目錄TOC\o"1-3"\u摘要： [2]，在一定條件下甚至可分泌對(duì)腎臟及免疫系統(tǒng)具有毒性的桔霉素REF_Ref160386504\r\h[6]。桔霉素(citrinin，CIT)，又稱桔青霉素或橘青霉素，主要是由曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、紅曲霉屬（Monascus）產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物REF_Ref160386517\r\h[7]。研究發(fā)現(xiàn)，桔霉素對(duì)肝、腎、胃、心臟都有不同程度的毒性，其中較明顯的是腎毒性和致癌性REF_Ref160386531\r\h[8]，在各種動(dòng)物模型中引起腎病、肝臟毒性以及腎腺瘤形成REF_Ref160386540\r\h[9]。ZHANG等REF_Ref160386550\r\h[10]對(duì)普洱茶的真菌和細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其中含有桔青霉。Li等REF_Ref160386562\r\h[11]在113個(gè)六堡茶樣本中，檢測出37個(gè)CIT陽性樣本。HAAS等REF_Ref160386575\r\h[12]發(fā)現(xiàn)黑茶中CIT的檢出率在20%以上。ZHOU等REF_Ref160386590\r\h[13]對(duì)包括綠茶、烏龍茶、紅茶、黑茶在內(nèi)的80份茶葉樣本的16種霉菌毒素分析表明，僅在黑茶中發(fā)現(xiàn)存在CIT污染，最大污染水平為203.76μg·kg-1。茶多酚(TeaPolyphenol，TP)亦稱茶鞣質(zhì)、茶單寧，是一類存在于茶樹中的多元酚的混合物，其主要成分為兒茶素類、黃酮類、花青素類及酚酸類等REF_Ref160386607\r\h[14]。研究證實(shí)，茶多酚具有多種保健和藥理作用，包括抗腫瘤作用、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用、抗齲護(hù)齒作用、抗菌作用、抗紫外線照射作用、抗氧化作用等REF_Ref160386620\r\h[15]。近年來，茶葉或多酚類等物質(zhì)抑制真菌產(chǎn)毒的研究并不少見，李亞莉等REF_Ref160386632\r\h[16]通過接種外源產(chǎn)毒黃曲霉在普洱茶基質(zhì)上，并在高溫高濕條件下培養(yǎng)和倉儲(chǔ)，一定陳化期后進(jìn)行樣品檢測，發(fā)現(xiàn)具有產(chǎn)毒能力的黃曲霉在普洱茶基質(zhì)上未產(chǎn)生黃曲霉毒。這表明黑茶基質(zhì)中的某些成分具有抑制黃曲霉毒素合成的能力。張浩等REF_Ref160386645\r\h[17]認(rèn)為茶葉中多酚類物質(zhì)槲皮素通過激活抗氧化系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)基因下調(diào)表達(dá)，是抑制黃曲霉生長和產(chǎn)毒的活性因子。在以茶葉基質(zhì)為研究對(duì)象的黃曲霉產(chǎn)毒研究結(jié)果表明，云南大葉種茶的水提取物對(duì)黃曲霉毒素的合成有明顯的抑制作用REF_Ref160386658\r\h[18]。目前對(duì)桔霉素的大多數(shù)研究都集中在紅曲產(chǎn)品生產(chǎn)過程中去除桔霉素的方法等方面，何珊珊等人REF_Ref160386673\r\h[19]通過代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)，添加黃酮類化合物可以降低CIT含量。歐陽等人REF_Ref160386683\r\h[20]發(fā)現(xiàn)，添加染料木黃酮可以通過改變轉(zhuǎn)錄水平來減少紅曲中CIT的產(chǎn)生。有關(guān)黑茶中活性物質(zhì)表達(dá)與CIT含量之間關(guān)系研究較少，黑茶中活性物質(zhì)與CIT合成相關(guān)基因表達(dá)之間的關(guān)系仍然模糊不清。因此，本試驗(yàn)通過分別添加不同濃度的茶多酚對(duì)已分離鑒定的CIT產(chǎn)生菌株進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，觀察不同濃度菌株生長情況，利用高效液相色譜技術(shù)（HPLC）測定CIT含量，研究茶多酚對(duì)CIT產(chǎn)生菌株生長的影響。同時(shí)，依據(jù)CIT生物合成關(guān)鍵基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)茶多酚與空白對(duì)照培養(yǎng)下生長的CIT產(chǎn)生菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析CIT合成相關(guān)基因的表達(dá)情況，為控制黑茶中CIT產(chǎn)生提供參考依據(jù)。1材料與方法1.1材料（1）實(shí)驗(yàn)菌株：BRM5（課題組前期從湖南生產(chǎn)的黑毛茶中分離鑒定的桔青霉）。