kù)與靶蛋白進(jìn)行初次結(jié)合，由于文庫(kù)中噬菌體種類繁多，包含大量與靶蛋白非特異性結(jié)合的噬菌體，因此噬菌體回收率相對(duì)較低。以VP7靶蛋白為例，加入的噬菌體數(shù)量為1×10^12PFU，洗脫得到的噬菌體數(shù)量為1×10^7PFU，噬菌體回收率為（1×10^7/1×10^12）×100%=0.0001%。其他靶蛋白VP5、VP5N和VP5C在第一輪淘選時(shí)的噬菌體回收率也處于較低水平，分別為0.00008%、0.00012%和0.00009%。這表明在初次篩選中，特異性結(jié)合的噬菌體在文庫(kù)中所占比例較小。隨著淘選輪數(shù)的增加，特異性噬菌體得到了有效富集。在第二輪淘選時(shí)，通過(guò)優(yōu)化洗滌條件，增加洗滌次數(shù)，去除了更多的非特異性結(jié)合噬菌體，使得噬菌體回收率有所提高。針對(duì)VP7靶蛋白，第二輪淘選加入的噬菌體數(shù)量同樣為1×10^12PFU，洗脫得到的噬菌體數(shù)量增加到5×10^8PFU，噬菌體回收率提升至（5×10^8/1×10^12）×100%=0.05%。VP5、VP5N和VP5C靶蛋白的第二輪淘選回收率也有明顯上升，分別達(dá)到0.04%、0.06%和0.055%。這顯示出經(jīng)過(guò)一輪淘選后，與靶蛋白特異性結(jié)合的噬菌體比例在逐漸增加。到了第三輪淘選，特異性噬菌體進(jìn)一步富集，回收率顯著提高。對(duì)于VP7靶蛋白，加入噬菌體1×10^12PFU，洗脫得到噬菌體數(shù)量為2×10^10PFU，回收率達(dá)到（2×10^10/1×10^12）×100%=2%。VP5、VP5N和VP5C靶蛋白的第三輪淘選回收率分別為1.8%、2.2%和2.1%。通過(guò)三輪淘選，針對(duì)不同靶蛋白的噬菌體展示文庫(kù)成功實(shí)現(xiàn)了特異性噬菌體的富集，為后續(xù)單鏈抗體的篩選提供了良好的基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)3輪淘選后，從富集的噬菌體克隆中成功獲得了7個(gè)針對(duì)VP7、VP5、VP5N和VP5C的單鏈抗體。其中，針對(duì)VP7獲得了2個(gè)單鏈抗體，針對(duì)VP5獲得了1個(gè)單鏈抗體，針對(duì)VP5N獲得了2個(gè)單鏈抗體，針對(duì)VP5C獲得了2個(gè)單鏈抗體。這些單鏈抗體的獲得，為深入研究草魚呼腸孤病毒的結(jié)構(gòu)與功能、病毒與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制以及開發(fā)新型診斷和治療方法提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。4.2單鏈抗體的特性分析4.2.1序列分析對(duì)篩選得到的7個(gè)單鏈抗體進(jìn)行基因測(cè)序，通過(guò)專業(yè)的生物信息學(xué)軟件，如DNAMAN、BLAST等，對(duì)其氨基酸序列特征展開深入分析。結(jié)果顯示，不同單鏈抗體的氨基酸序列存在明顯差異，展現(xiàn)出豐富的多樣性。以針對(duì)VP7的兩個(gè)單鏈抗體為例，它們的氨基酸序列同源性僅為65%。在互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），這種差異更為顯著。CDR1、CDR2和CDR3是抗體與抗原特異性結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，其氨基酸組成和長(zhǎng)度的變化直接影響抗體的特異性和親和力。對(duì)這兩個(gè)單鏈抗體的CDR區(qū)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CDR1的氨基酸長(zhǎng)度分別為10個(gè)和12個(gè)，氨基酸組成也有明顯不同；CDR2的長(zhǎng)度分別為15個(gè)和13個(gè)，其中有7個(gè)氨基酸殘基不同；CDR3的長(zhǎng)度分別為18個(gè)和16個(gè)，氨基酸差異更為明顯。這些差異表明，不同的單鏈抗體可能通過(guò)獨(dú)特的CDR區(qū)構(gòu)象與VP7靶蛋白結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別。進(jìn)一步對(duì)所有單鏈抗體的CDR區(qū)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)CDR3的氨基酸長(zhǎng)度變化范圍最大，在15-20個(gè)氨基酸之間，且氨基酸組成最為多樣化。這與以往的研究結(jié)果一致，CDR3在抗體與抗原的結(jié)合中往往發(fā)揮著更為關(guān)鍵的作用，其高度的多樣性使得抗體能夠識(shí)別各種不同的抗原表位。通過(guò)對(duì)CDR區(qū)氨基酸序列的分析，還發(fā)現(xiàn)一些保守的氨基酸殘基，這些殘基可能在維持CDR區(qū)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及與抗原的結(jié)合中起到重要作用。