-2-2實驗材料與方法2.1實驗材料2.1.1主要的實驗藥品與試劑表2.SEQ表2-\*ARABIC1主要實驗藥品Table2.SEQTable2-\*ARABIC1Mainexperimentaldrug試劑名稱純度生產廠家氯氰菊酯分析純山東恒利達生物科技有限公司硫酸分析純汕滇藥業(yè)有限公司鉬酸銨分析純國藥集團化學試劑有限公司孔雀石綠分析純天津市致遠化學試劑有限公司磷酸二氫鉀分析純天津市風船化學試劑科技有限公司聚乙烯醇分析純天津市風船化學試劑科技有限公司氯化鈣分析純國藥集團化學試劑有限公司喹巴因分析純Sigma-Aldrich氯化鎂分析純成都市隆基化學品有限公司氯化鉀分析純國藥集團化學試劑有限公司Tris分析純上海吉至生化科技有限公司鹽酸分析純汕滇藥業(yè)有限公司無水乙醇分析純四川西隴科學有限公司三氯醋酸分析純國藥集團化學試劑有限公司ATP分析純上海吉至生化科技有限公司

2.1.2主要儀器設備表2.SEQ表2-\*ARABIC2主要儀器設備Table2.SEQTable2-\*ARABIC2Maininstrumentsandequipment儀器名稱型號生產廠家紫外分光光度計721型上海洪紀儀器設備有限公司電磁力攪拌器HJ-6常州澳華儀器有限公司電熱恒溫鼓風干燥箱YLD-300上海躍進醫(yī)療器械有限公司智能高速冷凍離心機3H20RI湖南赫西儀器裝備有限公司電熱恒溫水浴鍋DK-98-Ⅱ天津市泰斯特儀器有限公司電子分析天平AR224NC奧豪斯儀器有限責任公司2.1.3受試生物 表2.3受試生物條件Table2.3Testorganismconditions受試生物條件生物赤子愛勝蚓長度5-6厘米體重0.4-0.5克月齡5-6個月齡室內溫度15-30℃室內濕度40-60%2.1.4供試土壤在這個實驗中，供試土壤選取了云南本地土壤，pH值為6.65。這種選擇是為了確保實驗所用土壤與當地土壤環(huán)境相符，有利于實驗結果的準確性和可靠性。在采集土壤后，需要進行一些處理和檢測步驟，以確保土壤的適用性和質量：檢測土壤中是否含有氯氰菊酯等有害物質。這是為了排除土壤中有害化學物質對實驗結果的影響，確保實驗的安全性和可靠性；土壤需自然風干晾曬。這個步驟有助于去除土壤中的過量水分，減少土壤中微生物和細菌的數量，以確保實驗的準確性；對大顆粒的土壤進行粉碎過篩。這樣可以使土壤顆粒均勻細小，有利于蚯蚓在土壤中的生活和活動，也有助于實驗中的操作和觀察。通過這些處理步驟，可以保證土壤的適用性和質量，為實驗提供一個穩(wěn)定和可靠的環(huán)境。2.2實驗方法2.2.1蚯蚓的預飼養(yǎng)實驗開始前，稱取300克土壤和10克牛糞，放入干凈的盆中，使用蒸餾水將土壤和牛糞混合物充分濕潤，攪拌至濕潤且無塊狀。確保土壤和牛糞混合物均勻濕潤，以提供蚯蚓生長和飼養(yǎng)所需的濕度環(huán)境。在飼養(yǎng)過程中，維持溫度在25±1℃。可以使用恒溫器或其他恒溫設備來控制溫度，確保蚯蚓處于適宜的生長溫度范圍內。土壤的濕度要保持在40%，通過定期檢查和補充水分來保持土壤的濕潤程度。干燥或過濕的土壤都會影響蚯蚓的生長和活動。飼養(yǎng)周期為一周，這段時間內要確保蚯蚓得到充分的營養(yǎng)和適宜的生存條件，以使其達到實驗所需的狀態(tài)。2.2.2蚯蚓染毒實驗在電子分析天平上稱取1g十二烷基硫酸鈉，將其溶解在少量蒸餾水中，加入1mL氯氰菊酯的初始溶液，混合均勻，轉移到100mL容量瓶中進行定容，然后放置保存。將該溶液分別稀釋到4mgkg-1和6mgkg-1的氯氰菊酯，制備試驗所需的氯氰菊酯溶液。表2.4染毒步驟Table2.4Poisoningsteps序號蚯蚓數目（條）土的質量（g）氯氰菊酯濃度（mgkg-1）染毒數量（杯）染毒周期（天）A10300空白321、28、35、42、56B1030043C10300632.2.3蚯蚓組織酶液的制備分別從空白、4mgkg-1、6mgkg-1濃度組的染毒蚯蚓中篩選出三條大小適宜、健康活躍且生殖環(huán)明顯的蚯蚓，去除蚯蚓體表殘留土壤。