演講人：日期:檢驗科甲型流感病毒檢測操作規(guī)范CATALOGUE目錄01樣本接收與預(yù)處理02檢測流程與方法03質(zhì)量控制體系04結(jié)果分析與報告05生物安全防護(hù)06設(shè)備維護(hù)與校準(zhǔn)01樣本接收與預(yù)處理樣本接收標(biāo)準(zhǔn)與登記接收樣本時需核對標(biāo)簽信息是否完整，包括患者姓名、唯一標(biāo)識號及樣本類型，確保無泄漏、破損或污染。不符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本需記錄并通知送檢部門重新采集。樣本完整性檢查使用實驗室信息管理系統(tǒng)（LIMS）詳細(xì)記錄樣本接收時間、送檢科室、檢測項目及異常情況備注，確保數(shù)據(jù)可追溯。登記與信息錄入檢查樣本運輸容器是否符合生物安全要求，如密封性、防震措施及生物危害標(biāo)識，高風(fēng)險樣本需單獨標(biāo)注并優(yōu)先處理。生物安全確認(rèn)樣本存儲條件要求需在2-8℃專用冰箱保存，避免反復(fù)凍融，保存時間不超過48小時。病毒核酸易降解，冷藏期間需避免光照和劇烈溫度波動。短期存儲規(guī)范若需延遲檢測，樣本應(yīng)分裝后置于-70℃超低溫冰箱，避免與其它生物樣本交叉污染，并標(biāo)注凍存日期及操作人員信息。長期冷凍要求重要臨床樣本或科研樣本需雙重備份，分別存儲于不同設(shè)備，并定期檢查存儲設(shè)備運行狀態(tài)及溫度記錄。備份樣本管理樣本預(yù)處理操作步驟核酸提取前處理樣本需在生物安全柜中解凍，渦旋震蕩混勻后離心去除雜質(zhì)，使用蛋白酶K或裂解液處理以提高核酸釋放效率。滅活操作采用56℃水浴或?qū)Ｓ脺缁顒┨幚順颖?0分鐘，確保病毒失去感染性，同時保留核酸完整性以供后續(xù)PCR檢測。分裝與質(zhì)量控制預(yù)處理后樣本按檢測需求分裝至無菌EP管，并抽取5%樣本進(jìn)行陰性/陽性對照檢測，驗證預(yù)處理效果及試劑穩(wěn)定性。02檢測流程與方法核酸提取具體步驟樣本預(yù)處理洗滌與洗脫裂解與結(jié)合將采集的鼻咽拭子樣本置于病毒保存液中，充分震蕩混勻后離心，取上清液用于核酸提取，確保樣本無雜質(zhì)干擾。加入裂解緩沖液破壞病毒蛋白外殼釋放核酸，隨后通過硅膠膜吸附柱特異性結(jié)合核酸，去除蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。使用不同濃度的乙醇洗滌液去除殘留污染物，最后用無核酸酶水或洗脫緩沖液將純化后的核酸從吸附柱上洗脫，保存于無菌離心管中備用。反應(yīng)體系配制分逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增兩階段，逆轉(zhuǎn)錄階段將病毒RNA轉(zhuǎn)為cDNA，擴(kuò)增階段通過循環(huán)升溫變性、退火和延伸，實時監(jiān)測熒光信號。擴(kuò)增程序設(shè)置結(jié)果分析與判讀根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值判定陽性或陰性，設(shè)置內(nèi)參基因確保檢測有效性，異常結(jié)果需復(fù)檢并結(jié)合臨床信息綜合評估。按照試劑盒說明配制反應(yīng)混合液，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、dNTPs、熒光探針及特異性引物，嚴(yán)格避免交叉污染。RT-PCR檢測操作規(guī)程快速檢測試劑盒使用指南樣本處理與加樣將樣本滴加至試劑盒樣本孔，利用層析原理使樣本沿試紙條遷移，避免氣泡產(chǎn)生影響檢測線顯色。結(jié)果讀取與記錄每批次檢測需包含陽性和陰性對照，試劑盒應(yīng)避光保存于指定溫度，過期或破損試劑不得使用以確保結(jié)果準(zhǔn)確性。在規(guī)定時間內(nèi)觀察檢測線和質(zhì)控線顯色情況，質(zhì)控線未出現(xiàn)則檢測無效，需重新操作；雙線顯色為陽性，僅質(zhì)控線顯色為陰性。