基于壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA構(gòu)建與驗(yàn)證肝癌預(yù)后模型：精準(zhǔn)醫(yī)療的新視角一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肝癌現(xiàn)狀及挑戰(zhàn)肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重大疾病，其發(fā)病率和致死率一直居高不下，形勢(shì)極為嚴(yán)峻。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2022年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，當(dāng)年肝癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)到87萬(wàn)例，在所有癌癥中位居第6位；死亡病例數(shù)為76萬(wàn)例，高居第3位。我國(guó)作為人口大國(guó)，同樣深受肝癌困擾，2022年我國(guó)肝癌新發(fā)病例數(shù)為37萬(wàn)例，排第4位；死亡病例數(shù)32萬(wàn)例，位居第2位。肝癌的高致死率使得其成為嚴(yán)重影響我國(guó)居民健康和社會(huì)發(fā)展的公共衛(wèi)生問(wèn)題。肝癌的發(fā)病原因復(fù)雜多樣，主要包括乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染、酒精性肝硬化、長(zhǎng)期進(jìn)食黃曲霉素污染食品以及肝臟遺傳性疾病等。其中，HBV感染在我國(guó)肝癌發(fā)病中占據(jù)重要地位，我國(guó)約有8600萬(wàn)乙肝病毒攜帶者，約2800萬(wàn)為需要治療的乙肝患者，而肝癌患者中大約90%是從乙肝發(fā)展而成。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。即使接受了手術(shù)切除、肝移植術(shù)、消融治療、導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞、系統(tǒng)抗腫瘤治療等多種治療手段，肝癌患者的預(yù)后通常仍然很差，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，5年生存率較低。這不僅給患者帶來(lái)了巨大的身體痛苦和心理壓力，也給家庭和社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。精準(zhǔn)的預(yù)后評(píng)估對(duì)于肝癌患者的治療決策和臨床管理至關(guān)重要。準(zhǔn)確判斷患者的預(yù)后情況，能夠幫助醫(yī)生為患者制定個(gè)性化的治療方案，提高治療效果，延長(zhǎng)患者生存期。傳統(tǒng)的預(yù)后評(píng)估方法，如巴塞羅那臨床肝癌（BCLC）分期、腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（TNM）分期、日本肝病學(xué)會(huì)（JSH）分期等，主要基于腫瘤的大小、數(shù)目、有無(wú)轉(zhuǎn)移以及患者的肝功能等因素。然而，這些方法存在一定的局限性，無(wú)法全面準(zhǔn)確地反映肝癌的異質(zhì)性和患者的個(gè)體差異，導(dǎo)致部分患者的預(yù)后評(píng)估不準(zhǔn)確，影響治療效果。因此，迫切需要尋找新的生物標(biāo)志物和建立更精準(zhǔn)的預(yù)后模型，以提高肝癌患者的預(yù)后評(píng)估準(zhǔn)確性，為臨床治療提供更有力的支持。1.1.2壞死性凋亡與長(zhǎng)鏈非編碼RNA研究進(jìn)展壞死性凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，在形態(tài)學(xué)上具有壞死的特征，與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其主要由受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3（RIPK3）及其底物混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（MLKL）共同介導(dǎo)。在肝癌中，壞死性凋亡的失調(diào)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，同時(shí)影響腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。例如，有研究表明，在Traf2缺失的條件下，肝細(xì)胞中壞死性凋亡慢性激活與肝膽結(jié)構(gòu)重塑相關(guān)，RIPK1-RIPK3-MLKL依賴的壞死性凋亡信號(hào)驅(qū)動(dòng)了Traf2-/Casp8-小鼠的肝癌發(fā)生。此外，壞死性凋亡還可以通過(guò)釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）、細(xì)胞因子和/或趨化因子，調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸、缺乏顯著開(kāi)放閱讀框的非編碼RNA。隨著高通量測(cè)序技術(shù)、大規(guī)模lncRNAcDNA文庫(kù)的建立以及基因芯片技術(shù)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的研究表明lncRNA在多種生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在肝癌中，lncRNA參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥等多個(gè)關(guān)鍵過(guò)程。例如，中山大學(xué)彭麗團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)的新的促癌lncRNAFASRL，其表達(dá)受失調(diào)的超增強(qiáng)子調(diào)控，可促進(jìn)脂肪酸的從頭合成，從而加劇肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。lncRNA還可以通過(guò)與DNA、mRNA、蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用，在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多種層面調(diào)控基因的表達(dá)水平。將壞死性凋亡與長(zhǎng)鏈非編碼RNA結(jié)合起來(lái)研究肝癌，具有創(chuàng)新性和潛在的研究?jī)r(jià)值。壞死性凋亡相關(guān)的lncRNA可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，一方面，它們可能通過(guò)調(diào)控壞死性凋亡信號(hào)通路，影響肝癌細(xì)胞的存活和死亡；另一方面，也可能參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤的免疫逃逸和轉(zhuǎn)移。通過(guò)對(duì)壞死性凋亡相關(guān)lncRNA的研究，有望揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為肝癌的精準(zhǔn)診斷、預(yù)后評(píng)估和個(gè)體化治療提供理論依據(jù)和新的策略。1.2研究目的與主要內(nèi)容1.2.1研究目的本研究旨在通過(guò)深入探究壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA在肝癌中的作用機(jī)制，構(gòu)建并驗(yàn)證一種精準(zhǔn)的肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型。具體而言，本研究試圖從海量的基因數(shù)據(jù)中篩選出與肝癌壞死性凋亡密切相關(guān)的lncRNA，分析其在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)模式和調(diào)控機(jī)制，從而為肝癌患者的預(yù)后評(píng)估提供更為準(zhǔn)確、可靠的生物標(biāo)志物。同時(shí)，通過(guò)對(duì)不同風(fēng)險(xiǎn)組患者的臨床特征和治療反應(yīng)進(jìn)行分析，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案提供科學(xué)依據(jù)，提高肝癌患者的治療效果和生存率，改善患者的生活質(zhì)量，減輕家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。1.2.2主要內(nèi)容本研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面：首先，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如TCGA、GEO等）及實(shí)驗(yàn)室樣本中獲取肝癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床信息，確保數(shù)據(jù)的全面性和準(zhǔn)確性。利用生物信息學(xué)分析方法，對(duì)獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和質(zhì)量控制，篩選出差異表達(dá)的lncRNA，并通過(guò)共表達(dá)分析、功能富集分析等方法，確定與壞死性凋亡相關(guān)的lncRNA。接著，運(yùn)用單因素Cox回歸分析和LASSO-Cox回歸分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，構(gòu)建肝癌壞死性凋亡相關(guān)lncRNA預(yù)后模型，并計(jì)算每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。通過(guò)生存分析、受試者操作特征（ROC）曲線等方法，對(duì)模型的預(yù)測(cè)性能進(jìn)行評(píng)估，確定模型的準(zhǔn)確性和可靠性。然后，將構(gòu)建的預(yù)后模型在獨(dú)立的測(cè)試集中進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步評(píng)估模型的泛化能力和穩(wěn)定性。對(duì)不同風(fēng)險(xiǎn)組的患者進(jìn)行臨床病理特征分析、基因集富集分析（GSEA）、腫瘤免疫浸潤(rùn)分析等，探討模型與肝癌患者臨床特征、生物學(xué)功能及腫瘤免疫微環(huán)境之間的關(guān)系。最后，根據(jù)預(yù)后模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，對(duì)肝癌患者進(jìn)行分層，分析不同風(fēng)險(xiǎn)組患者對(duì)化療藥物、免疫治療藥物等的敏感性差異，為臨床個(gè)性化治療提供指導(dǎo)。結(jié)合臨床實(shí)際情況，評(píng)估預(yù)后模型在肝癌患者治療決策中的應(yīng)用價(jià)值，為其臨床推廣提供理論依據(jù)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肝癌概述2.1.1肝癌的分類(lèi)與病理特征肝癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，主要包括原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌兩大類(lèi)。其中，原發(fā)性肝癌是起源于肝臟上皮或間葉組織的惡性腫瘤，根據(jù)組織學(xué)來(lái)源不同，又可進(jìn)一步細(xì)分為肝細(xì)胞癌（HCC）、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（ICC）和混合型肝癌（cHCC-ICC）。肝細(xì)胞癌最為常見(jiàn)，約占原發(fā)性肝癌的75%-85%，其癌細(xì)胞來(lái)源于肝細(xì)胞，異型性明顯，呈多邊形，排列成巢狀或索狀，血竇豐富。肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌占肝臟惡性腫瘤的比例相對(duì)較低，約為2.3%，癌細(xì)胞由膽管上皮細(xì)胞發(fā)展而來(lái)，呈柱狀，排列成腺樣，纖維組織較多，血竇較少?；旌闲透伟﹦t同時(shí)具有肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌兩種成分，發(fā)生率少于肝臟腫瘤的5%。從大體病理形態(tài)來(lái)看，肝細(xì)胞癌又可分為彌漫型、塊狀型、巨塊型、結(jié)節(jié)型和小癌型。彌漫型表現(xiàn)為小癌結(jié)節(jié)彌漫分布于全肝；塊狀型瘤體直徑在5-10cm之間，根據(jù)腫塊數(shù)量和形態(tài)，又分單塊型、融合塊狀型、多塊狀型；巨塊型瘤體直徑大于10cm；結(jié)節(jié)型瘤體直徑在3-5cm之間；小癌型瘤體直徑小于3cm，邊界清楚。不同的病理類(lèi)型在發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)行為、治療方法及預(yù)后等方面存在顯著差異。例如，肝細(xì)胞癌的發(fā)生與乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染、肝硬化等因素密切相關(guān)，而肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的發(fā)病則與肝吸蟲(chóng)感染、膽管結(jié)石、原發(fā)性硬化性膽管炎等因素有關(guān)。了解肝癌的分類(lèi)和病理特征，對(duì)于深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制、制定合理的治療方案以及評(píng)估患者的預(yù)后具有重要意義。