（2）實(shí)驗(yàn)材料：（3）培養(yǎng)基：K2HPO4、蒸餾水。（4）試劑：桔青霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品購于普瑞邦生物工程有限公司（青島）、RNA提取試劑盒、天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒、色譜純級(jí)冰乙酸、甲醇、乙腈。1.2儀器設(shè)備表1試驗(yàn)主要儀器設(shè)備設(shè)備名稱生產(chǎn)廠商高壓滅菌鍋（YXQ-LS-70A）上海博訊儀器有限公司超凈工作臺(tái)（SW-CJ-D)上海博訊儀器有限公司恒溫培養(yǎng)箱（SPX-250）上海申賢恒溫設(shè)備廠恒溫冰箱（BC·BD-98D)廣東奧與儀器有限公司電子天平（FA2204N）常州市衡正電子儀器有限公司高效液相色譜儀（1260InfinityⅡ）美國安捷倫科技有限公司超聲波振蕩器（KH520E）昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)器（ST16R）美國賽默飛世爾科技有限公司超微量核酸蛋白測定儀（Scandrop100）成都百樂科技有限公司熒光定量PCR儀（CFX96Touch）成都百樂科技有限公司1.3試驗(yàn)方法1.3.1桔青霉菌株活化課題組前期已采用β微管蛋白基因序列對(duì)菌株BRM5進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示其與Penicilliumcitrinum（KX712477.1）的遺傳距離最近，如圖1所示，將其確定為桔青霉（Penicilliumcitrinum）。并通過HPLC技術(shù)對(duì)該菌株產(chǎn)CIT的能力進(jìn)行鑒定，確定其存在產(chǎn)CIT的能力。如圖2所示。采用PDA固體培養(yǎng)基，以三點(diǎn)接種法接種課題組已分離出的菌株BRM5。28℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5-7d，待其產(chǎn)生大量孢子后，取出備用。圖1基于β微管蛋白基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹圖2菌株BRM5桔青霉毒素檢測結(jié)果1.3.2母液及菌懸液制備稱取5.0g茶多酚，加入超純水使其溶解，轉(zhuǎn)移至50.0mL容量瓶中，再用超純水定容至50.0mL。由于茶多酚經(jīng)高溫滅菌后會(huì)發(fā)生性質(zhì)變化，故在超凈工作臺(tái)中將配置好的母液用0.22μm的微孔濾膜過濾，以除去母液中的細(xì)菌，待用。用接種環(huán)取少量活化的桔青霉孢子于試管中，加入蒸餾水3-5mL，輕輕振蕩使其均勻分散，在顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，再用無菌水將孢子懸浮液稀釋到1.0×106CFU·mL-1，菌懸液現(xiàn)配現(xiàn)用。1.3.3不同濃度茶多酚處理桔青霉菌株在超凈工作臺(tái)上，將茶多酚加入CYB培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中茶多酚濃度分別為0、5、7.5、10、15、20mg·L-1，接種菌懸液于上述培養(yǎng)基中，在28℃條件下培養(yǎng)7d，每個(gè)處理重復(fù)3次。表2不同濃度茶多酚培養(yǎng)體系母液(μL)菌懸液(μL)培養(yǎng)液(μL)蒸餾水(μL)010010080050100100750751001007251001001007001501001006502001001006001.3.4桔霉素含量檢測培養(yǎng)結(jié)束后，分別吸取1.0mL待測液，過0.45μm濾膜上機(jī)測試，HPLC條件如下：（1）色譜柱：C18柱，柱長150mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm；（2）流動(dòng)相：A相為超純水（加入2.0%的冰乙酸），B相為乙腈，等度洗脫：A:B=50:50；（3）柱溫：28℃，流速1.0mL·min-1，進(jìn)樣量50.0μL；1.3.5增大接種量培養(yǎng)將菌株BRM5（孢子懸浮液稀釋到10.0×106CFU·mL-1）在5mg·L-1濃度的茶多酚條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)（將1.3.3所述培養(yǎng)體系擴(kuò)大10倍）7d，同時(shí)以不加茶多酚為空白對(duì)照培養(yǎng)。1.3.6培養(yǎng)后產(chǎn)CIT真菌RNA的提取RNA的提取按照總RNA抽提試劑盒中的方法進(jìn)行，操作方法如下：（1）收集50-100mg真菌菌絲球，在液氮中磨碎，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管，加入350-600μL的R-LysisBuffer和6.0-8.0μL的β-巰基乙醇。