質(zhì)量控制要點03質(zhì)量控制體系內(nèi)部質(zhì)控樣本設(shè)置質(zhì)控樣本類型選擇需包含弱陽性、中陽性和強(qiáng)陽性樣本，覆蓋檢測方法的線性范圍，確保不同濃度水平的病毒均能被準(zhǔn)確識別。01質(zhì)控頻率與批次匹配每批次檢測必須同步運行內(nèi)部質(zhì)控樣本，若連續(xù)檢測超過規(guī)定批次，需增加質(zhì)控頻次以監(jiān)控系統(tǒng)穩(wěn)定性。02質(zhì)控數(shù)據(jù)記錄與分析詳細(xì)記錄質(zhì)控樣本的CT值、擴(kuò)增曲線形態(tài)等參數(shù)，定期繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖，分析趨勢偏移或失控原因。03認(rèn)證機(jī)構(gòu)選擇收到外部質(zhì)評樣本后，需在指定周期內(nèi)完成檢測并提交結(jié)果，逾期數(shù)據(jù)將影響實驗室評價等級。樣本檢測與反饋時效不符合項整改措施針對質(zhì)評反饋的偏差問題，需啟動根本原因分析（RCA），制定糾正措施并驗證有效性，形成閉環(huán)管理。參與通過國際或國家認(rèn)證的外部質(zhì)評計劃，如CAP、CLIA等，確保質(zhì)評結(jié)果具有權(quán)威性和可比性。外部質(zhì)評參與規(guī)范結(jié)果異常處理流程02

03

上報與文檔記錄01

初步復(fù)檢與確認(rèn)若確認(rèn)系統(tǒng)性問題，需上報質(zhì)量控制部門并暫停檢測，同時完整記錄異?，F(xiàn)象、處理步驟及最終結(jié)論。設(shè)備與試劑核查檢查PCR儀校準(zhǔn)狀態(tài)、試劑批號有效性及儲存條件，必要時更換試劑或重新校準(zhǔn)設(shè)備。對異常結(jié)果（如陰性對照陽性或陽性對照陰性）立即復(fù)檢，排除操作失誤或樣本交叉污染等干擾因素。04結(jié)果分析與報告結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)陽性結(jié)果判定檢測樣本中甲型流感病毒核酸或抗原濃度達(dá)到預(yù)設(shè)閾值，且擴(kuò)增曲線符合標(biāo)準(zhǔn)特征，需結(jié)合內(nèi)參基因有效性排除假陽性可能。陰性結(jié)果判定樣本未檢出病毒靶標(biāo)基因，但需驗證樣本質(zhì)量（如內(nèi)參基因Ct值合格），排除采樣不當(dāng)或運輸保存問題導(dǎo)致的假陰性。灰區(qū)結(jié)果處理當(dāng)檢測值處于臨界范圍時，需重復(fù)檢測或采用其他方法（如測序）驗證，必要時結(jié)合臨床癥狀綜合評估。干擾因素排除評估溶血、脂血、細(xì)菌污染等對檢測的影響，并在報告中注明可能存在的局限性。報告格式與內(nèi)容要求標(biāo)準(zhǔn)化模板報告需包含患者信息、樣本類型、檢測方法、檢測項目、結(jié)果數(shù)值/定性描述、參考范圍及實驗室標(biāo)識等核心字段。結(jié)果清晰標(biāo)注陽性結(jié)果需加粗或高亮顯示，陰性結(jié)果注明“未檢出”，灰區(qū)結(jié)果需附解釋說明及建議復(fù)查提示。臨床建議補(bǔ)充根據(jù)結(jié)果提供分級建議（如“建議隔離治療”或“排除感染”），并附檢測方法的敏感性與特異性說明。電子簽名與審核報告需經(jīng)檢測人員與復(fù)核人員雙簽名，電子報告需加密并留存可追溯的修改記錄。結(jié)果復(fù)核與簽發(fā)機(jī)制雙人復(fù)核制度所有陽性及灰區(qū)結(jié)果需由另一名資深檢驗人員獨立復(fù)核，復(fù)核內(nèi)容包括原始數(shù)據(jù)、曲線形態(tài)及質(zhì)控有效性。對高流行期聚集性陽性或罕見亞型結(jié)果，需啟動實驗室負(fù)責(zé)人復(fù)核流程，并同步上報院感管理部門。