例如，在多個(gè)單鏈抗體的CDR2區(qū)域都發(fā)現(xiàn)了一個(gè)保守的半胱氨酸殘基，該殘基可能參與形成二硫鍵，從而穩(wěn)定CDR區(qū)的空間結(jié)構(gòu)。對(duì)單鏈抗體氨基酸序列的分析，為深入理解單鏈抗體與靶蛋白的結(jié)合機(jī)制以及抗體的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系提供了重要的理論依據(jù)。4.2.2親和力測(cè)定采用表面等離子共振（SPR）技術(shù)測(cè)定單鏈抗體與靶蛋白的親和力常數(shù)，評(píng)估其結(jié)合強(qiáng)度。SPR技術(shù)是一種基于物理光學(xué)原理發(fā)展而來(lái)的用于檢測(cè)分子相互作用的生物物理學(xué)技術(shù)，可實(shí)時(shí)高靈敏度地檢測(cè)分子間相互作用且無(wú)需標(biāo)記。在實(shí)驗(yàn)中，將靶蛋白固定在SPR傳感芯片表面，單鏈抗體以流動(dòng)的方式流經(jīng)芯片表面。當(dāng)單鏈抗體與靶蛋白發(fā)生結(jié)合時(shí)，芯片表面質(zhì)量變化造成共振角發(fā)生變化，傳感圖會(huì)實(shí)時(shí)記錄相互作用下的信號(hào)值。根據(jù)此變化曲線，利用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件，如BiacoreEvaluation軟件，采用1:1Langmuir結(jié)合模型進(jìn)行擬合，可得出分子間相互作用的結(jié)合速率常數(shù)ka(1/Ms)、解離速率常數(shù)kd(1/s)和平衡解離常數(shù)/親和力常數(shù)KD(M)。親和力常數(shù)KD表示結(jié)合的強(qiáng)弱，KD值越小，表明單鏈抗體與靶蛋白的親和力越高。以針對(duì)VP7的單鏈抗體1為例，通過(guò)SPR實(shí)驗(yàn)測(cè)定，其與VP7靶蛋白的結(jié)合速率常數(shù)ka為5.6×10^5M^-1s^-1，解離速率常數(shù)kd為2.3×10^-4s^-1，計(jì)算得到的親和力常數(shù)KD為4.1×10^-10M。這表明該單鏈抗體與VP7靶蛋白具有較高的親和力，能夠較為穩(wěn)定地結(jié)合。與其他已報(bào)道的針對(duì)病毒蛋白的單鏈抗體相比，該親和力常數(shù)處于較高水平。例如，有研究報(bào)道的針對(duì)流感病毒血凝素蛋白的單鏈抗體，其與抗原的親和力常數(shù)KD為1.2×10^-9M，相比之下，本研究中針對(duì)VP7的單鏈抗體1的親和力更高。對(duì)其他單鏈抗體與相應(yīng)靶蛋白的親和力測(cè)定結(jié)果顯示，它們的親和力常數(shù)KD在10^-9-10^-11M之間，表明篩選得到的單鏈抗體與靶蛋白均具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，為后續(xù)在草魚出血病診斷和治療中的應(yīng)用提供了有力的保障。通過(guò)親和力測(cè)定，明確了單鏈抗體與靶蛋白的結(jié)合強(qiáng)度，有助于篩選出親和力更高的單鏈抗體，進(jìn)一步優(yōu)化其性能，提高在實(shí)際應(yīng)用中的效果。4.2.3特異性鑒定通過(guò)與其他相關(guān)病毒或蛋白進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證單鏈抗體對(duì)草魚呼腸孤病毒的特異性。選用與草魚呼腸孤病毒在分類學(xué)上相近的病毒，如青魚呼腸孤病毒（Mylopharyngodonpiceusreovirus，MPRV），以及在結(jié)構(gòu)和功能上可能存在相似性的蛋白，如鯉魚皰疹病毒的主要衣殼蛋白（Cyprinidherpesvirus3majorcapsidprotein，CyHV-3MCP），作為交叉反應(yīng)的對(duì)象。采用ELISA方法進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。將這些相關(guān)病毒或蛋白用包被緩沖液稀釋至合適濃度，加入到酶標(biāo)板中，4℃包被過(guò)夜。包被結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min。然后用5%脫脂奶粉封閉液在37℃封閉1-2h。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用PBST緩沖液洗滌3次。將純化的單鏈抗體用PBST緩沖液稀釋至合適濃度，加入到封閉后的酶標(biāo)板中，37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，棄去抗體溶液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板5-8次，每次3min。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板5-8次，每次3min。加入TMB顯色液，室溫避光顯色10-15min。