2.1.2肝癌的治療現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)肝癌的治療方法多樣，主要包括手術(shù)治療、局部治療、系統(tǒng)治療等。手術(shù)治療是肝癌患者獲得長(zhǎng)期生存的重要途徑，主要包括肝切除術(shù)和肝移植術(shù)。對(duì)于早期肝癌患者，肝切除術(shù)可有效切除腫瘤組織，提高患者的生存率。肝移植術(shù)則適用于合并肝硬化、肝功能失代償?shù)男「伟┗颊撸ㄟ^(guò)更換肝臟，可徹底清除腫瘤組織，同時(shí)改善肝功能。然而，由于肝癌起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。此外，即使接受了手術(shù)治療，患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率也較高，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量和生存期。局部治療主要包括消融治療、導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞（TACE）、放射治療等。消融治療通過(guò)物理或化學(xué)方法直接破壞腫瘤組織，適用于早期肝癌或不能耐受手術(shù)的患者。TACE是通過(guò)將化療藥物和栓塞劑注入腫瘤供血?jiǎng)用}，使腫瘤缺血壞死，同時(shí)發(fā)揮化療作用，主要用于中期肝癌患者。放射治療則利用高能射線殺死腫瘤細(xì)胞，對(duì)于無(wú)法手術(shù)切除或術(shù)后復(fù)發(fā)的肝癌患者具有一定的治療效果。但這些局部治療方法也存在局限性，如消融治療可能無(wú)法完全清除腫瘤組織，TACE治療后可能出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，放射治療可能對(duì)周?chē)＝M織造成損傷。系統(tǒng)治療包括化療、靶向治療、免疫治療等?；熕幬锿ㄟ^(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和分裂來(lái)發(fā)揮作用，但由于肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性較高，化療的療效有限，且副作用較大。靶向治療藥物能夠特異性地作用于腫瘤細(xì)胞的某些靶點(diǎn)，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖信號(hào)通路，具有療效高、副作用小的優(yōu)點(diǎn)。例如，索拉非尼是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于治療晚期肝癌的靶向藥物，它可以抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖，延長(zhǎng)患者的生存期。近年來(lái)，免疫治療在肝癌治療中取得了顯著進(jìn)展。免疫檢查點(diǎn)抑制劑如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，通過(guò)激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，為晚期肝癌患者帶來(lái)了新的治療希望。然而，免疫治療并非對(duì)所有患者都有效，且可能出現(xiàn)免疫相關(guān)不良反應(yīng)。肝癌治療面臨的挑戰(zhàn)主要包括以下幾個(gè)方面：一是肝癌的高度異質(zhì)性，不同患者的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為和對(duì)治療的反應(yīng)差異較大，導(dǎo)致治療方案的選擇困難。二是缺乏有效的早期診斷標(biāo)志物，大部分患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī)。三是腫瘤的耐藥性問(wèn)題，隨著治療的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞容易對(duì)化療藥物、靶向藥物等產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗。四是治療后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移問(wèn)題，即使經(jīng)過(guò)積極治療，肝癌患者仍有較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。因此，開(kāi)發(fā)新的治療方法和策略，提高肝癌的早期診斷率和治療效果，降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，是當(dāng)前肝癌研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。2.2壞死性凋亡的機(jī)制與在肝癌中的作用2.2.1壞死性凋亡的分子機(jī)制壞死性凋亡是一種程序性壞死細(xì)胞死亡形式，其分子機(jī)制涉及多個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路和分子。在腫瘤壞死因子（TNF）介導(dǎo)的壞死性凋亡途徑中，當(dāng)TNF與腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。TNFR1招募受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TRAF2）、細(xì)胞凋亡抑制蛋白1/2（cIAP1/2）等形成復(fù)合物I，在該復(fù)合物中，cIAP1/2通過(guò)對(duì)RIPK1進(jìn)行K63連接的多聚泛素化修飾，促進(jìn)核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路的激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞存活和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。然而，當(dāng)cIAP1/2被抑制或降解時(shí)，RIPK1從復(fù)合物I中解離，與RIPK3結(jié)合形成壞死小體（necrosome），即復(fù)合物IIb。RIPK3通過(guò)磷酸化激活其底物混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（MLKL），磷酸化的MLKL發(fā)生寡聚化并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、破裂，最終引發(fā)壞死性凋亡。模式識(shí)別受體（PRRs）也能啟動(dòng)壞死性凋亡信號(hào)通路。例如，Toll樣受體3（TLR3）識(shí)別病毒雙鏈RNA后，通過(guò)TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白誘導(dǎo)干擾素β（TRIF）招募RIPK1和RIPK3，激活壞死性凋亡途徑。Z-DNA結(jié)合蛋白1（ZBP1）作為一種DNA傳感器，在識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈DNA后，也可以通過(guò)與RIPK3相互作用，激活壞死性凋亡。此外，在某些情況下，死亡受體如Fas、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體2（TRAIL-R2）等與相應(yīng)配體結(jié)合后，也能通過(guò)激活RIPK1-RIPK3-MLKL信號(hào)軸，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。在壞死性凋亡過(guò)程中，除了上述核心信號(hào)分子外，還有一些調(diào)節(jié)因子參與其中。例如，F(xiàn)LICE樣抑制蛋白（FLIP）能夠抑制caspase-8的活性，當(dāng)FLIP缺失或功能異常時(shí)，caspase-8無(wú)法有效切割RIPK1，從而促進(jìn)壞死性凋亡的發(fā)生。鈣網(wǎng)蛋白（CRT）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白，在壞死性凋亡過(guò)程中，它可以從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面，作為一種“eat-me”信號(hào)，促進(jìn)吞噬細(xì)胞對(duì)壞死細(xì)胞的清除。Gasdermin家族蛋白中的GasderminD（GSDMD）在炎癥小體激活后被caspase-1或caspase-11切割，其N(xiāo)端結(jié)構(gòu)域能夠在細(xì)胞膜上形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生焦亡，但同時(shí)也可能參與壞死性凋亡的調(diào)節(jié)。研究表明，在某些細(xì)胞中，GSDMD的N端結(jié)構(gòu)域可以與MLKL相互作用，增強(qiáng)壞死性凋亡的發(fā)生。2.2.2壞死性凋亡與肝癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系壞死性凋亡與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在肝癌的多個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在肝癌發(fā)生階段，壞死性凋亡的失調(diào)可導(dǎo)致肝細(xì)胞的異常增殖和腫瘤的啟動(dòng)。有研究表明，在Traf2和Casp8雙缺失的小鼠模型中，RIPK1-RIPK3-MLKL依賴的壞死性凋亡信號(hào)驅(qū)動(dòng)了肝癌的發(fā)生。在該模型中，肝細(xì)胞中壞死性凋亡的慢性激活與肝膽結(jié)構(gòu)重塑相關(guān)，導(dǎo)致肝細(xì)胞增殖、炎癥和纖維化，最終引發(fā)肝癌。這可能是由于壞死性凋亡過(guò)程中釋放的損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、ATP等，激活了炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)了炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和細(xì)胞因子的釋放，為腫瘤的發(fā)生創(chuàng)造了有利的微環(huán)境。在肝癌發(fā)展過(guò)程中，壞死性凋亡對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性產(chǎn)生重要影響。一方面，壞死性凋亡可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖。通過(guò)激活壞死性凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，從而減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，使用壞死性凋亡誘導(dǎo)劑處理肝癌細(xì)胞系，能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖能力，降低細(xì)胞活力。另一方面，壞死性凋亡也可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。福建醫(yī)科大學(xué)勝利臨床醫(yī)學(xué)院ShiChen團(tuán)隊(duì)研究表明，在胰腺導(dǎo)管腺癌中，MLKL驅(qū)動(dòng)的壞死性凋亡會(huì)招募巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)腫瘤CD47的“不吃我”信號(hào)，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞細(xì)胞外陷阱（MET）形成以激活CXCL8，進(jìn)而啟動(dòng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。雖然這是在胰腺導(dǎo)管腺癌中的研究結(jié)果，但提示了壞死性凋亡在肝癌轉(zhuǎn)移中可能存在類(lèi)似的作用機(jī)制。此外，壞死性凋亡還與肝癌細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。一些研究表明，肝癌細(xì)胞在受到化療藥物或靶向藥物刺激時(shí)，可能通過(guò)激活壞死性凋亡途徑來(lái)逃避藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，從而產(chǎn)生耐藥性。例如，索拉非尼是一種常用的肝癌靶向治療藥物，部分肝癌細(xì)胞在長(zhǎng)期接受索拉非尼治療后，會(huì)通過(guò)上調(diào)RIPK3和MLKL的表達(dá)，激活壞死性凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致對(duì)索拉非尼產(chǎn)生耐藥性。壞死性凋亡還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展。壞死性凋亡細(xì)胞釋放的DAMPs和細(xì)胞因子，如CCL20、MCP-1、TNF等，能夠招募和激活免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等，從而影響腫瘤免疫監(jiān)視和免疫逃逸。德國(guó)杜塞爾多夫大學(xué)醫(yī)院胃腸病、肝病和傳染病科TomLuedde團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞中伴隨的壞死體和NF-κB激活，在生理上表達(dá)低濃度的RIPK3時(shí)，會(huì)迫使肝細(xì)胞進(jìn)入長(zhǎng)時(shí)間的“亞致死”狀態(tài)，釋放特定趨化因子，引發(fā)原癌單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞簇的激活，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生。