使用渦漩振蕩器振蕩10-20s，讓樣品進(jìn)一步混勻，并將樣品置于55℃恒溫水浴鍋中5-20min，中間顛倒2-3次，以完全解離核蛋白復(fù)合物。（2）離心機(jī)13000rpm離心2-10min，取上清液到新的1.5mL無酶離心管中；在離心管中加入350μL無水乙醇，快速顛倒并用渦漩振蕩器振蕩10s讓其充分混勻；將混合物轉(zhuǎn)移到回收柱中，在室溫下靜置1min，12000rpm離心30s；倒掉收集管中的廢液，加入500μL無水乙醇，12000rpm離心30s；倒掉收集管中的廢液，加入500μLR-washingBuffer（已加入無水乙醇），12000rpm離心1min；倒掉收集管中的廢液，12000rpm離心2min去除殘余酒精；將回收柱打開后放置到新的1.5mL無酶離心管中，打開蓋子后室溫靜置5min；加入20-50μLDEPC-TreatedddH2O到收集柱膜中心，室溫放置2min，12000rpm離心2min，得到RNA。1.3.7RNA的檢測及反轉(zhuǎn)錄（1）檢測總RNA完整性用1×TAE緩沖配置1%的瓊脂糖凝膠30.0mL于錐形瓶中，用微波爐加熱至沸騰溶解，加入約2.0μL核酸染料，倒入并插好小孔梳子準(zhǔn)備好的電泳板中，冷卻。吸取上述全部RNA注入瓊脂糖凝膠孔中，電泳儀設(shè)定程序：恒壓150V，20min。關(guān)閉電泳儀并取出瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測及成像，只有觀察到28S、18S和5SrRNA三個(gè)條帶，且28S/18S亮度大于等于1.5，無彌散條帶的樣品時(shí)才可用于測序及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（2）檢測總RNA的濃度和純度用核酸蛋白儀檢測所提取RNA的濃度和純度，只有總濃度≥250ng·μL-1，OD260/280比值在1.8-2.2，OD260/230≥2.0，且樣品在260nm處有正常峰值，才能用于測序以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（3）cDNA構(gòu)建對(duì)于測試通過的樣品，進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，具體操作參見天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒。表3反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系組成成分使用量5×FastKing-RTSuperMix4μLTotalRNA50ng-2μLRNase-FreeddH2O補(bǔ)足到20μL1.3.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）以β-actin作為內(nèi)部參考基因，引物參照CIT合成基因簇引物序列REF_Ref160386741\r\h[21]見表4，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系見表5。表4熒光定量反應(yīng)引物引物序列pksCTFTGATGCGACGAAGATGTTACpksCTRTCTCTATGCTGCGACTGAC續(xù)表4引物序列orf5FTAATGGTGTATCGCCGGAGCorf5RGACTCATCTCTGGGATGGCGctnBFATGTGAAACGCCAAGACGACctnBRGGCCAGCCAGTAGAACTCCorf3FACAAGGTCCAACACTACCCAGCorf3RTCTCAGGCGTTTCTCCGACAGGctnAFACGGACTTTGGAGCCATCACctnARAAGCGTCTTTGTTCGGAGGAorf1FAGACCGTCAACTCCTCCCAATAorf1RACCAATCCAGTGCTCCCTACCorf6FGTGAACGACATCGGTGCTGCorf6RTGTTGCCCTCGCTGTCCTCctnDFCTTGGCTGCGTTCGATGAGctnDRTGGCGTGCTGGTTCTGTCTActnEFAGGGCCATGCTGCCTCTTCctnERGCCAATTTCCCGGTTTGATAG表5熒光定量PCR反應(yīng)體系組分體積（μL）PremixExTaqTMⅡ(2x)12.5ForwardPrimer(10μM)0.5ReversePrimer(10μM)0.5Template(cDNA×10)1.0ddH2O10.51.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用Excel2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；使用SPSS27.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的單因素方差分析和T檢驗(yàn)（當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著），采用GraphpadPrism10作圖。