生工本2009級4班劉培培20092513418L-天冬酰胺酶的生產(chǎn)工藝LOGO10/26/20251.（一）天冬酰胺酶的化學組成和性質

天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是大腸桿菌菌體中提取分離的酶類藥物，用于治療白血病。1922年Clementi發(fā)現(xiàn)豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年Kidd發(fā)現(xiàn)豚鼠血清中有抑癌作用的物質，其活性成分是蛋白質；1961年Broome確定了其有效成分是天冬酰胺酶，后來，Mashburn等報告指出從大腸桿菌中分離出天冬酰胺酶，具有同樣抗癌活性。天冬酰胺酶呈白色粉末狀，微有濕性，溶于水，不溶于丙酮三氯甲烷乙醚和甲醇，水溶液20℃儲存7d，5℃儲存14d均不減少酶的活力。干品50℃15min酶活力降低30％，60℃1h內失活，最適PH8.5，最適溫度37℃。

2025/10/262.（二）國內天冬酰胺酶的發(fā)展歷程目前,國內臨床上應用的L2ASP主要來源于大腸桿菌,我國天津生化廠于1974年開始生產(chǎn)E1coli天冬酰胺酶,但由于菌種產(chǎn)酶能力低,提取精制工藝落后,難以與國外產(chǎn)品競爭,再加之其他原因最后停產(chǎn)。為了填補國內空白,1995年,中國藥科大學吳梧桐教授等率先進行了E1coli天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表達研究,并首次在國內成功構建了高效表達L2ASP的基因工程菌pKA/CPU210009,工程菌發(fā)酵單位比野生株高出100倍。隨后又優(yōu)化了基因工程菌的培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝,確定了重組L2ASP的純化路線,并對重組產(chǎn)品進行了鑒定。結果表明,基因工程菌生產(chǎn)的產(chǎn)品質量與天然品從基因序列、蛋白質一級結構到蛋白質的物理化學性質等方面均一致,兩者具有同質性

。這些研究成果為我國工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質、低價的注射用E1coliL2ASP開辟了新的道路。2025/10/263.（三）抗腫瘤機制

L2ASP抗腫瘤的作用機制在于它能夠降低人體內L2天冬酰胺和L2谷氨酰胺的濃度,這兩種氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶,不能合成L2天冬酰胺,需酸是合成嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的重要組成部分。腫瘤細要攝取外源L2天冬酰胺才能存活。當外源L2天冬酰胺被分解掉時,癌細胞合成核苷酸和蛋白質的能力就會顯著降低,因此L2ASP能有效抑制腫瘤細胞的增殖。有研究表明,L2ASP能夠選擇性抑制體內Ra2pamycin2靶標信號傳導通路,從而抑制腫瘤的增值

。另有文獻報道,L2ASP在體內發(fā)揮作用時可能是通過一種功能性的p53蛋白因子來介導腫瘤細胞的凋亡

。2025/10/264.（四）工藝流程大腸桿菌產(chǎn)生的L2ASP包括L2ASPⅠ和L2ASPⅡ,其中L2ASPⅠ存在于細胞質中,與底物L2天冬酰胺的親和力很小(Km=1×10-3mol/L),沒有抗腫瘤活性;而L2ASPⅡ則分泌在細胞周質中,與L2天冬酰胺有很高的親和力(Km=1×10-5mol/L),有抗癌活性[3]?，F(xiàn)今,產(chǎn)生L2ASPⅡ的菌種主要包括Escherichiacoli、Erwiniacarotovara、Serraliamarcescem、PseudomonasSp1、Wolinellasuccinogenes等。主要采用的提純方法包括硫酸銨分級沉淀、乙醇分級沉淀、離子交換層析法、超濾、水系二相膠束系統(tǒng)、分批式吸附和直行式解吸附法、滲透休克法以及親和層析法等[8～16]。采用不同方法最終得到目標產(chǎn)物的酶活力范圍為220～520157U/mg,總回收率為31%～86%。2025/10/265.天冬酰胺酶工藝流程圖

大腸桿菌→肉湯菌種→種子菌種→發(fā)酵液→菌體→提取液→上清液→沉淀→洗脫液→洗脫液→凍干→

L-天冬酰胺酶[菌種培養(yǎng)]肉湯培養(yǎng)基37℃48h玉米漿培養(yǎng)基37℃4-8h[種子培養(yǎng)][發(fā)酵]玉米漿培養(yǎng)基37℃6-8h[離心][提取]蔗糖抽提液PH7.530℃[分級沉淀]（NH4)2SO455％飽和度PH7.0[分級沉淀]（NH4)2SO490％飽和度[離子沉淀]DEAE-纖維素(DE52)[離子交換]CM-纖維素(CM52)2025/10/266.工藝過程及要點1菌種培養(yǎng)