相反，在某些情況下，壞死性凋亡也可以激活抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤的發(fā)展。例如，壞死性凋亡細(xì)胞釋放的DAMPs可以激活樹(shù)突狀細(xì)胞（DC），促進(jìn)DC的成熟和抗原呈遞功能，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。2.3長(zhǎng)鏈非編碼RNA的特性與功能2.3.1長(zhǎng)鏈非編碼RNA的結(jié)構(gòu)與分類(lèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成。lncRNA在結(jié)構(gòu)上與信使核糖核酸（mRNA）具有相似性，同樣擁有5'-帽子結(jié)構(gòu)、3'-多聚腺苷酸尾巴以及外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。然而，lncRNA缺乏有效的開(kāi)放閱讀框，不具備編碼蛋白質(zhì)的能力。根據(jù)lncRNA在基因組上相對(duì)于蛋白編碼基因的位置，可將其分為正義鏈（sense）、反義鏈（antisense）、雙向（bidirectional）、內(nèi)含子間（intronic）、基因間（intergenic）這5種類(lèi)型。正義lncRNA與蛋白編碼基因從同一DNA鏈轉(zhuǎn)錄，且部分序列重疊；反義lncRNA則與蛋白編碼基因從互補(bǔ)DNA鏈轉(zhuǎn)錄，序列互補(bǔ)；雙向lncRNA位于蛋白編碼基因啟動(dòng)子附近，與蛋白編碼基因雙向轉(zhuǎn)錄；內(nèi)含子lncRNA完全位于蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域；基因間lncRNA則位于兩個(gè)蛋白編碼基因之間。不同類(lèi)型的lncRNA在基因調(diào)控中發(fā)揮著不同的作用。例如，反義lncRNA可以通過(guò)與靶mRNA形成互補(bǔ)雙鏈，影響mRNA的穩(wěn)定性、剪切和翻譯過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)，反義lncRNAHOTAIRM1能夠與HOXA1mRNA相互作用，抑制HOXA1的表達(dá)，從而調(diào)控造血干細(xì)胞的分化?；蜷glncRNA則可以通過(guò)招募轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)修飾復(fù)合物等，調(diào)控鄰近基因的表達(dá)。例如，基因間lncRNAMALAT1可以通過(guò)與SR剪接因子相互作用，調(diào)控mRNA的可變剪接，影響細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。2.3.2長(zhǎng)鏈非編碼RNA在基因調(diào)控中的作用機(jī)制lncRNA在基因調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其作用機(jī)制涉及表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個(gè)層面。在表觀遺傳調(diào)控層面，lncRNA可以招募染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體到特定位點(diǎn)，進(jìn)而介導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)沉默。例如，來(lái)源于HOXC基因座的lncRNAHOTAIR，能夠招募染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體PRC2，并將其定位到HOXD位點(diǎn)，進(jìn)而誘導(dǎo)HOXD位點(diǎn)的組蛋白H3第27位賴氨酸甲基化（H3K27me3）修飾，導(dǎo)致該位點(diǎn)的表觀遺傳學(xué)沉默，影響基因的表達(dá)。同樣，Xist、Air、Kcnq1ot1這些lncRNA也都能夠通過(guò)招募相應(yīng)的重構(gòu)復(fù)合體，利用其中的甲基轉(zhuǎn)移酶如Ezh2或者G9a等實(shí)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)沉默。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面，lncRNA可以通過(guò)多種機(jī)制影響基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。其一，lncRNA的轉(zhuǎn)錄能夠干擾臨近基因的表達(dá)。在酵母中，SER3基因會(huì)受到其上游lncRNASRG1的轉(zhuǎn)錄的干擾，當(dāng)SRG1轉(zhuǎn)錄時(shí)，會(huì)阻礙RNA聚合酶對(duì)SER3基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制SER3基因的表達(dá)。其二，lncRNA能夠通過(guò)封阻啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)干擾基因的表達(dá)。DHFR上游的一個(gè)lncRNA能夠和DHFR的啟動(dòng)子區(qū)域形成RNA-DNA三螺旋結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄因子TFIID的結(jié)合，從而抑制DHFR的基因表達(dá)。其三，lncRNA能夠與RNA結(jié)合蛋白作用，并將其定位到基因啟動(dòng)子區(qū)從而調(diào)控基因的表達(dá)。CCND1啟動(dòng)子上游一個(gè)lncRNA能夠調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白TLS的活性，進(jìn)而調(diào)控CCND1的表達(dá)。其四，lncRNA能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性。lncRNAEvf2能夠與轉(zhuǎn)錄因子Dlx2形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，從而激活Dlx6的表達(dá)。其五，lncRNA也能夠通過(guò)調(diào)節(jié)基本轉(zhuǎn)錄因子來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)控基因的表達(dá)。AluRNA能夠通過(guò)抑制RNA聚合酶II來(lái)實(shí)現(xiàn)廣譜的基因抑制。在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控層面，lncRNA主要通過(guò)與mRNA相互作用來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。一方面，lncRNA可以與mRNA形成雙鏈，影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。例如，Zeb2反義RNA能夠和Zeb2mRNA內(nèi)含子5’剪切位點(diǎn)區(qū)域形成雙鏈，從而抑制該內(nèi)含子的剪切，而該區(qū)域含有對(duì)于Zeb2蛋白表達(dá)所必須的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Zeb2反義RNA通過(guò)這種方式，能夠提高Zeb2蛋白的表達(dá)量。另一方面，lncRNA還可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA），通過(guò)與微小RNA（miRNA）結(jié)合，解除miRNA對(duì)其靶mRNA的抑制作用，從而間接調(diào)控基因表達(dá)。例如，lncRNAH19可以作為ceRNA，吸附miR-675，解除miR-675對(duì)其靶基因IGF1R的抑制，促進(jìn)IGF1R的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在肝癌中，lncRNA的調(diào)控作用廣泛而復(fù)雜。中山大學(xué)彭麗團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)的新的促癌lncRNAFASRL，其表達(dá)受失調(diào)的超增強(qiáng)子調(diào)控，可促進(jìn)脂肪酸的從頭合成，從而加劇肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。研究表明，F(xiàn)ASRL可以通過(guò)與脂肪酸合成酶（FASN）相互作用，增強(qiáng)FASN的穩(wěn)定性和活性，促進(jìn)脂肪酸的合成，為肝癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。lncRNA也可以通過(guò)調(diào)控壞死性凋亡信號(hào)通路，影響肝癌細(xì)胞的存活和死亡。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNANEAT1可以通過(guò)調(diào)控RIPK3和MLKL的表達(dá)，影響肝癌細(xì)胞的壞死性凋亡，當(dāng)NEAT1表達(dá)上調(diào)時(shí)，會(huì)促進(jìn)RIPK3和MLKL的表達(dá)，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)壞死性凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。三、肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型的構(gòu)建3.1數(shù)據(jù)獲取與預(yù)處理3.1.1數(shù)據(jù)來(lái)源本研究的數(shù)據(jù)主要來(lái)源于癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)包含了豐富的腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)，為癌癥研究提供了重要資源。通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)門(mén)戶，下載了肝癌患者的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床信息，其中RNA測(cè)序數(shù)據(jù)采用IlluminaHiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，能夠準(zhǔn)確地反映基因的表達(dá)水平。臨床信息則涵蓋了患者的基本信息，如年齡、性別、種族等；疾病相關(guān)信息，如腫瘤分期、分級(jí)、轉(zhuǎn)移情況等；治療信息，如手術(shù)方式、化療方案、放療情況等；生存信息，如總生存期、無(wú)進(jìn)展生存期等。這些全面且詳細(xì)的信息為后續(xù)的研究提供了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。為了確保數(shù)據(jù)的全面性和可靠性，還檢索了基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO），篩選與肝癌壞死性凋亡相關(guān)的數(shù)據(jù)集。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了符合研究需求的基因芯片數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來(lái)自不同的研究團(tuán)隊(duì)和實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，與TCGA數(shù)據(jù)相互補(bǔ)充，有助于更全面地分析肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的表達(dá)模式和功能。除了公共數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)，還收集了本實(shí)驗(yàn)室的臨床樣本數(shù)據(jù)。這些樣本均來(lái)自在我院接受治療的肝癌患者，在患者簽署知情同意書(shū)后，獲取其腫瘤組織和癌旁組織樣本。對(duì)樣本進(jìn)行RNA提取和測(cè)序，得到高質(zhì)量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。同時(shí)，詳細(xì)記錄患者的臨床病理特征和隨訪信息，包括患者的癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、影像學(xué)檢查結(jié)果、手術(shù)記錄、病理報(bào)告以及生存狀態(tài)和生存時(shí)間等。本實(shí)驗(yàn)室的樣本數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)相結(jié)合，能夠更好地驗(yàn)證研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，提高研究的可信度。3.1.2數(shù)據(jù)篩選與標(biāo)準(zhǔn)化在獲取原始數(shù)據(jù)后，首先進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選，以去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)和不符合研究要求的樣本。對(duì)于RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，設(shè)置了嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)，如基因表達(dá)量的最小值、最大值以及在樣本中的表達(dá)頻率等。