2結(jié)果與分析2.1茶多酚對(duì)桔青霉生長的抑制作用添加茶多酚后的菌株BRM5在CYB培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d的生長狀況見圖3。在較低濃度（0、5、7.5mg·mL-1)的茶多酚培養(yǎng)條件下對(duì)菌株BRM5的生長抑制不明顯；在較高濃度（10、15mg·mL-1)的茶多酚培養(yǎng)條件下對(duì)菌株BRM5的生長有明顯的抑制效果，但是并沒有完全抑制其生長；在高濃度（20mg·mL-1)的茶多酚培養(yǎng)條件下則基本完全抑制了菌株BRM5的生長。圖3菌株BRM5在不同濃度茶多酚條件下培養(yǎng)7d的生長狀況注：從右往左依次為0、5、7.5、10、15、20mg·mL-12.2茶多酚對(duì)桔青霉產(chǎn)CIT的抑制作用隨著添加茶多酚的增加，菌株BRM5的生長得到了抑制。通過檢測其CIT產(chǎn)生量，發(fā)現(xiàn)菌株BRM5在茶多酚的處理培養(yǎng)條件下，無論是低濃度還是高濃度，CIT的含量都遠(yuǎn)小于空白對(duì)照組，見表6。在添加茶多酚培養(yǎng)7d后，雖然菌株BRM5能夠在較低濃度的條件下生長，但是檢測到CIT的含量都遠(yuǎn)小于空白對(duì)照組，甚至檢測不到CIT，這促使我們思考，茶多酚是否抑制了菌株BRM5合成CIT相關(guān)基因的表達(dá)。表6不同濃度茶多酚培養(yǎng)7d后的CIT濃度處理濃度(mg·mL-1)CIT(ng·mL-1)茶多酚0156.30±39.34a517.83±6.66b7.58.13±5.85b續(xù)表6處理濃度(mg·mL-1)CIT(ng·mL-1)茶多酚101.06±1.84b15ND20ND注：ND表示檢測低于下限；數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差，不同小寫字母表示各組間的顯著差異（p＜0.05）；茶多酚濃度為零時(shí)即為空白對(duì)照。通過檢測增大接種量培養(yǎng)7d后的培養(yǎng)液中CIT的含量，詳見表7。增大接種量前后，茶多酚組CIT含量明顯低于空白對(duì)照組，且兩組的空白對(duì)照相比CIT含量極顯著增加，但茶多酚組相比含量變化不明顯（詳見圖4）。猜測可能是茶多酚抑制了菌株BRM5合成CIT關(guān)鍵基因的表達(dá)，即使增大接種量，CIT含量變化也不明顯。表7增大接種量培養(yǎng)7d后培養(yǎng)液中CIT濃度處理濃度(mg·mL-1)CIT(ng·mL-1)茶多酚0863.15±281.60a518.53±15.07b注：數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差，不同小寫字母表示各組間的顯著差異（p＜0.05）；茶多酚濃度為零時(shí)為空白對(duì)照。圖4增大接種量培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中CIT的含量2.2.1添加茶多酚處理與空白對(duì)照組基因的差異表達(dá)目前桔霉素的合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有很多步驟不清楚，只存在一些預(yù)測途徑，可能不同的菌種有著不同的生物合成途徑。根據(jù)HeYiREF_Ref160386756\r\h[22]以及HAJJAJHREF_Ref160386768\r\h[23]推測的主要的CIT合成途徑及CIT合成關(guān)鍵基因簇（圖5）。Shimizu等人REF_Ref160386783\r\h[24]從紅曲霉中獲得pksCT基因，證明了pksCT基因與CIT生物合成之間的相關(guān)性。LiYongping等人REF_Ref160386796\r\h[25]研究證明，在紅曲霉中敲除ctnB后，桔霉素的含量降低，表明ctnB基因直接參與CIT的合成。Balakrishnan等人REF_Ref160386805\r\h[26]確定orf3基因編碼一種雙加氧酶，該酶催化還原介導(dǎo)的吡喃環(huán)環(huán)化之前的多步甲基氧化，且orf1基因是CIT生物合成途徑中的最終產(chǎn)物合成的催化劑。Ning等人REF_Ref160386815\r\h[27]發(fā)現(xiàn)ctnE基因位于ctnA上游3.3kb，編碼一種與脫氫酶具有顯著相似性的蛋白質(zhì)。敲除CIT生物合成基因ctnE導(dǎo)致紅曲霉CIT產(chǎn)量下降96%以上，表明ctnE在CIT生物合成中至關(guān)重要。楊華等人REF_Ref160386824\r\h[28]表明，orf5作為紅曲霉中編碼CIT的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，干擾orf5基因的表達(dá)，會(huì)阻止CIT轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外，導(dǎo)致紅曲霉不產(chǎn)生CIT。