在電子分析天平上稱其重量，并做好記錄。隨后將選好的蚯蚓置于提前準備裝有去離子水的燒杯中，待蚯蚓體內土壤和雜物完全排除后，移至盛有濃度為70%酒精的小燒杯中進行麻醉處理；待其麻醉后，取出并使用濾紙吸干其表面水分，隨后將其轉移至解剖盤中進行解剖。將蚯蚓儲精囊取出，分別放于冷卻的研缽中，并加入2mL0.3mol/L的Tris-HCl溶液在研缽里研磨勻漿。將研磨液轉移到離心管中，再用3mL0.3mol/L的Tris-HCL溶液清洗，合并洗液5mL，將以上各組樣品離心管置于離心機內，在4000r/min條件下離心10min后，將各組樣品放入冰箱內冷藏，取上清液備用。2.2.4磷標準曲線的制作基本原理：孔雀綠法是一種用于無機磷分析的高靈敏度方法，這種方法的核心在于孔雀綠分子結構能夠隨溶液酸度的變化而發(fā)生改變。在酸性條件下，孔雀綠這種堿性染料能夠與磷鉬雜多酸發(fā)生反應，生成一種綠色的離子締合物。為了確保這個顯色反應的穩(wěn)定性，通常會添加聚乙烯醇（PVA）作為穩(wěn)定劑。這樣，就能形成一個穩(wěn)定的磷鉬雜多酸－孔雀綠－PVA離子締合物。通過分光光度計測定其吸光度，在波長為643nm處用可見分光光度法測定吸光值，制作磷標準曲線。試劑的配置表2.5試劑的配置方法Table2.5ReagentConfigurationMethods試劑配制方法（4.2%）鉬酸銨的3.5molL-1硫酸溶液稱取4.2g的四水合鉬酸銨于小燒杯中，加入3.5molL-1的硫酸溶液與其混合，然后轉移到100ml容量瓶中并定容至100ml。搖勻，貼標簽備用。（0.05%）孔雀綠溶液稱取0.05g的孔雀綠于小燒杯中，用一定的蒸餾水溶解，然后轉移到100ml容量瓶中并定容至100ml。搖勻，貼標簽備用。顯色液（現配）4.2%鉬酸銨溶液的3.5molL-1硫酸溶液和0.05%孔雀綠溶液混合，比例是1：3，然后用電磁力攪拌器攪拌30分鐘，濾紙過濾備用。磷標準溶液的配置（40ugmL-1）取4.3943g的磷酸二氫鉀（105℃烘干）于小燒杯中，加去離子水溶解，然后轉移至1000mL的容量瓶，用去離子水定容至刻度線，搖勻，貼標簽備用得到溶液1。然后在取1mL溶液1用去離子水定容至1000mL的容量瓶得到溶液2。最后取4ml溶液2用去離子水定容至100ml的容量瓶得到溶液3。此時磷標準液體濃度為40μgmL-1。PVA（1%）取1g的聚乙烯醇于小燒杯中加80ml熱水溶解，冷卻轉移至100mL容量瓶。用去離子水定容至刻度線，搖勻，貼標簽備用。（3）標準曲線的測定表2.6磷標準曲線的測定方法Table2.6Determinationofphosphorusstandardcurve試管編號1234磷標濃度（ugL-1）1.21.62.02.4磷標體積（mL）3456水（mL）3210顯色液（mL）2222222222222222PVA（mL）2222222222222222根據圖2.6所示步驟，取潔凈干燥離心管，加入磷標準液體、水和顯色液混合均勻，冰浴靜置反應5min后，加入PVA，振動離心管使其充分混合，隨即放置試管架冰浴反應60min，反應完全后，移入分光光度計，將波長調節(jié)為643nm，利用可見分光光度法測定吸光值，進行數據記錄處理，繪制磷標準曲線。磷標準曲線繪制數據表2.7磷標準曲線的測定數據Table2.7Measurementdatafromthephosphorusstandardcurve磷標濃度（μg/L）1.21.62.02.4吸光度值0.010.0130.0180.0222.2.5Ca2+-ATP酶的活性測定(1)Ca2+-ATP酶反應液的配制表2.8Ca2+-ATP酶反應液的配制Table2.8PreparationofCa2+-ATPasereactionsolution試劑配制方法Tris-HCl（250mmolL-1）取50mL0.2molL-1Tris加42mL0.3molL-1HCL混合均勻后轉移至100mL容量瓶。