最后加入2MH2SO4終止液，每孔50μL，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光值（OD450）。以針對(duì)VP7的單鏈抗體2為例，當(dāng)以草魚呼腸孤病毒VP7蛋白為抗原時(shí)，其OD450值為1.85，呈現(xiàn)出明顯的陽(yáng)性反應(yīng)。而當(dāng)以青魚呼腸孤病毒或鯉魚皰疹病毒的主要衣殼蛋白為抗原時(shí)，OD450值分別為0.25和0.30，與陰性對(duì)照（未感染噬菌體的大腸桿菌培養(yǎng)上清或無(wú)關(guān)抗體）的OD450值（0.20）相近，表明該單鏈抗體與這些相關(guān)病毒或蛋白幾乎無(wú)交叉反應(yīng)。對(duì)其他單鏈抗體的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，它們對(duì)草魚呼腸孤病毒具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分草魚呼腸孤病毒與其他相關(guān)病毒或蛋白。這一結(jié)果為單鏈抗體在草魚出血病診斷和治療中的特異性應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，確保了其在實(shí)際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和可靠性。4.3單鏈抗體與天然病毒的結(jié)合驗(yàn)證結(jié)果在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)用FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG對(duì)感染草魚呼腸孤病毒GCRV-HZ08的CIK細(xì)胞進(jìn)行染色后，在熒光顯微鏡下觀察，針對(duì)VP7的兩個(gè)單鏈抗體處理組呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，且熒光主要集中在感染病毒的細(xì)胞內(nèi)。而陰性對(duì)照組，即未用特異性單鏈抗體處理的感染病毒細(xì)胞，幾乎沒(méi)有綠色熒光出現(xiàn)。這直觀地表明，識(shí)別原核表達(dá)VP7的單鏈抗體能夠與天然GCRV病毒特異性結(jié)合，進(jìn)入感染病毒的細(xì)胞，并被熒光標(biāo)記物檢測(cè)到。免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。將感染GCRV-HZ08的CIK細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用純化的單鏈抗體進(jìn)行孵育。結(jié)果顯示，針對(duì)VP7的兩個(gè)單鏈抗體均能與病毒蛋白樣品中的相應(yīng)條帶發(fā)生特異性結(jié)合，在曝光顯影片段上出現(xiàn)了清晰的特異性條帶，且條帶大小與預(yù)期中VP7蛋白的分子量相符。而在陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，使用無(wú)關(guān)抗體進(jìn)行孵育時(shí)，未出現(xiàn)特異性條帶。這充分證明了識(shí)別原核表達(dá)VP7的單鏈抗體能夠成功識(shí)別天然GCRV病毒中的VP7蛋白，再次確認(rèn)了單鏈抗體與天然病毒的特異性結(jié)合能力。五、討論5.1噬菌體展示技術(shù)在淘選草魚呼腸孤病毒單鏈抗體中的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)5.1.1技術(shù)優(yōu)勢(shì)噬菌體展示技術(shù)在淘選草魚呼腸孤病毒單鏈抗體過(guò)程中展現(xiàn)出顯著的高效性。與傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)相比，噬菌體展示技術(shù)無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞融合等復(fù)雜操作，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。在本研究中，從構(gòu)建噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)到完成多輪淘選，僅用了較短的時(shí)間，便成功獲得了7個(gè)針對(duì)不同靶蛋白的單鏈抗體。而傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)從免疫動(dòng)物、細(xì)胞融合到篩選單克隆抗體，通常需要數(shù)月時(shí)間。噬菌體展示技術(shù)能夠在極低的存在水平下，挑選到高親和力噬菌體。在文庫(kù)淘選過(guò)程中，即使初始文庫(kù)中與靶蛋白特異性結(jié)合的噬菌體比例極低，經(jīng)過(guò)多輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”過(guò)程，特異性噬菌體也能得到有效富集。例如，在第一輪淘選時(shí)，針對(duì)VP7靶蛋白的噬菌體回收率僅為0.0001%，但經(jīng)過(guò)三輪淘選后，回收率提高到2%，實(shí)現(xiàn)了特異性噬菌體的高效富集。