圖5CIT合成途徑及CIT合成關(guān)鍵基因簇通過對(duì)增大接種量培養(yǎng)7d的茶多酚組與空白對(duì)照組轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，1266個(gè)基因在兩組之間存在顯著差異，其中483個(gè)下調(diào)基因，783個(gè)上調(diào)基因。在CIT生物合成基因簇中乙醛脫氫酶基因（orf1）、氧化還原酶基因（ctnB）、脫氫酶基因（ctnE）、聚酮合酶基因（pksCT）和加氧酶基因（orf3），分別下調(diào)78%、73%、69%、63%和67%，而沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因上調(diào)。這些基因的表達(dá)值在組內(nèi)存在一些差異，但與對(duì)照組相比較時(shí)，每個(gè)基因的表達(dá)水平都是顯著的（圖6）。同時(shí)，其他正向調(diào)節(jié)CIT生物合成的相關(guān)基因，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白基因（ctnA）和膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（orf5）也略有下調(diào)。因此，我們認(rèn)為茶多酚可能通過抑制CIT生物合成基因中相關(guān)基因的正向調(diào)控來減少CIT的產(chǎn)生。圖6CIT生物合成相關(guān)的差異表達(dá)基因的熱圖。在GO（GeneOntology）富集分析中，共有893個(gè)生物過程基因、190個(gè)細(xì)胞組成基因和481個(gè)分子功能基因（圖7）。茶多酚主要影響氧化還原和代謝基因的表達(dá)，同時(shí)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性下調(diào)，表明茶多酚的添加可能影響轉(zhuǎn)運(yùn)基因的相關(guān)活性（圖8），從而影響物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，導(dǎo)致CIT合成減少。圖7差異表達(dá)基因的GO功能分類圖8前20種（GO）富集途徑利用KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）分析進(jìn)一步對(duì)差異基因的功能進(jìn)行分類，與空白對(duì)照組相比，茶多酚組顯示許多基因上調(diào)表達(dá)。這些基因主要集中表現(xiàn)在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、類固醇生物合成、脂肪酸生物合成、類胡蘿卜素生物合成、生物素代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、α-亞麻酸代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等方面（圖9）。異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸是支鏈氨基酸，它們的降解產(chǎn)生乙酰輔酶A。丙氨酸參與脂肪、膽固醇和其他重要化合物的生物合成。天冬氨酸和谷氨酸參與體內(nèi)能量代謝的檸檬酸循環(huán)，將葡萄糖和脂肪酸轉(zhuǎn)化為能量。乙酰輔酶A是真菌中脂肪酸和類胡蘿卜素生物合成的前體物質(zhì)，脂肪酸和類胡蘿卜素合成基因的上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致乙酰輔酶A含量降低，而CIT是通過乙酰輔酶A為底物在通過不同代謝分支合成REF_Ref160386901\r\h[29]，最終導(dǎo)致CIT合成的含量降低。因此，茶多酚可能會(huì)通過影響初級(jí)代謝過程來間接影響次級(jí)代謝過程，使得次級(jí)代謝產(chǎn)物CIT的含量降低。圖9差異表達(dá)基因的前20種KEGG富集途徑2.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR的驗(yàn)證為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）的結(jié)果，通過RT-qPCR檢測與CIT生物合成相關(guān)的基因的表達(dá)。如圖10所示，與空白對(duì)照組相比，茶多酚組orf3與ctnA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量略微降低，ctnB與氧化還原酶基因（ctnD）表達(dá)量顯著下降，ctnE與乙二醛酶基因（orf6）表達(dá)量略微上調(diào)。RNA-seq和RT-qPCR結(jié)果差異基因顯著性表達(dá)不同的原因可能是由于RNA-seq中這些基因的下調(diào)相對(duì)較小。但總的來說，兩者的結(jié)果是一致的，表明在添加茶多酚的處理?xiàng)l件下CIT基因簇中的關(guān)鍵基因被下調(diào)，證明了茶多酚對(duì)CIT的合成有逆向調(diào)控作用，從而導(dǎo)致CIT產(chǎn)量下降。