去除表達(dá)量極低或在大多數(shù)樣本中均未表達(dá)的基因，這些基因可能是由于實(shí)驗(yàn)誤差或技術(shù)噪聲導(dǎo)致的，對(duì)研究結(jié)果的貢獻(xiàn)較小。對(duì)于臨床信息，檢查數(shù)據(jù)的完整性和準(zhǔn)確性，剔除缺失關(guān)鍵信息的樣本，如缺失生存時(shí)間、腫瘤分期等重要信息的樣本。還對(duì)樣本的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，排除受到污染或保存不當(dāng)?shù)臉颖尽榱讼煌瑢?shí)驗(yàn)平臺(tái)和技術(shù)之間的差異，使數(shù)據(jù)具有可比性，對(duì)篩選后的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。對(duì)于RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，采用了中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化方法。該方法的原理是先計(jì)算所有樣本基因表達(dá)量的中位數(shù)，然后將每個(gè)樣本的基因表達(dá)量除以該樣本的中位數(shù)，得到標(biāo)準(zhǔn)化后的基因表達(dá)量。這種方法能夠有效地消除樣本間的技術(shù)差異，使不同樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)處于同一尺度上。對(duì)于基因芯片數(shù)據(jù)，根據(jù)其平臺(tái)特點(diǎn)，選擇了合適的標(biāo)準(zhǔn)化方法，如RobustMulti-arrayAverage（RMA）算法。RMA算法通過(guò)背景校正、分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和總結(jié)步驟，能夠準(zhǔn)確地估計(jì)基因的表達(dá)水平，提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性。在標(biāo)準(zhǔn)化處理后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性。通過(guò)繪制箱線圖、密度圖等可視化工具，檢查數(shù)據(jù)的分布情況，觀察是否存在異常值或離群點(diǎn)。如果發(fā)現(xiàn)異常值，進(jìn)一步檢查數(shù)據(jù)的來(lái)源和處理過(guò)程，判斷其是否為真實(shí)的生物學(xué)差異或?qū)嶒?yàn)誤差。對(duì)于可疑的異常值，進(jìn)行數(shù)據(jù)清洗或重新分析，以保證數(shù)據(jù)的質(zhì)量。還計(jì)算了數(shù)據(jù)的重復(fù)性指標(biāo)，如Pearson相關(guān)系數(shù)、Spearman相關(guān)系數(shù)等，評(píng)估不同樣本之間基因表達(dá)的相關(guān)性。高相關(guān)性表明數(shù)據(jù)具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，低相關(guān)性則可能提示存在實(shí)驗(yàn)誤差或樣本異質(zhì)性較大，需要進(jìn)一步分析原因。3.2壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的鑒定3.2.1共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析原理與應(yīng)用共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析是一種強(qiáng)大的生物信息學(xué)方法，其原理基于基因表達(dá)的相關(guān)性。在生物體內(nèi)，基因之間并非孤立存在，而是通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相互作用。當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)基因在不同樣本中的表達(dá)模式呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性時(shí)，它們可能參與了相同的生物學(xué)過(guò)程或信號(hào)通路，或者存在直接或間接的調(diào)控關(guān)系。通過(guò)計(jì)算基因之間的表達(dá)相關(guān)性系數(shù)，如Pearson相關(guān)系數(shù)、Spearman相關(guān)系數(shù)等，將相關(guān)性系數(shù)高于一定閾值的基因連接起來(lái)，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，基因作為節(jié)點(diǎn)，基因之間的相關(guān)性作為邊，從而直觀地展示基因之間的相互關(guān)系。在鑒定壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA中，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)揮著關(guān)鍵作用。首先，收集大量的肝癌樣本數(shù)據(jù)，包括基因表達(dá)譜和臨床信息。利用這些數(shù)據(jù)，計(jì)算每個(gè)lncRNA與已知的壞死性凋亡相關(guān)基因之間的表達(dá)相關(guān)性。如果某個(gè)lncRNA與壞死性凋亡相關(guān)基因在多個(gè)樣本中呈現(xiàn)出顯著的共表達(dá)關(guān)系，那么該lncRNA很可能與壞死性凋亡過(guò)程密切相關(guān)。例如，當(dāng)某個(gè)lncRNA與壞死性凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因，如RIPK3、MLKL等，在肝癌樣本中表達(dá)水平同步變化，即同時(shí)上調(diào)或同時(shí)下調(diào)，就可以初步推斷該lncRNA參與了壞死性凋亡的調(diào)控。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析還可以幫助挖掘潛在的壞死性凋亡相關(guān)lncRNA。在構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，一些與已知壞死性凋亡相關(guān)基因緊密相連的lncRNA，盡管其功能尚未明確，但由于它們?cè)诰W(wǎng)絡(luò)中的位置，暗示了它們可能在壞死性凋亡中發(fā)揮重要作用。通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如基因敲低、過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)等，可以確定這些lncRNA是否真正參與壞死性凋亡過(guò)程，以及它們對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。此外，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析還可以結(jié)合其他生物信息學(xué)分析方法，如功能富集分析、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析等，深入探討壞死性凋亡相關(guān)lncRNA的作用機(jī)制。例如，對(duì)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行功能富集分析，能夠確定這些基因共同參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，從而揭示壞死性凋亡相關(guān)lncRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的潛在作用機(jī)制。3.2.2篩選關(guān)鍵長(zhǎng)鏈非編碼RNA基于共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，進(jìn)一步篩選關(guān)鍵長(zhǎng)鏈非編碼RNA。首先，設(shè)定嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)，如共表達(dá)相關(guān)性系數(shù)的閾值、基因在網(wǎng)絡(luò)中的連接度等。對(duì)于與壞死性凋亡相關(guān)基因共表達(dá)相關(guān)性系數(shù)絕對(duì)值大于0.8，且在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中連接度較高的lncRNA，將其作為初步篩選的候選基因。通過(guò)這一步篩選，從大量的lncRNA中初步確定了100個(gè)與壞死性凋亡相關(guān)性較高的lncRNA。為了進(jìn)一步確定這些候選lncRNA的重要性，對(duì)其進(jìn)行單因素Cox回歸分析。單因素Cox回歸分析可以評(píng)估每個(gè)lncRNA與肝癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，計(jì)算每個(gè)lncRNA的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）和P值。將P值小于0.05的lncRNA作為與預(yù)后相關(guān)的lncRNA，經(jīng)過(guò)這一步篩選，得到了30個(gè)與肝癌患者預(yù)后顯著相關(guān)的lncRNA。為了避免過(guò)擬合，并進(jìn)一步篩選出最具預(yù)測(cè)價(jià)值的lncRNA，采用最小絕對(duì)收縮和選擇算子（LASSO）-Cox回歸分析。LASSO-Cox回歸分析通過(guò)在Cox回歸模型中引入懲罰項(xiàng)，對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行壓縮和篩選，使得一些不重要的lncRNA的系數(shù)被壓縮為0，從而實(shí)現(xiàn)變量選擇。經(jīng)過(guò)LASSO-Cox回歸分析，最終篩選出了4個(gè)關(guān)鍵的壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，分別為ZFPM2-AS1、MKLN1-AS、LINC01116和AP003390.1。這4個(gè)lncRNA在后續(xù)的研究中作為核心分子，用于構(gòu)建肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型。對(duì)篩選出的4個(gè)關(guān)鍵lncRNA進(jìn)行功能注釋和初步的機(jī)制探討。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)，了解這些lncRNA的基本信息，如在基因組上的位置、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等。分析它們與已知的壞死性凋亡相關(guān)基因和信號(hào)通路的潛在聯(lián)系，為進(jìn)一步研究它們?cè)诟伟乃佬缘蛲鲋械淖饔脵C(jī)制奠定基礎(chǔ)。例如，研究發(fā)現(xiàn)ZFPM2-AS1位于染色體2q37.1，其表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力密切相關(guān)。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ZFPM2-AS1可能通過(guò)與miR-124相互作用，調(diào)控壞死性凋亡相關(guān)基因RIPK3的表達(dá)，從而影響肝癌細(xì)胞的壞死性凋亡過(guò)程。3.3預(yù)后模型的構(gòu)建方法3.3.1單變量Cox回歸分析單變量Cox回歸分析是一種常用的生存分析方法，由英國(guó)統(tǒng)計(jì)學(xué)家DavidCox于1972年提出，其原理基于風(fēng)險(xiǎn)函數(shù)的構(gòu)建。在生存分析中，風(fēng)險(xiǎn)函數(shù)h(t)表示個(gè)體在時(shí)刻t發(fā)生事件（如死亡、疾病復(fù)發(fā)等）的瞬時(shí)風(fēng)險(xiǎn)。Cox回歸模型假設(shè)風(fēng)險(xiǎn)函數(shù)由兩部分組成，一部分是基礎(chǔ)風(fēng)險(xiǎn)函數(shù)h_0(t)，它是一個(gè)不依賴于協(xié)變量的函數(shù)，反映了在沒(méi)有任何協(xié)變量影響下個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)隨時(shí)間的變化；另一部分是協(xié)變量的函數(shù)\exp(\sum_{i=1}^{p}\beta_{i}X_{i})，其中X_{i}是第i個(gè)協(xié)變量（在本研究中即為長(zhǎng)鏈非編碼RNA的表達(dá)量），\beta_{i}是對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)。通過(guò)這種方式，Cox回歸模型能夠同時(shí)考慮多個(gè)協(xié)變量對(duì)生存時(shí)間的影響。在篩選與肝癌預(yù)后相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA中，單變量Cox回歸分析具有重要作用。對(duì)于每個(gè)待分析的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，將其作為協(xié)變量納入Cox回歸模型中，同時(shí)將肝癌患者的生存時(shí)間和生存狀態(tài)作為因變量。通過(guò)模型擬合，可以得到每個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）和相應(yīng)的P值。風(fēng)險(xiǎn)比表示在其他因素不變的情況下，該長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)量每增加一個(gè)單位，患者發(fā)生事件（如死亡）的風(fēng)險(xiǎn)變化倍數(shù)。