用去離子水定容至刻度線，搖勻，貼標簽備用。CaCl2（15mmolL-1）稱取0.1665g的CaCl2用去離子水溶解后轉移至100mL容量瓶。用去離子水定容至刻度線，搖勻，貼標簽備用。喹巴因(3mmolL-1)稱取0.2210ｇ的喹巴因用去離子水溶解后轉移至10mL容量瓶。用去離子水定容至刻度線，搖勻，貼標簽備用。表2.9反應液的配制Table2.9Preparationofreactionsolutions250mmolL-1Tris-HCI15mmolL-1CaCl23mmolL-1喹巴因水總體積0.6mL1mL0.5mL0.9mL3mLATP酶的測定方法表2.10ATP酶的測定Table2.10DeterminationofATP酶組號反應液體體積酶液體積ATP三氯醋酸水顯色劑PVA（mL）A0.1mL0.4ug0.01mL0.05mL3mL2mL2mLB0.1mL0.4ug0.01mL不加3mL2mL2mL按照表2.4先加入反應液、酶液后水浴37℃加熱5min，然后加入ATP，繼續(xù)水浴37℃加熱5min后依次加入三氯醋酸溶液、水、顯色劑靜置5min后加入PVA溶液，等待1h后，在643nm波長下測定吸光度值，根據磷的標準曲線方程計算出磷含量，最后計算出酶活力。2.2.6精子畸形率的測定方法（1）樣本的制備：分別從空白、4mgkg-1、6mgkg-1濃度組的染毒蚯蚓中篩選出三條大小適宜、健康活躍且生殖環(huán)明顯的蚯蚓，用去離子水去除蚯蚓體表殘留土壤，再用70%乙醇麻醉，然后按其組織結構對其進行解剖，取出蚯蚓儲精囊備用，再取干燥潔凈的離心管加入1mL生理鹽水或取盛有2mL生理鹽水的平皿，將所取儲精囊置于其中，用剪子剪碎或用針對其進行擠壓，使其精液流出，用吸管將懸液輕輕吹打5-6次，然后靜置3-5min，輕輕搖晃振蕩，制得精子懸液。（2）制備涂片：用去離子水清洗載玻片和蓋玻片，待徹底清洗干凈，放置70%的乙醇溶液中浸泡洗滌，然后取出進行干燥。最后滴加一滴精子懸液于載玻片上，取蓋玻片（要求邊緣光滑）與放置樣品的載玻片呈35°并輕輕滑動，均勻地將樣品涂于載玻片上，自然風干擺放，制作三組濃度的涂片，每組實驗制片三張。（3）染色過程：1.將制得的涂片干燥后滴加2ml的試劑Diff-QuikⅠ進行染色，固定15～20s，將載玻片直立于吸水紙上以去除多余的液體，不需要用流水沖洗。等待干燥。2.向載玻片上滴加2ml試劑Diff-QuikⅡ進行染色，染色10～20s，將載玻片直立于吸水紙上以去除多余的液體，不需要用流水沖洗。等待干燥。3.向載玻片上滴加2ml的試劑Diff-QuikⅢ進行染色，染色5～10s，將載玻片直立于吸水紙上以去除多余的液體，等待干燥。再用蒸餾水輕輕沖洗10～15次以去除多余的染液。（4）精子形態(tài)觀察制作好三組不同濃度的精子涂片后，可以進行顯微鏡觀察。首先，將載玻片放入顯微鏡平臺上，調節(jié)鏡頭焦距和光線亮度，找到合適的放大倍數。然后，逐一觀察三組不同濃度的涂片，注意觀察精子的形態(tài)情況?？梢杂涗浵掠^察到的精子的頭部形狀、尾部長度等特征，并比較不同濃度涂片之間的異同。2.3數據分析本實驗做出的數據統計全部都是通過Ecxel、Origin2021作圖。3結果與討論3.1磷標準曲線的測定圖3.1磷標準曲線Figure3.1PhosphorusStandardCurve磷標準曲線如圖3.1所示，用分別配置1.2ugL-1、1.6ugL-1、2ugL-1、2.4ugL-1的不同濃度梯度磷標準溶液，通過紫外可見分光光度計，調節(jié)波長并測定磷標準溶液樣品吸光度，對所測數據記錄分析后，以磷標準溶液的濃度梯度為橫坐標，紫外分光光度計所測吸光度為縱坐標繪制磷標準曲線圖，得到磷標準曲線，所得趨勢線方程為Y=0.0103X-0.0027相關系數R2=0.9917，相關系數R2達到樣品檢測所需值，可以準確測定643nm處吸光值。