圖10實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證基因的表達(dá)水平3討論與結(jié)論本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到當(dāng)添加茶多酚在較低濃度（0、5、7.5mg·mL-1)的培養(yǎng)條件下，對(duì)桔青霉的生長抑制不明顯，但CIT含量顯著降低；當(dāng)添加茶多酚在較高濃度（10、15mg·mL-1)的培養(yǎng)條件下對(duì)桔青霉的生長有明顯的抑制效果，CIT含量顯著降低，但是并沒有完全抑制桔青霉生長；當(dāng)添加茶多酚在高濃度（20mg·mL-1)的培養(yǎng)條件下則基本完全抑制了桔青霉的生長，同時(shí)未能檢測到CIT。這說明桔青霉生長過程中茶多酚的添加抑制了桔青霉（BRM5）的生長，導(dǎo)致CIT含量減少。通過轉(zhuǎn)錄分析，研究RNA干擾對(duì)CIT合成基因簇中基因表達(dá)量的影響，經(jīng)過基因的差異表達(dá)分析，可能在氧化還原過程中關(guān)鍵基因表達(dá)下調(diào)，其中orf1、ctnB、ctnE、pksCT和orf3分別下調(diào)78%、73%、69%、63%和67%，CIT合成正向調(diào)控基因ctnA和orf5表達(dá)也略有下調(diào)。結(jié)合GO和KEGG通路分析，茶多酚組存在差異可能是通過下調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白減少，轉(zhuǎn)運(yùn)過程受阻以及脂肪酸和類胡蘿卜素生物合成、生物素代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等通路影響的。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ctnB、ctnE、orf3、ctnA、ctnD和orf6表達(dá)量變化，結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，茶多酚組ctnB和ctnD表達(dá)量顯著降低，orf6表達(dá)量略微上調(diào)。LiYongping等人REF_Ref160386796\r\h[25]研究證明，在紅曲霉中敲除ctnB后，CIT的含量降低。TangGuangfu等人REF_Ref160386926\r\h[30]的研究表明ctnD的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致菌絲體和發(fā)酵液中CIT含量顯著增加，分別超過31.7%和67.7%。Liang等人REF_Ref160386936\r\h[31]研究了orf6基因的功能，并證明了其對(duì)CIT生物合成的抑制作用。因此，添加茶多酚使得ctnB和ctnD基因表達(dá)量降低，從而導(dǎo)致CIT合成量減少。同時(shí)，orf6基因表達(dá)上調(diào)，抑制了CIT的生物合成。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了茶多酚可以通過抑制桔青霉的生長和影響CIT合成關(guān)鍵基因的表達(dá)量變化，使CIT含量降低。這為黑茶中CIT含量和檢出率較低這一客觀現(xiàn)象提供了新的見解，也為食品中產(chǎn)CIT真菌的污染防治提供了新的思路。但由于CIT生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全解析，不同菌株中CIT合成途徑可能存在不同，茶多酚抑制CIT生物合成的調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)張大春,王登良,郭勤.黑茶渥堆作用研究進(jìn)展[J].中國茶葉,2002,(05):6-8.姜依何,胥偉,朱旗.黑茶真菌污染研究進(jìn)展及探討[J].茶葉科學(xué),2018,38(03):227-236.張修寶,龔雪,王翔等.茶葉微生物污染研究進(jìn)展[J].貴茶,2023(02):4-13.HoubrakenJAMP,FrisvadJC,SamsonRA.TaxonomyofPenicilliumcitrinumandrelatedspecies[J].FungalDiversity,2010,44(1):117-133.胡治遠(yuǎn),劉素純,徐正剛,等.湖南益陽黑茶中桔青霉線粒體全基因組序列測定及分析[J].茶葉科學(xué),2020,40(6):830-844.WolframF,ClaudiaB,HGD.ToxicityofthemycotoxincitrininanditsmetabolitedihydrocitrinoneandofmixturesofcitrininandochratoxinAinvitro[J].Archivesoftoxicology,2014,88(5):1097-107.KamleM,MahatoDK,GuptaA,etal.Citrininmycotoxincontaminationinfoodandfeed:Impactonagriculture,humanhealth,anddetectionandmanagementstrategies[J].Toxins,2022,14(2):85.