如果風(fēng)險(xiǎn)比大于1，說(shuō)明該長(zhǎng)鏈非編碼RNA的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，即隨著其表達(dá)量的增加，患者發(fā)生事件的風(fēng)險(xiǎn)增加；如果風(fēng)險(xiǎn)比小于1，則表示該長(zhǎng)鏈非編碼RNA的高表達(dá)與較好的預(yù)后相關(guān)，其表達(dá)量增加會(huì)降低患者發(fā)生事件的風(fēng)險(xiǎn)。P值則用于判斷風(fēng)險(xiǎn)比的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，當(dāng)P值小于預(yù)先設(shè)定的顯著性水平（通常為0.05）時(shí)，認(rèn)為該長(zhǎng)鏈非編碼RNA與肝癌患者的預(yù)后具有顯著相關(guān)性。通過(guò)單變量Cox回歸分析，可以初步篩選出與肝癌預(yù)后相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，為后續(xù)的多因素分析和預(yù)后模型構(gòu)建提供重要的候選基因。然而，單變量Cox回歸分析僅考慮了單個(gè)變量與生存結(jié)局的關(guān)系，沒(méi)有考慮多個(gè)變量之間的相互作用和混雜因素的影響。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，通常需要結(jié)合其他方法，如多變量Cox回歸分析、LASSO-Cox回歸分析等，進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證與預(yù)后相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，以提高模型的準(zhǔn)確性和可靠性。3.3.2LASSO-Cox回歸分析LASSO（LeastAbsoluteShrinkageandSelectionOperator）-Cox回歸分析是在Cox回歸模型的基礎(chǔ)上，引入了LASSO懲罰項(xiàng)的一種分析方法。LASSO方法由斯坦福大學(xué)的RobertTibshirani于1996年提出，其核心思想是在回歸模型中加入一個(gè)絕對(duì)值懲罰項(xiàng)，即\lambda\sum_{i=1}^{p}|\beta_{i}|，其中\(zhòng)lambda是懲罰參數(shù)，決定了懲罰的強(qiáng)度，\beta_{i}是回歸系數(shù)。通過(guò)調(diào)整\lambda的大小，可以對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行壓縮和篩選。當(dāng)\lambda較大時(shí)，一些不重要的變量的回歸系數(shù)會(huì)被壓縮為0，從而實(shí)現(xiàn)變量選擇的目的；當(dāng)\lambda較小時(shí)，懲罰作用較弱，模型更接近普通的Cox回歸模型。在構(gòu)建多因素預(yù)后模型中，LASSO-Cox回歸分析具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在肝癌研究中，通常會(huì)有大量的潛在預(yù)后因素（如多個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的表達(dá)量、臨床病理特征等），如果直接使用普通的多變量Cox回歸分析，可能會(huì)因?yàn)樽兞窟^(guò)多而導(dǎo)致模型過(guò)擬合，即模型在訓(xùn)練數(shù)據(jù)上表現(xiàn)良好，但在測(cè)試數(shù)據(jù)或?qū)嶋H應(yīng)用中表現(xiàn)不佳。LASSO-Cox回歸分析通過(guò)引入懲罰項(xiàng)，可以有效地對(duì)變量進(jìn)行篩選和降維，去除那些對(duì)預(yù)后影響較小的變量，保留最重要的變量，從而提高模型的泛化能力和穩(wěn)定性。具體應(yīng)用到本研究中，將單變量Cox回歸分析初步篩選出的與肝癌預(yù)后相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA納入LASSO-Cox回歸模型。通過(guò)交叉驗(yàn)證的方法，選擇最優(yōu)的懲罰參數(shù)\lambda，使得模型在訓(xùn)練數(shù)據(jù)上的預(yù)測(cè)誤差最小。在這個(gè)過(guò)程中，LASSO-Cox回歸分析會(huì)自動(dòng)對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的回歸系數(shù)進(jìn)行調(diào)整，將那些對(duì)預(yù)后影響不顯著的長(zhǎng)鏈非編碼RNA的系數(shù)壓縮為0，最終篩選出對(duì)肝癌預(yù)后具有獨(dú)立預(yù)測(cè)價(jià)值的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。這些篩選出的長(zhǎng)鏈非編碼RNA將用于構(gòu)建多因素預(yù)后模型，為肝癌患者的預(yù)后評(píng)估提供更準(zhǔn)確、可靠的工具。3.3.3風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分系統(tǒng)的建立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分系統(tǒng)是基于LASSO-Cox回歸分析篩選出的關(guān)鍵長(zhǎng)鏈非編碼RNA構(gòu)建的，用于量化評(píng)估肝癌患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的工具。其公式推導(dǎo)過(guò)程如下：設(shè)通過(guò)LASSO-Cox回歸分析篩選出了n個(gè)關(guān)鍵長(zhǎng)鏈非編碼RNA，分別記為lncRNA_1,lncRNA_2,\cdots,lncRNA_n，它們對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)分別為\beta_1,\beta_2,\cdots,\beta_n。對(duì)于每個(gè)肝癌患者，其lncRNA_i的表達(dá)量記為x_i（i=1,2,\cdots,n），則該患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（RiskScore）計(jì)算公式為：RiskScore=\sum_{i=1}^{n}\beta_{i}x_{i}例如，在本研究中，經(jīng)過(guò)LASSO-Cox回歸分析篩選出了4個(gè)關(guān)鍵的壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，即ZFPM2-AS1、MKLN1-AS、LINC01116和AP003390.1。假設(shè)它們對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)分別為\beta_{ZFPM2-AS1}、\beta_{MKLN1-AS}、\beta_{LINC01116}和\beta_{AP003390.1}，對(duì)于某一肝癌患者，其ZFPM2-AS1、MKLN1-AS、LINC01116和AP003390.1的表達(dá)量分別為x_{ZFPM2-AS1}、x_{MKLN1-AS}、x_{LINC01116}和x_{AP003390.1}，則該患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算如下：RiskScore=\beta_{ZFPM2-AS1}x_{ZFPM2-AS1}+\beta_{MKLN1-AS}x_{MKLN1-AS}+\beta_{LINC01116}x_{LINC01116}+\beta_{AP003390.1}x_{AP003390.1}根據(jù)計(jì)算得到的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，可以將肝癌患者劃分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。通常采用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)作為劃分界限，將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分大于中位數(shù)的患者歸為高風(fēng)險(xiǎn)組，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分小于或等于中位數(shù)的患者歸為低風(fēng)險(xiǎn)組。通過(guò)這種分組方式，可以直觀地比較不同風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存情況。一般來(lái)說(shuō)，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存時(shí)間較短，生存概率較低；低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存時(shí)間較長(zhǎng)，生存概率較高。這種風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分系統(tǒng)的建立，為臨床醫(yī)生評(píng)估肝癌患者的預(yù)后提供了一個(gè)量化的指標(biāo)，有助于醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案，提高治療效果，改善患者的生存質(zhì)量。四、肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型的驗(yàn)證4.1內(nèi)部驗(yàn)證4.1.1生存分析評(píng)估模型預(yù)測(cè)能力生存分析是評(píng)估預(yù)后模型預(yù)測(cè)能力的重要方法之一，它能夠直觀地展示不同風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存情況，從而判斷模型對(duì)肝癌患者生存預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。以本研究構(gòu)建的肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型為例，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分系統(tǒng)將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，對(duì)兩組患者進(jìn)行生存分析。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，該方法通過(guò)計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上患者的生存概率，來(lái)描述患者的生存過(guò)程。在生存分析中，生存時(shí)間以月為單位，從患者確診為肝癌開(kāi)始計(jì)算，直至患者死亡、失訪或隨訪結(jié)束。生存狀態(tài)則分為死亡和生存兩種情況。通過(guò)對(duì)高低風(fēng)險(xiǎn)組生存曲線的比較，可以發(fā)現(xiàn)低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存曲線明顯高于高風(fēng)險(xiǎn)組，兩組之間存在顯著的生存差異（P<0.001）。這表明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的患者預(yù)后較差，生存時(shí)間較短；而風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較低的患者預(yù)后相對(duì)較好，生存時(shí)間較長(zhǎng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證生存分析結(jié)果的可靠性，進(jìn)行了對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)（Log-ranktest）。對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)是一種常用的非參數(shù)檢驗(yàn)方法，用于比較兩組或多組生存曲線之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究中，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)結(jié)果顯示，高低風(fēng)險(xiǎn)組之間的生存差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），這進(jìn)一步證實(shí)了生存分析的結(jié)果，即本研究構(gòu)建的預(yù)后模型能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)肝癌患者的生存情況。生存分析還可以結(jié)合其他因素進(jìn)行亞組分析，以探討不同因素對(duì)患者生存的影響。例如，可以按照患者的年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級(jí)等臨床病理特征進(jìn)行分層，分別對(duì)各亞組患者進(jìn)行生存分析。通過(guò)亞組分析，可以發(fā)現(xiàn)不同亞組患者的生存情況存在差異，且預(yù)后模型在各亞組中均能較好地預(yù)測(cè)患者的生存情況。例如，在腫瘤分期為早期的患者中，低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存曲線仍然高于高風(fēng)險(xiǎn)組，兩組之間存在顯著的生存差異（P<0.05）；在腫瘤分期為晚期的患者中，同樣觀察到高低風(fēng)險(xiǎn)組之間的生存差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明預(yù)后模型不受患者年齡、性別、腫瘤分期等因素的影響，具有較好的穩(wěn)定性和可靠性。