常規(guī)陰性報告由授權(quán)技師簽發(fā)，陽性報告需副主任技師以上人員審核簽發(fā)，確保結(jié)果權(quán)威性。復(fù)核過程需在LIS系統(tǒng)中留痕，原始數(shù)據(jù)與報告同步存檔，保存期限符合生物安全與質(zhì)量管理規(guī)范。異常結(jié)果上報簽發(fā)權(quán)限分級記錄存檔要求05生物安全防護(hù)需使用一次性連體防護(hù)服，確保覆蓋全身皮膚，穿戴時檢查完整性，避免破損或縫隙暴露。防護(hù)服袖口應(yīng)緊貼手套邊緣，防止氣溶膠滲透。個人防護(hù)裝備穿戴防護(hù)服選擇與穿戴必須佩戴N95及以上級別口罩，進(jìn)行密合性測試確保無漏氣。護(hù)目鏡需完全覆蓋眼部，防止飛濺物接觸，使用防霧涂層避免視線模糊?？谡峙c護(hù)目鏡使用內(nèi)層為醫(yī)用乳膠手套，外層為加厚丁腈手套，袖口壓入外層手套內(nèi)。鞋套需防水且高至膝蓋，與防護(hù)服褲腳密封銜接。雙層手套與鞋套規(guī)范工作臺面消毒流程實驗前后需用含氯消毒劑（有效氯濃度1000mg/L）擦拭臺面，作用時間不少于30分鐘，重點處理樣本接觸區(qū)域。紫外線照射輔助消毒，時長不低于1小時。空氣消毒與通風(fēng)管理采用高效空氣過濾器（HEPA）循環(huán)凈化，每小時換氣次數(shù)≥12次。操作結(jié)束后使用氣溶膠噴霧器噴灑過氧化氫消毒劑，密閉空間2小時后通風(fēng)。設(shè)備表面消毒要求離心機(jī)、移液器等高頻接觸設(shè)備需用75%乙醇擦拭，金屬部件改用異丙醇以避免腐蝕。生物安全柜內(nèi)壁消毒需在每次實驗后執(zhí)行，使用專用消毒劑浸泡的無紡布清潔。實驗室環(huán)境消毒程序感染性廢物分類銳器（如針頭、碎玻璃）須投入防刺穿容器，其他污染廢棄物（如拭子、培養(yǎng)皿）裝入雙層黃色醫(yī)療垃圾袋，標(biāo)注“高危生物危害”標(biāo)識。高壓滅菌參數(shù)控制廢棄物需在121℃、103.4kPa條件下高壓滅菌30分鐘，滅菌袋外粘貼化學(xué)指示條驗證效果。未達(dá)標(biāo)物品需重新處理并記錄異常原因。轉(zhuǎn)運與交接登記滅菌后廢物由專職人員密閉轉(zhuǎn)運至?xí)捍骈g，交接時核對重量、數(shù)量并雙人簽字。外部處置單位需具備醫(yī)療廢物特許經(jīng)營資質(zhì)，運輸車輛配備GPS追蹤系統(tǒng)。廢棄物處理規(guī)范06設(shè)備維護(hù)與校準(zhǔn)日常維護(hù)保養(yǎng)步驟清潔設(shè)備表面與內(nèi)部組件使用無塵布和專用清潔劑擦拭設(shè)備外殼，定期清理內(nèi)部光學(xué)元件、傳感器等關(guān)鍵部件，避免灰塵或液體殘留影響檢測精度。檢查試劑與耗材有效期每日開機(jī)前確認(rèn)試劑盒、緩沖液、采樣管等耗材的庫存狀態(tài)及有效期，確保無過期或污染風(fēng)險。運行自檢程序啟動設(shè)備后執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化自檢流程，包括光源強(qiáng)度校準(zhǔn)、液路系統(tǒng)壓力測試及機(jī)械臂運動軌跡驗證，確保各模塊功能正常。光學(xué)系統(tǒng)校準(zhǔn)采用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球或比色卡對光學(xué)檢測模塊進(jìn)行定量校準(zhǔn)，調(diào)整光路聚焦參數(shù)以符合預(yù)設(shè)的吸光度與熒光值范圍。定期校準(zhǔn)周期與方法溫控系統(tǒng)驗證通過高精度溫度探頭檢測樣本孵育區(qū)、反應(yīng)孔位的實際溫度，與設(shè)備顯示值比對，偏差超過±0.5℃時需重新校準(zhǔn)PID控制參數(shù)。移液精度校準(zhǔn)使用微量天平稱量不同體積（如10μL、100μL）的去離子水，對比設(shè)備移液體積與實測重量，誤差超過±2%需調(diào)整液泵活塞行程。故障處置與記錄錯誤代碼分類與響應(yīng)根據(jù)設(shè)備顯示屏或軟件