毛妍,楊夢然,梁曾恩妮,等.桔青霉素的研究現(xiàn)狀[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2021,42(11):121-124.HanQQ,YuLB,GuoYQ,etal.Toxiceffectsofcitrininonthemalereproductivesysteminmice[J].ExperimentalandToxicologicPathology,2012,64(5):465-469.ZhangY,SkaarI,SulyokM,etal.ThemicrobiomeandmetabolitesinfermentedPu-erhteaasrevealedbyhigh-throughputsequencingandquantitativemultiplexmetaboliteanalysis[J].PLoSOne,2016,11(6):e0157847.LiZ,MaoY,TengJ,etal.EvaluationofmycofloraandcitrininoccurrenceinChineseLiupaotea[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2020,68(43):12116-12123.HaasD,PfeiferB,ReiterichC,etal.IdentificationandquantificationoffungiandmycotoxinsfromPu-erhtea.[J]InternationalJournalofFoodMicrobiology,2013,166(2).ZhouHY,YanZ,YuS,etal.DevelopmentofaNovelUPLC-MS/MSMethodfortheSimultaneousDeterminationof16MycotoxinsinDifferentTeaCategories[J].Toxins,2022,14(3):169-169.阮宇成.茶多酚的組成與茶葉品質(zhì)[J].中國茶葉,1979(01):2-5.劉學(xué)銘,梁世中.茶多酚的保健和藥理作用及應(yīng)用前景[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1998(05):49-53+73.李亞莉,邢倩倩,涂青,周紅杰.外源接種黃曲霉污染普洱茶安全性研究[J].茶葉科學(xué),2017,37(05):513-522.張浩.茶葉發(fā)酵過程中的多酚變化及其對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒的抑制效應(yīng)[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2014.李浩,談?dòng)⒅?陳柱濤,等.云南大葉種曬青毛茶提取物對(duì)產(chǎn)毒黃曲霉生長及產(chǎn)毒的影響[J].現(xiàn)代食品科技,2015,11(31):101-106.何姍姍.基于代謝組學(xué)方法研究黃酮類化合物對(duì)紅曲菌產(chǎn)桔霉素的影響[D].南昌大學(xué),2021.DOI:10.27232/ki.gnchu.2021.002511.OuyangWB,LiuX,WangYL,etal.AdditionofgenisteintothefermentationprocessreducescitrininproductionbyMonascusviachangesatthetranscriptionlevel[J].FoodChemistry,2020,(prepublish):128410-.郭會(huì).紅曲霉桔霉素合成相關(guān)基因的功能驗(yàn)證[D].天津科技大學(xué),2017.HeY,CoxRJ.Themolecularstepsofcitrininbiosynthesisinfungi[J].2016.DOI:10.15488/793.HajjajH,KlaebeA,LoretMO,etal.BiosyntheticpathwayofcitrinininthefilamentousfungusMonascusruberasrevealedby13Cnuclearmagneticresonance[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology,1999,65(1):311-314.ShimizuT,KinoshitaH,IshiharaS,etal.PolyketideSynthaseGeneResponsibleforCitrininBiosynthesisinMonascuspurpureus[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2005,71(7):3453-7.LiYP,Pan