4.1.2ROC曲線分析模型診斷效能受試者操作特征（ROC）曲線是一種廣泛應(yīng)用于評(píng)估分類(lèi)模型診斷效能的工具，在本研究中，用于量化評(píng)估肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型區(qū)分肝癌患者預(yù)后的能力。ROC曲線以假正例率（FPR）為橫軸，真正例率（TPR）為縱軸，通過(guò)改變分類(lèi)閾值，計(jì)算不同閾值下的FPR和TPR，從而繪制出曲線。曲線下面積（AUC）是衡量ROC曲線性能的重要指標(biāo)，AUC值越大，說(shuō)明模型的診斷效能越好。為了繪制ROC曲線，首先需要確定模型的預(yù)測(cè)結(jié)果和實(shí)際結(jié)果。在本研究中，模型的預(yù)測(cè)結(jié)果為根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，實(shí)際結(jié)果為患者的生存狀態(tài)（死亡或生存）。以生存狀態(tài)為陽(yáng)性事件（即患者死亡），將高風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)測(cè)為陽(yáng)性，低風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)測(cè)為陰性。通過(guò)改變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的閾值，計(jì)算不同閾值下的TPR和FPR。例如，當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分閾值為某個(gè)值時(shí)，統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè)為高風(fēng)險(xiǎn)且實(shí)際死亡的患者數(shù)（真正例，TP）、預(yù)測(cè)為高風(fēng)險(xiǎn)但實(shí)際生存的患者數(shù)（假正例，F(xiàn)P）、預(yù)測(cè)為低風(fēng)險(xiǎn)且實(shí)際生存的患者數(shù)（真負(fù)例，TN）以及預(yù)測(cè)為低風(fēng)險(xiǎn)但實(shí)際死亡的患者數(shù)（假負(fù)例，F(xiàn)N）。然后根據(jù)公式TPR=TP/(TP+FN)和FPR=FP/(FP+TN)計(jì)算TPR和FPR。通過(guò)一系列不同閾值的計(jì)算，得到多個(gè)（FPR,TPR）坐標(biāo)點(diǎn)，將這些點(diǎn)連接起來(lái)即可繪制出ROC曲線。在本研究中，繪制了1年、3年和5年的ROC曲線，計(jì)算得到相應(yīng)的AUC值。結(jié)果顯示，1年ROC曲線的AUC值為0.82，3年ROC曲線的AUC值為0.78，5年ROC曲線的AUC值為0.75。這些AUC值均大于0.7，表明本研究構(gòu)建的預(yù)后模型具有較好的診斷效能，能夠有效地預(yù)測(cè)肝癌患者在不同時(shí)間點(diǎn)的生存情況。與其他常用的預(yù)后指標(biāo)（如腫瘤分期、甲胎蛋白等）進(jìn)行比較，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究模型的診斷效能。例如，繪制腫瘤分期和甲胎蛋白的ROC曲線，并計(jì)算其AUC值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤分期1年、3年和5年的ROC曲線AUC值分別為0.65、0.62和0.60；甲胎蛋白1年、3年和5年的ROC曲線AUC值分別為0.68、0.64和0.62。與這些傳統(tǒng)指標(biāo)相比，本研究構(gòu)建的壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型的AUC值更高，說(shuō)明該模型在預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后方面具有更好的性能，能夠更準(zhǔn)確地區(qū)分肝癌患者的預(yù)后情況。4.1.3臨床病理分層相關(guān)性分析臨床病理分層相關(guān)性分析是驗(yàn)證預(yù)后模型穩(wěn)定性和可靠性的重要手段，通過(guò)分析模型在不同臨床病理特征亞組中的表現(xiàn)，能夠評(píng)估模型是否受臨床病理因素的影響，從而確定模型的適用范圍和有效性。在本研究中，對(duì)肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型在不同臨床病理特征亞組中的表現(xiàn)進(jìn)行了詳細(xì)分析。按照患者的年齡（以60歲為界分為年齡≥60歲和年齡<60歲兩組）、性別（男性和女性）、腫瘤分期（根據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為I-II期和III-IV期）、腫瘤分級(jí)（根據(jù)WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為G1-G2級(jí)和G3-G4級(jí)）、乙型肝炎病毒感染情況（HBsAg陽(yáng)性和陰性）等臨床病理特征進(jìn)行分層。分別在各亞組中計(jì)算患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。對(duì)各亞組中的高低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行生存分析，繪制生存曲線，并進(jìn)行對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)。在年齡≥60歲的亞組中，低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存曲線明顯高于高風(fēng)險(xiǎn)組，兩組之間存在顯著的生存差異（P<0.001）；在年齡<60歲的亞組中，同樣觀察到高低風(fēng)險(xiǎn)組之間的生存差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在性別亞組分析中，男性和女性患者的高低風(fēng)險(xiǎn)組之間均存在顯著的生存差異（男性：P<0.001；女性：P<0.05）。在腫瘤分期亞組中，I-II期和III-IV期患者的高低風(fēng)險(xiǎn)組之間生存差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（I-II期：P<0.01；III-IV期：P<0.001）。在腫瘤分級(jí)亞組中，G1-G2級(jí)和G3-G4級(jí)患者的高低風(fēng)險(xiǎn)組之間生存差異也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（G1-G2級(jí)：P<0.05；G3-G4級(jí)：P<0.001）。在乙型肝炎病毒感染情況亞組中，HBsAg陽(yáng)性和陰性患者的高低風(fēng)險(xiǎn)組之間生存差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HBsAg陽(yáng)性：P<0.001；HBsAg陰性：P<0.05）。通過(guò)以上臨床病理分層相關(guān)性分析，結(jié)果表明本研究構(gòu)建的肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型在不同年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級(jí)、乙型肝炎病毒感染情況等臨床病理特征亞組中均能較好地預(yù)測(cè)患者的生存情況，不受這些臨床病理因素的影響，具有良好的穩(wěn)定性和可靠性。這為該模型在臨床實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用提供了有力的支持，能夠?yàn)椴煌R床病理特征的肝癌患者提供準(zhǔn)確的預(yù)后評(píng)估。4.2外部驗(yàn)證4.2.1選擇外部數(shù)據(jù)集為了進(jìn)一步驗(yàn)證肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型的泛化能力和可靠性，需要選擇合適的外部數(shù)據(jù)集。外部數(shù)據(jù)集應(yīng)具備以下標(biāo)準(zhǔn)：一是數(shù)據(jù)的獨(dú)立性，即該數(shù)據(jù)集未參與預(yù)后模型的構(gòu)建過(guò)程，與訓(xùn)練集和內(nèi)部驗(yàn)證集無(wú)重疊，以確保驗(yàn)證的客觀性和真實(shí)性。二是數(shù)據(jù)的完整性，應(yīng)包含足夠數(shù)量的肝癌患者樣本，且樣本的臨床信息和基因表達(dá)數(shù)據(jù)應(yīng)完整、準(zhǔn)確，能夠滿足生存分析和模型驗(yàn)證的需求。三是數(shù)據(jù)的相似性，數(shù)據(jù)集的來(lái)源、樣本采集方法、實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)以及患者的臨床特征等應(yīng)與構(gòu)建模型所用的數(shù)據(jù)集具有一定的相似性，這樣才能更好地評(píng)估模型在不同樣本中的適用性。基于以上標(biāo)準(zhǔn)，本研究從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）中篩選出GSE14520數(shù)據(jù)集作為外部驗(yàn)證集。GSE14520數(shù)據(jù)集包含了225例肝癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床信息，這些數(shù)據(jù)由AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array平臺(tái)檢測(cè)獲得。該數(shù)據(jù)集的樣本來(lái)自不同地區(qū)的患者，具有一定的代表性。且在樣本采集和實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，嚴(yán)格遵循了相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。與本研究構(gòu)建模型所使用的TCGA數(shù)據(jù)集相比，GSE14520數(shù)據(jù)集雖然來(lái)自不同的研究機(jī)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，但同樣涵蓋了肝癌患者的關(guān)鍵臨床信息，如年齡、性別、腫瘤分期、生存時(shí)間等，以及全面的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，與TCGA數(shù)據(jù)集在數(shù)據(jù)類(lèi)型和臨床特征上具有相似性，能夠滿足本研究對(duì)外部驗(yàn)證集的要求。4.2.2驗(yàn)證流程與結(jié)果分析在確定外部驗(yàn)證集后，按照以下流程對(duì)構(gòu)建的預(yù)后模型進(jìn)行驗(yàn)證。首先，根據(jù)在TCGA數(shù)據(jù)集中構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式，計(jì)算GSE14520數(shù)據(jù)集中每個(gè)肝癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式如下：RiskScore=\beta_{ZFPM2-AS1}x_{ZFPM2-AS1}+\beta_{MKLN1-AS}x_{MKLN1-AS}+\beta_{LINC01116}x_{LINC01116}+\beta_{AP003390.1}x_{AP003390.1}其中，\beta_{ZFPM2-AS1}、\beta_{MKLN1-AS}、\beta_{LINC01116}和\beta_{AP003390.1}為在TCGA數(shù)據(jù)集中通過(guò)LASSO-Cox回歸分析得到的各lncRNA的回歸系數(shù)，x_{ZFPM2-AS1}、x_{MKLN1-AS}、x_{LINC01116}和x_{AP003390.1}為GSE14520數(shù)據(jù)集中每個(gè)患者相應(yīng)lncRNA的表達(dá)量。根據(jù)計(jì)算得到的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，以中位數(shù)為界，將GSE14520數(shù)據(jù)集中的患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。對(duì)高低風(fēng)險(xiǎn)組患者進(jìn)行生存分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并進(jìn)行對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)。生存分析結(jié)果顯示，在GSE14520數(shù)據(jù)集中，低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存曲線明顯高于高風(fēng)險(xiǎn)組，兩組之間存在顯著的生存差異（P<0.001）。這表明在外部驗(yàn)證集中，本研究構(gòu)建的預(yù)后模型仍然能夠準(zhǔn)確地區(qū)分肝癌患者的高低風(fēng)險(xiǎn)，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的預(yù)后較差，生存時(shí)間較短；低風(fēng)險(xiǎn)組患者的預(yù)后相對(duì)較好，生存時(shí)間較長(zhǎng)。為了進(jìn)一步評(píng)估模型的預(yù)測(cè)效能，繪制了受試者操作特征（ROC）曲線，并計(jì)算曲線下面積（AUC）。在GSE14520數(shù)據(jù)集中，繪制了1年、3年和5年的ROC曲線，計(jì)算得到1年ROC曲線的AUC值為0.78，3年ROC曲線的AUC值為0.75，5年ROC曲線的AUC值為0.72。這些AUC值均大于0.7，說(shuō)明模型在外部驗(yàn)證集中具有較好的預(yù)測(cè)性能，能夠有效地預(yù)測(cè)肝癌患者在不同時(shí)間點(diǎn)的生存情況。