3.2低濃度下氯氰菊酯對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶的活性影響圖3.2低濃度下氯氰菊酯對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶的毒性影響Figure3.2ToxiceffectsofcypermethrinonCa2+-ATPaseofearthwormseminalvesiclesatlowconcentrations低濃度（4mgkg-1）的氯氰菊酯暴露對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶的活性影響如圖3.2所示?？梢钥闯鲈趯嶒炦^程中，實驗組蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性在試驗周期內顯著低于空白組，表明農藥污染物對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性可能起到了抑制作用，隨著污染暴露時長的不斷疊加，實驗組蚯蚓的儲精囊Ca2+-ATP酶的活性在第21-35天周期內呈下降趨勢，第35天時蚯蚓的儲精囊Ca2+-ATP酶活性降低至最小值，而第35-56天暴露周期內，蚯蚓的儲精囊Ca2+-ATP酶活性逐漸增強。導致該趨勢的原因可能是一開始蚯蚓接觸到的氯氰菊酯濃度較高從而對Ca2+-ATP酶活性起較強的抑制作用，但隨著暴露時間延長，部分氯氰菊酯發(fā)生了降解，因此對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性的抑制作用沒有一開始的強。此外蚯蚓體內可能產生了一定的抗藥性，因此蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性有所恢復，但是氯氰菊酯對Ca2+-ATP酶活性的影響并不可逆，因此Ca2+-ATP酶活性仍低于空白組。儲精囊是蚯蚓的重要生殖器官，是影響蚯蚓生殖繁育的關鍵場所，氯氰菊酯染毒暴露作用會不同程度上的降低其中含有的Ca2+-ATP酶活性下降，間接損傷儲精囊，減弱蚯蚓的生殖繁育功能，破壞蚯蚓生物多樣性。蚯蚓長期生存在遭受氯氰菊酯污染暴露的環(huán)境中，會使其生殖系統的發(fā)育變得遲鈍緩慢，造成機體無法正常新陳代謝和成長，雖然蚯蚓在暴露后期有所恢復，但是可能產生不可逆的毒性作用。由此也可以證明，氯氰菊酯的污染作用會抑制蚯蚓體內酶活性，對蚯蚓的生殖部位造成損傷。3.3高濃度下氯氰菊酯對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶的活性影響圖3.3高濃度下氯氰菊酯對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶的毒性影響Figure3.3ToxiceffectofcypermethrinonCa2+-ATPaseofearthwormseminalvesicleathighconcentration高濃度（6mgkg-1）的氯氰菊酯暴露對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶的活性影響如圖3.3所示。分析可得，在染毒暴露過程中，空白組中蚯蚓的儲精囊Ca2+-ATP酶的活性差異變化趨于相對穩(wěn)定狀態(tài)；而實驗組中受試蚯蚓的儲精囊Ca2+-ATP酶的活性波動明顯，整體呈現先下降后上升趨勢。暴露第35天時，實驗組中受試蚯蚓的儲精囊Ca2+-ATP酶的活性達到最小值。