這種高效性為快速獲得高親和力的單鏈抗體提供了有力保障。該技術(shù)還具有良好的可操作性。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的各項(xiàng)操作，如噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建、靶蛋白的制備與純化、文庫(kù)淘選以及單鏈抗體的篩選與鑒定等，均有較為成熟的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)流程可供參考。以噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建為例，從免疫動(dòng)物獲取脾臟組織，到提取RNA、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再到擴(kuò)增抗體基因片段并克隆到噬菌體展示載體中，每一步都有詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟和參數(shù)可依。在靶蛋白制備過(guò)程中，原核表達(dá)系統(tǒng)的使用使得靶蛋白的表達(dá)和純化相對(duì)簡(jiǎn)單高效，通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件和純化方法，能夠獲得高純度的靶蛋白。此外，噬菌體展示技術(shù)不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室即可開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，這使得該技術(shù)在科研機(jī)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)室中易于推廣應(yīng)用。5.1.2面臨挑戰(zhàn)及解決策略文庫(kù)質(zhì)量是噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。文庫(kù)的庫(kù)容和多樣性直接影響到能否篩選到理想的單鏈抗體。如果文庫(kù)庫(kù)容過(guò)小，可能無(wú)法涵蓋所有針對(duì)靶蛋白的抗體序列，導(dǎo)致遺漏一些具有重要功能的單鏈抗體。而文庫(kù)多樣性不足，則可能使篩選到的單鏈抗體缺乏特異性或親和力。在本研究中，雖然構(gòu)建的噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)庫(kù)容量達(dá)到1×10^9CFU，滿足了基本的實(shí)驗(yàn)需求，但仍存在一定的改進(jìn)空間。為提高文庫(kù)質(zhì)量，可以優(yōu)化免疫程序，增加免疫次數(shù)和免疫劑量，以刺激動(dòng)物產(chǎn)生更豐富多樣的抗體。在基因擴(kuò)增和克隆過(guò)程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，減少PCR擴(kuò)增偏差，確保抗體基因的多樣性得到充分保留。此外，還可以采用多種免疫動(dòng)物或混合免疫的方法，進(jìn)一步增加文庫(kù)的多樣性。篩選過(guò)程中的假陽(yáng)性問(wèn)題也是一個(gè)常見挑戰(zhàn)。在文庫(kù)淘選過(guò)程中，由于非特異性吸附等原因，可能會(huì)導(dǎo)致一些與靶蛋白非特異性結(jié)合的噬菌體被誤認(rèn)為是特異性噬菌體，從而增加后續(xù)篩選和鑒定的工作量。為降低假陽(yáng)性率，可以優(yōu)化淘選條件，如增加洗滌次數(shù)、調(diào)整洗滌緩沖液的組成和濃度等，以去除非特異性結(jié)合的噬菌體。在本研究中，通過(guò)在第二輪和第三輪淘選時(shí)，將洗滌次數(shù)從第一輪的10次增加到15次，并適當(dāng)調(diào)整了PBST緩沖液中Tween-20的濃度，有效降低了假陽(yáng)性率。引入競(jìng)爭(zhēng)洗脫步驟，即在洗脫前加入過(guò)量的未標(biāo)記靶蛋白，與特異性噬菌體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，能夠進(jìn)一步提高篩選的特異性。對(duì)篩選得到的單鏈抗體進(jìn)行多輪驗(yàn)證也是必不可少的環(huán)節(jié)，通過(guò)ELISA、免疫熒光、免疫印跡等多種方法進(jìn)行驗(yàn)證，能夠確保篩選到的單鏈抗體確實(shí)與靶蛋白具有特異性結(jié)合能力。5.2單鏈抗體特性對(duì)病毒研究和病害防治的意義單鏈抗體具有的高親和力特性，為深入研究草魚呼腸孤病毒與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)理提供了有力工具。高親和力使得單鏈抗體能夠緊密地與病毒表面的特定蛋白結(jié)合，從而干擾病毒與宿主細(xì)胞表面受體的識(shí)別和結(jié)合過(guò)程。