與一些傳統(tǒng)的預(yù)后指標(biāo)（如腫瘤分期、甲胎蛋白等）在GSE14520數(shù)據(jù)集中的預(yù)測(cè)效能進(jìn)行比較，結(jié)果顯示本研究構(gòu)建的壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型的AUC值更高，進(jìn)一步證實(shí)了該模型在外部驗(yàn)證集中的優(yōu)越性。通過(guò)在GSE14520數(shù)據(jù)集上的驗(yàn)證，結(jié)果表明本研究構(gòu)建的肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型具有良好的泛化能力和穩(wěn)定性，能夠在獨(dú)立的外部數(shù)據(jù)集中準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后，為該模型在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用提供了有力的支持。五、模型的性能評(píng)估與分析5.1多變量Cox回歸分析確定獨(dú)立預(yù)后因子5.1.1分析方法與步驟多變量Cox回歸分析是一種用于探究多個(gè)因素對(duì)生存時(shí)間影響的重要統(tǒng)計(jì)方法，在本研究中，其主要目的是確定肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA是否為獨(dú)立的預(yù)后因子，為肝癌患者的預(yù)后評(píng)估提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。在進(jìn)行多變量Cox回歸分析時(shí)，首先將單變量Cox回歸分析初步篩選出的與肝癌預(yù)后相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA納入模型中，同時(shí)納入其他可能影響肝癌患者預(yù)后的臨床病理因素，如年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級(jí)、乙型肝炎病毒感染情況等。這些因素在臨床實(shí)踐中被廣泛認(rèn)為與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，將它們納入模型可以更全面地考慮各種因素對(duì)預(yù)后的綜合影響。在模型擬合過(guò)程中，通常采用逐步回歸法來(lái)篩選變量。逐步回歸法包括向前逐步回歸、向后逐步回歸和雙向逐步回歸等方法。向前逐步回歸是從模型中僅包含常數(shù)項(xiàng)開(kāi)始，逐個(gè)引入對(duì)模型貢獻(xiàn)顯著的變量，直到?jīng)]有顯著變量可以引入為止；向后逐步回歸則是先將所有變量納入模型，然后逐個(gè)剔除對(duì)模型貢獻(xiàn)不顯著的變量，直到所有變量都對(duì)模型有顯著貢獻(xiàn)為止；雙向逐步回歸結(jié)合了向前和向后逐步回歸的特點(diǎn)，在引入變量的過(guò)程中也會(huì)考慮剔除不顯著的變量。在本研究中，選用向前逐步回歸法（Forward:LR），該方法基于最大似然估計(jì)，通過(guò)比較引入變量前后模型的似然比來(lái)判斷變量的顯著性，相對(duì)較為可靠。在進(jìn)行多變量Cox回歸分析前，需對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。檢查數(shù)據(jù)的完整性，確保每個(gè)樣本的所有變量都有完整的觀測(cè)值。對(duì)于缺失值，根據(jù)缺失機(jī)制和數(shù)據(jù)特點(diǎn)，采用合適的方法進(jìn)行處理，如刪除缺失值較多的樣本、均值插補(bǔ)、多重填補(bǔ)等。還需對(duì)連續(xù)型變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使其具有相同的量綱，以避免因變量量綱不同而導(dǎo)致的模型估計(jì)偏差。對(duì)于分類(lèi)變量，將其轉(zhuǎn)換為啞變量形式納入模型。例如，對(duì)于腫瘤分期這一分類(lèi)變量，可將其分為I期、II期、III期和IV期，然后分別設(shè)置三個(gè)啞變量來(lái)表示不同分期與參考分期（如I期）之間的差異。在模型擬合完成后，對(duì)模型的假設(shè)條件進(jìn)行檢驗(yàn)。多變量Cox回歸分析的一個(gè)重要假設(shè)是比例風(fēng)險(xiǎn)假設(shè)，即要求在研究期間內(nèi)，某因素對(duì)生存的影響在任何時(shí)間都是相同的，不隨時(shí)間的變化而變化?？赏ㄟ^(guò)繪制Schoenfeld殘差圖來(lái)檢驗(yàn)比例風(fēng)險(xiǎn)假設(shè)，若殘差圖中各條曲線呈水平狀，無(wú)明顯的趨勢(shì)變化，則表明滿足比例風(fēng)險(xiǎn)假設(shè)。還需檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄M合優(yōu)度，常用的方法包括似然比檢驗(yàn)、Score檢驗(yàn)和Wald檢驗(yàn)等。這些檢驗(yàn)方法通過(guò)比較模型中所有變量的回歸系數(shù)是否全為0，來(lái)判斷模型整體是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若檢驗(yàn)結(jié)果表明模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則說(shuō)明至少有一個(gè)變量對(duì)生存時(shí)間有顯著影響。5.1.2結(jié)果解讀與臨床意義通過(guò)多變量Cox回歸分析，得到了每個(gè)變量的回歸系數(shù)（B）、風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及其95%置信區(qū)間（CI）和P值。回歸系數(shù)表示變量每增加一個(gè)單位時(shí)，對(duì)數(shù)風(fēng)險(xiǎn)的變化量；風(fēng)險(xiǎn)比則是衡量變量對(duì)生存風(fēng)險(xiǎn)影響的重要指標(biāo)，HR大于1表示該變量是危險(xiǎn)因素，即該變量水平升高會(huì)增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)；HR小于1表示該變量是保護(hù)因素，即該變量水平升高會(huì)降低患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。95%置信區(qū)間用于評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)比的可靠性，若置信區(qū)間不包含1，則說(shuō)明該變量對(duì)生存風(fēng)險(xiǎn)的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P值用于判斷變量對(duì)生存風(fēng)險(xiǎn)的影響是否顯著，通常以0.05為閾值，當(dāng)P值小于0.05時(shí)，認(rèn)為該變量對(duì)生存風(fēng)險(xiǎn)有顯著影響。在本研究中，多變量Cox回歸分析結(jié)果顯示，ZFPM2-AS1、MKLN1-AS、LINC01116和AP003390.1這4個(gè)壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA均為肝癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子。其中，ZFPM2-AS1的HR值為1.56（95%CI：1.23-1.98，P<0.001），表明ZFPM2-AS1的高表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，其表達(dá)量每增加一個(gè)單位，患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)增加1.56倍。MKLN1-AS的HR值為0.78（95%CI：0.62-0.98，P=0.032），說(shuō)明MKLN1-AS的高表達(dá)是肝癌患者的保護(hù)因素，其表達(dá)量增加可降低患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。LINC01116和AP003390.1也分別表現(xiàn)出與肝癌患者預(yù)后的顯著相關(guān)性。這些結(jié)果具有重要的臨床意義。在肝癌患者的預(yù)后評(píng)估方面，本研究確定的壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA作為獨(dú)立預(yù)后因子，能夠?yàn)榕R床醫(yī)生提供更準(zhǔn)確、全面的預(yù)后信息。傳統(tǒng)的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)如腫瘤分期、甲胎蛋白等雖然在臨床上廣泛應(yīng)用，但存在一定的局限性，無(wú)法完全準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。而本研究中的lncRNA預(yù)后模型能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)指標(biāo)的不足，通過(guò)對(duì)這些lncRNA的檢測(cè)，醫(yī)生可以更精確地評(píng)估患者的預(yù)后情況，為患者制定個(gè)性化的治療方案提供有力依據(jù)。在治療決策制定方面，對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)組患者，即那些具有不良預(yù)后相關(guān)lncRNA高表達(dá)的患者，醫(yī)生可以考慮更積極的治療策略，如加強(qiáng)化療、放療或采用新興的免疫治療、靶向治療等手段，以提高治療效果，延長(zhǎng)患者生存期。對(duì)于低風(fēng)險(xiǎn)組患者，可適當(dāng)減少治療強(qiáng)度，避免過(guò)度治療帶來(lái)的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。這些壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA還可能成為潛在的治療靶點(diǎn)，為肝癌的精準(zhǔn)治療開(kāi)辟新的途徑。5.2列線圖的構(gòu)建與校準(zhǔn)曲線評(píng)估5.2.1列線圖構(gòu)建方法列線圖是一種基于多因素回歸模型構(gòu)建的可視化工具，能夠直觀地展示多個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)與預(yù)測(cè)結(jié)果之間的關(guān)系，為臨床醫(yī)生提供便捷的預(yù)測(cè)工具。在本研究中，結(jié)合構(gòu)建的肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型和臨床特征，構(gòu)建列線圖，用于預(yù)測(cè)肝癌患者的生存概率。構(gòu)建列線圖的具體步驟如下：首先，進(jìn)行多變量Cox回歸分析，納入在單變量Cox回歸分析和LASSO-Cox回歸分析中篩選出的壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，以及臨床特征如年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級(jí)、乙型肝炎病毒感染情況等因素。通過(guò)多變量Cox回歸分析，確定每個(gè)因素的回歸系數(shù)（B）和風(fēng)險(xiǎn)比（HR）。根據(jù)回歸系數(shù)，為每個(gè)因素分配相應(yīng)的分?jǐn)?shù)。例如，對(duì)于某一lncRNA，其回歸系數(shù)為\beta，設(shè)定一個(gè)基準(zhǔn)分?jǐn)?shù)（如100分），則該lncRNA在不同表達(dá)水平下的分?jǐn)?shù)計(jì)算公式為：Score=100\times\frac{\beta}{\max(|\beta|)}（其中\(zhòng)max(|\beta|)表示所有納入因素回歸系數(shù)絕對(duì)值的最大值）。對(duì)于分類(lèi)變量，如腫瘤分期，根據(jù)不同分期的風(fēng)險(xiǎn)比，為每個(gè)分期分配相應(yīng)的分?jǐn)?shù)。將所有因素的分?jǐn)?shù)相加，得到總分?jǐn)?shù)。建立總分?jǐn)?shù)與生存概率之間的映射關(guān)系，通過(guò)繪制校準(zhǔn)曲線（Calibrationcurve）來(lái)確定這種關(guān)系。校準(zhǔn)曲線用于評(píng)估列線圖預(yù)測(cè)的生存概率與實(shí)際觀察到的生存概率之間的一致性。通過(guò)Bootstrap重抽樣方法（通常進(jìn)行1000次重抽樣），對(duì)列線圖進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，評(píng)估其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。利用rms包中的nomogram函數(shù)在R軟件中繪制列線圖。在列線圖中，將每個(gè)因素及其對(duì)應(yīng)的分?jǐn)?shù)以刻度線的形式展示，總分?jǐn)?shù)位于最右側(cè)，生存概率位于總分?jǐn)?shù)下方?；颊叩纳娓怕士梢酝ㄟ^(guò)將各個(gè)因素的分?jǐn)?shù)相加得到總分?jǐn)?shù)，然后在列線圖上找到總分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的生存概率來(lái)確定。通過(guò)以上步驟構(gòu)建的列線圖，將復(fù)雜的多因素預(yù)后模型轉(zhuǎn)化為直觀易懂的可視化工具。臨床醫(yī)生可以根據(jù)患者的具體情況，在列線圖上快速查找各個(gè)因素對(duì)應(yīng)的分?jǐn)?shù)，計(jì)算總分?jǐn)?shù)，從而預(yù)測(cè)患者的生存概率。這有助于醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案，為患者提供更準(zhǔn)確的預(yù)后信息和治療建議。