采用大腸桿菌EscherichiacoliA.S.1.357,培養(yǎng)基加牛肉汁100mL,蛋白胨1g,氯化鈉0.5g,瓊脂2-2.5g37℃,在試管中培養(yǎng)24h，茄形瓶培養(yǎng)8h，錐形瓶培養(yǎng)16h。

2種子培養(yǎng)

培養(yǎng)基用玉米漿30kg，加水至300kg，接種量1%-1。5%，37℃，通氣攪拌培養(yǎng)4-8h.2025/10/267.一、總述3發(fā)酵罐培養(yǎng)取玉米漿100Kg，接種量8%，37℃，通氣攪拌培養(yǎng)6-8h，離心分離發(fā)酵液，得菌體加2倍量丙酮攪拌，壓濾，濾餅過篩，自然風干成菌體干粉。4蔗糖溶液抽提將菌體細胞中加入5倍體積的蔗糖溶液（蔗糖40%溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5),30℃振蕩2h,8000r/min離心，收取上層酶液。2025/10/268.5硫酸銨分級沉淀取上述酶液，加入（NH4)2SO4至55%飽和度，調PH至7.0，室溫攪拌1h，離心除去沉淀，取上清液加入（NH4)2SO4到90%飽和度，離心收集沉淀。6純化將沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸緩沖液溶解并透析，透析后的酶液，通過預先用10mmol/L，PH7.6磷酸緩沖液平衡的DEAE-纖維素層析柱（1cm×30cm）,用30mmol/L磷酸緩沖液洗脫，流速為40mL/h,收集天冬酰胺酶活性組分，再調整PH4.8,通過預先用50mmol/L,PH4.9的磷酸緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱（1cm×8cm）,用50mmol/L,PH5.2的磷酸緩沖液洗脫，收集酶活性組分，冷凍干燥，即得L-天冬酰胺酶凍干粉，總收率為31%，比活為220U/mg蛋白。2025/10/269.二、工藝流程圖（1）絲狀菌三級發(fā)酵工藝流程

冷凍管（25°C，孢子培養(yǎng)，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培養(yǎng)，7天）——大米孢子（26°C，種子培養(yǎng)56h）——一級種子培養(yǎng)液（27°C，種子培養(yǎng)，24h）——二級種子培養(yǎng)液（27~26°C,發(fā)酵,7天）——發(fā)酵液。

（2）球狀菌二級發(fā)酵工藝流程

冷凍管（25°C，孢子培養(yǎng)，6~8天）——親米（25°C，孢子培養(yǎng)，8~10天）——生產(chǎn)米（28°C，孢子培養(yǎng)，56~60h）——種子培養(yǎng)液（26~25-24°C，發(fā)酵，7天）——發(fā)酵液。2025/10/2610.三、青霉素發(fā)酵過程青霉素發(fā)酵時，青霉素生產(chǎn)菌在合適的培養(yǎng)基、PH、溫度和通氣攪拌等發(fā)酵條件下進行生長并合成青霉素。發(fā)酵開始前，有關設備和培養(yǎng)基（主要是碳源、氮源、前體和無機鹽等）必須先經(jīng)過滅菌，后接入種子。在整個過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，在發(fā)酵過程中往往要加入泡沫劑，假如酸堿控制發(fā)酵液的PH，還需要間歇或連續(xù)的加入葡萄糖及銨鹽等化合物以補充碳源及氮源，或補進其他料液和前體等以促進青霉素的生產(chǎn)。2025/10/2611.青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為菌體生長、青霉素合成和菌體自溶三個階段。菌體生長階段：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的環(huán)境中經(jīng)過短時間的適應，即開始發(fā)育、生長和繁殖，直至達到菌體的臨界濃度。青霉素合成階段：這個階段主要合成青霉素，青霉素的生產(chǎn)速率達到最大，并一直維持到青霉素合成能力衰退。在這個階段，菌體重量有所增加，但產(chǎn)生菌的呼吸強度一般無顯著變化。菌體自溶階段：這個階段菌體衰老，細胞開始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生產(chǎn)速率下降，氨基氮增加，PH上升。2025/10/2612.后面內容直