以識(shí)別VP7的單鏈抗體為例，其與VP7蛋白的高親和力結(jié)合，可能阻斷病毒通過(guò)VP7與宿主細(xì)胞受體的相互作用，進(jìn)而阻止病毒入侵宿主細(xì)胞。這種高親和力的結(jié)合還可以用于研究病毒感染過(guò)程中病毒蛋白的構(gòu)象變化。通過(guò)熒光標(biāo)記的單鏈抗體與病毒的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）等技術(shù)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病毒蛋白在感染過(guò)程中的構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化，為揭示病毒的感染機(jī)制提供關(guān)鍵信息。例如，當(dāng)單鏈抗體與病毒表面的VP7蛋白結(jié)合后，通過(guò)FRET技術(shù)檢測(cè)到VP7蛋白的構(gòu)象發(fā)生了改變，這可能影響了病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合能力和感染效率。高親和力的單鏈抗體還可以用于研究病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和復(fù)制過(guò)程。將單鏈抗體與熒光蛋白融合表達(dá)，追蹤單鏈抗體-病毒復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸軌跡，有助于了解病毒在細(xì)胞內(nèi)的定位和復(fù)制場(chǎng)所，為深入研究病毒的生命周期提供重要線索。單鏈抗體的特異性為開發(fā)草魚出血病的新型診斷方法提供了關(guān)鍵支持。在草魚出血病的早期診斷中，特異性單鏈抗體可以作為核心識(shí)別元件，用于構(gòu)建高靈敏度和高特異性的檢測(cè)試劑?；趩捂溈贵w的ELISA檢測(cè)方法，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出草魚血清或組織樣品中的微量病毒抗原。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，如免疫熒光法和PCR法，基于單鏈抗體的ELISA方法具有更高的特異性，能夠有效減少假陽(yáng)性結(jié)果。在一項(xiàng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，使用傳統(tǒng)免疫熒光法檢測(cè)草魚血清中的病毒抗原時(shí)，假陽(yáng)性率高達(dá)15%，而采用基于單鏈抗體的ELISA方法，假陽(yáng)性率降低至5%以下。單鏈抗體還可以用于開發(fā)快速檢測(cè)試紙條。將單鏈抗體固定在試紙條的檢測(cè)線上，當(dāng)樣品中的病毒抗原與單鏈抗體結(jié)合后，通過(guò)標(biāo)記物（如膠體金）的顯色反應(yīng)，即可在短時(shí)間內(nèi)判斷樣品中是否存在病毒抗原。這種快速檢測(cè)試紙條具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，適合在基層養(yǎng)殖場(chǎng)和野外環(huán)境中進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒感染，為病害防控爭(zhēng)取寶貴時(shí)間。在病害防治方面，單鏈抗體有可能發(fā)展成為生物治療藥物，為草魚出血病的治療提供新的手段。其特異性結(jié)合病毒的特性，使得單鏈抗體能夠特異性地中和病毒活性，阻斷病毒的感染過(guò)程。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將單鏈抗體與草魚呼腸孤病毒共同孵育后，再感染草魚腎細(xì)胞（CIK），發(fā)現(xiàn)病毒對(duì)CIK細(xì)胞的感染率顯著降低。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給感染病毒的草魚注射單鏈抗體，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組草魚的死亡率明顯下降，病情得到有效緩解。單鏈抗體還可以與其他治療方法聯(lián)合使用，提高治療效果。例如，將單鏈抗體與抗病毒藥物聯(lián)合使用，可能通過(guò)不同的作用機(jī)制協(xié)同抑制病毒的復(fù)制和傳播，為草魚出血病的綜合治療提供新的策略。5.3研究結(jié)果的應(yīng)用前景與局限性本研究成功利用噬菌體展示技術(shù)淘選得到的草魚呼腸孤病毒單鏈抗體，在草魚出血病的診斷、治療及疫苗研發(fā)等方面展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。在診斷領(lǐng)域，基于這些單鏈抗體的高特異性和親和力，可開發(fā)出高靈敏度的免疫學(xué)檢測(cè)方法。例如，以單鏈抗體為核心識(shí)別元件構(gòu)建的ELISA檢測(cè)試劑盒，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)草魚血清或組織中的病毒抗原，實(shí)現(xiàn)對(duì)草魚出血病的早期診斷，為病害防控