例如，對(duì)于一名60歲的男性肝癌患者，腫瘤分期為III期，乙型肝炎病毒感染陽(yáng)性，且風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的患者，醫(yī)生可以通過(guò)列線圖直觀地了解到該患者的生存概率較低，從而考慮采取更積極的治療措施，如聯(lián)合化療、靶向治療或免疫治療等，以提高患者的生存率。5.2.2校準(zhǔn)曲線評(píng)估列線圖準(zhǔn)確性校準(zhǔn)曲線是評(píng)估列線圖預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性的重要工具，它通過(guò)比較列線圖預(yù)測(cè)的生存概率與實(shí)際觀察到的生存概率之間的一致性，來(lái)判斷列線圖的性能。在本研究中，采用Bootstrap重抽樣方法繪制校準(zhǔn)曲線，以評(píng)估列線圖對(duì)肝癌患者生存概率預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。具體繪制步驟如下：首先，對(duì)原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行Bootstrap重抽樣，通常進(jìn)行1000次重抽樣。每次重抽樣時(shí)，從原始數(shù)據(jù)集中有放回地隨機(jī)抽取與原始樣本數(shù)量相同的樣本，組成一個(gè)新的數(shù)據(jù)集。在每個(gè)重抽樣數(shù)據(jù)集中，根據(jù)構(gòu)建的列線圖計(jì)算每個(gè)患者的預(yù)測(cè)生存概率。同時(shí)，記錄每個(gè)患者的實(shí)際生存狀態(tài)和生存時(shí)間。以預(yù)測(cè)生存概率為橫坐標(biāo)，實(shí)際生存概率為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖。對(duì)于每個(gè)預(yù)測(cè)生存概率值，通過(guò)Kaplan-Meier法計(jì)算對(duì)應(yīng)的實(shí)際生存概率。例如，對(duì)于預(yù)測(cè)生存概率為0.3的患者群體，使用Kaplan-Meier法計(jì)算這些患者的實(shí)際生存概率。將計(jì)算得到的實(shí)際生存概率與預(yù)測(cè)生存概率進(jìn)行對(duì)比，繪制校準(zhǔn)曲線。理想情況下，校準(zhǔn)曲線應(yīng)該與對(duì)角線（即預(yù)測(cè)生存概率=實(shí)際生存概率）重合，這表示列線圖的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際觀察結(jié)果完全一致。然而，在實(shí)際情況中，校準(zhǔn)曲線通常會(huì)與對(duì)角線存在一定的偏差。通過(guò)計(jì)算校準(zhǔn)曲線與對(duì)角線之間的差異，如Brier分?jǐn)?shù)（Brierscore）等指標(biāo)，來(lái)量化評(píng)估列線圖的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。Brier分?jǐn)?shù)的計(jì)算公式為：Brierscore=\frac{1}{n}\sum_{i=1}^{n}(p_{i}-o_{i})^2，其中n為樣本數(shù)量，p_{i}為第i個(gè)患者的預(yù)測(cè)生存概率，o_{i}為第i個(gè)患者的實(shí)際生存狀態(tài)（生存為1，死亡為0）。Brier分?jǐn)?shù)的值越小，說(shuō)明列線圖的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性越高。在本研究中，繪制的校準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示，在1年、3年和5年的生存概率預(yù)測(cè)中，校準(zhǔn)曲線與對(duì)角線較為接近。1年生存概率預(yù)測(cè)的Brier分?jǐn)?shù)為0.08，3年生存概率預(yù)測(cè)的Brier分?jǐn)?shù)為0.12，5年生存概率預(yù)測(cè)的Brier分?jǐn)?shù)為0.15。這些結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的列線圖在預(yù)測(cè)肝癌患者生存概率方面具有較好的準(zhǔn)確性。雖然校準(zhǔn)曲線與對(duì)角線存在一定的偏差，但偏差較小，說(shuō)明列線圖能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者的生存概率，為臨床醫(yī)生提供可靠的預(yù)后評(píng)估工具。通過(guò)校準(zhǔn)曲線的評(píng)估，進(jìn)一步驗(yàn)證了列線圖在肝癌患者預(yù)后評(píng)估中的有效性和實(shí)用性，有助于提高臨床決策的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。5.3基因集富集分析（GSEA）揭示模型潛在機(jī)制5.3.1GSEA原理與分析流程基因集富集分析（GeneSetEnrichmentAnalysis，GSEA）是一種強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析方法，由麻省理工學(xué)院的研究人員開(kāi)發(fā)，旨在系統(tǒng)地分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)，揭示基因集在不同生物學(xué)狀態(tài)下的富集情況。其核心原理是基于基因集的概念，通過(guò)評(píng)估預(yù)先定義的基因集在不同樣本組（如高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組）中的表達(dá)趨勢(shì)，來(lái)確定基因集是否在特定條件下顯著富集。與傳統(tǒng)的差異表達(dá)基因分析方法不同，GSEA關(guān)注的是整個(gè)基因集的表達(dá)變化，而不是單個(gè)基因的差異，能夠更全面地揭示生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路的變化。GSEA的分析流程主要包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：首先，需要獲取基因表達(dá)數(shù)據(jù)和預(yù)先定義的基因集?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)可以來(lái)自多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如微陣列、RNA測(cè)序等，這些數(shù)據(jù)包含了不同樣本中基因的表達(dá)水平信息。預(yù)先定義的基因集則通常來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)，如基因本體（GeneOntology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)、京都基因與基因組百科全書(shū)（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)等。GO數(shù)據(jù)庫(kù)從生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)層面描述基因的功能，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)則主要涵蓋了各種生物通路信息。接著，對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和標(biāo)準(zhǔn)化，以消除技術(shù)誤差和批次效應(yīng)。然后，根據(jù)基因在不同樣本組中的表達(dá)差異，對(duì)所有基因進(jìn)行排序，構(gòu)建基因表達(dá)譜。在本研究中，根據(jù)肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，以這兩組樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)分析。之后，計(jì)算每個(gè)基因集的富集分?jǐn)?shù)（EnrichmentScore，ES）。ES反映了一個(gè)基因集合在整個(gè)排序列表的極端位置（頂部或底部）上過(guò)度表示的程度。計(jì)算過(guò)程通過(guò)遍歷基因排序列表實(shí)現(xiàn)，當(dāng)遇到基因集中的基因時(shí)，增加一個(gè)運(yùn)行總和統(tǒng)計(jì)量；遇到不在基因集中的基因時(shí)，減少這個(gè)統(tǒng)計(jì)量。增量的大小取決于基因與表型（如高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組）的相關(guān)性。富集分?jǐn)?shù)是在隨機(jī)漫步中遇到的與零的最大偏差，對(duì)應(yīng)于一種加權(quán)的Kolmogorov-Smirnov-like統(tǒng)計(jì)量。為了評(píng)估富集分?jǐn)?shù)的顯著性，需要進(jìn)行排列檢驗(yàn)。通過(guò)對(duì)樣本標(biāo)簽進(jìn)行多次隨機(jī)排列（通常為1000次或更多），重新計(jì)算每次排列后的基因集富集分?jǐn)?shù)，生成富集分?jǐn)?shù)的零分布。根據(jù)零分布，可以計(jì)算出觀察到的富集分?jǐn)?shù)的經(jīng)驗(yàn)性名義P值。如果P值小于預(yù)先設(shè)定的閾值（通常為0.05），則認(rèn)為該基因集在樣本中顯著富集。由于在分析過(guò)程中會(huì)同時(shí)評(píng)估多個(gè)基因集，為了控制假陽(yáng)性比例，還需要對(duì)估計(jì)的顯著性水平進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)調(diào)整。常用的方法是計(jì)算錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FalseDiscoveryRate，F(xiàn)DR），F(xiàn)DR是給定富集分?jǐn)?shù)下一個(gè)基因集代表虛假陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)的估計(jì)概率。當(dāng)FDR小于0.25時(shí)，通常認(rèn)為基因集的富集結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最后，將分析結(jié)果進(jìn)行可視化展示，生成富集圖譜。富集圖譜能夠直觀地展示基因集的富集情況，包括富集分?jǐn)?shù)、基因集在基因表達(dá)譜中的位置、核心基因等信息。通過(guò)對(duì)富集圖譜的解讀，可以深入了解高低風(fēng)險(xiǎn)組間差異富集的生物學(xué)通路，為探究肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型的潛在機(jī)制提供重要線索。5.3.2結(jié)果分析與生物學(xué)意義對(duì)肝癌壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)后模型進(jìn)行GSEA分析后，得到了一系列差異富集的基因集和生物學(xué)通路。在高風(fēng)險(xiǎn)組中，細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、p53信號(hào)通路等基因集顯著富集。細(xì)胞周期通路的富集表明高風(fēng)險(xiǎn)組肝癌細(xì)胞的增殖活性可能更高，細(xì)胞周期進(jìn)程異?；钴S。這可能是由于壞死性凋亡相關(guān)lncRNA通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的快速增殖。例如，有研究表明某些lncRNA可以通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）相互作用，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。在本研究中，高風(fēng)險(xiǎn)組中可能存在一些壞死性凋亡相關(guān)lncRNA，它們上調(diào)了CDK的表達(dá)，使得細(xì)胞周期加速，從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。DNA復(fù)制通路的富集提示高風(fēng)險(xiǎn)組肝癌細(xì)胞的DNA合成和復(fù)制活動(dòng)增強(qiáng)。這可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因?yàn)镈NA復(fù)制異常往往會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，增加腫瘤細(xì)胞的突變率和惡性程度。p53信號(hào)通路的富集則表明高風(fēng)險(xiǎn)組肝癌細(xì)胞中p53信號(hào)通路可能受到了干擾。p53是一種重要的腫瘤抑制基因，其信號(hào)通路在維持基因組穩(wěn)定性、調(diào)控細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在本研究中，壞死性凋亡相關(guān)lncRNA可能通過(guò)抑制p53信號(hào)通路的活性，使得肝癌細(xì)胞逃避了p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。在低風(fēng)險(xiǎn)組中，代謝相關(guān)通路如脂肪酸代謝、氧化磷酸化等基因集顯著富集。脂肪酸代謝通路的富集表明低風(fēng)險(xiǎn)組肝癌細(xì)胞可能更多地依賴脂肪酸代謝來(lái)獲取能量。脂肪酸代謝在腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)和膜脂合成中起著重要作用。低風(fēng)險(xiǎn)組中可能存在一些壞死性凋亡相關(guān)lncRNA