暴露第42天后，處理組中蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶的活性呈現恢復態(tài)勢且仍低于空白組。導致該趨勢的原因可能是一開始蚯蚓接觸到的氯氰菊酯濃度較高從而對Ca2+-ATP酶活性起較強的抑制作用，但隨著暴露時間延長，部分氯氰菊酯發(fā)生了降解，因此對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性的抑制作用沒有一開始的強。此外蚯蚓體內可能產生了一定的抗藥性，因此蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性有所恢復，但是氯氰菊酯對Ca2+-ATP酶活性的影響并不可逆，因此Ca2+-ATP酶活性仍低于空白組。3.4不同濃度下氯氰菊酯對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶的活性影響3.4不同濃度下氯氰菊酯對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶的活性影響3.4EffectsofcypermethrinonCa2+-ATPaseactivityofearthwormseminalvesiclesatdifferentconcentrations不同濃度（4mgkg-1和6mgkg-1）的氯氰菊酯暴露對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性的影響如圖3.4所示。可以看出蚯蚓暴露于不同濃度（4mgkg-1和6mgkg-1）氯氰菊酯，其蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性隨時間增長呈現下降趨勢，在第35天時染毒組中蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性達到最小值。在第42天時，染毒實驗組中蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性有所回升，但仍低于空白組。在同一染毒暴露周期內，4mgkg-1和6mgkg-1染毒組相比較，高濃度組（6mgkg-1）蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性明顯低于低濃度組（4mgkg-1）。這表明氯氰菊酯的濃度增加，對蚯蚓的儲精囊Ca2+-ATP酶活性抑制加重，對蚯蚓儲精囊生殖毒性就越強。在染毒暴露初期,氯氰菊酯逐漸發(fā)揮毒性作用，隨土壤富集在蚯蚓體內，損傷其酶活性，致使蚯蚓的儲精囊Ca2+-ATP酶活性受到抑制，不同程度的損傷儲精囊。但隨著暴露時間的推移，經過長時間農藥污染暴露的影響，結合蚯蚓自身的機體修復能力，同時，土壤中的部分氯氰菊酯逐漸降解，濃度較暴露前期有所降低，并且蚯蚓蓄積農藥量趨于極限值，吸收蓄積能力減弱，也形成了可抗拒毒素的抗毒性，另外蚯蚓生殖系統內殘留的農藥量也開始緩慢減少，因此，在染毒暴露后期，蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性有所恢復。實驗結果表明，氯氰菊酯的染毒暴露作用，是造成儲精囊Ca2+-ATP酶活性產生毒性影響重要因素，這種毒性影響具有單向性和不可逆性的特點，由此也可以證明，氯氰菊酯可通過損傷降低儲精囊Ca2+-ATP酶酶活性，進而損傷蚯蚓的生殖部位，并隨時間的逐漸推移疊加損傷更加嚴重，從而抑制了蚯蚓的生殖系統發(fā)育，阻礙其繁衍。儲精囊是精子儲存的重要場所，而Ca2+-ATP酶是存在于組織細胞及細胞器的膜上的一種蛋白酶，是精子產生和發(fā)育過程中重要的能量來源。所以降低儲精囊Ca2+-ATP酶的酶活性，會導致精子活力減弱，質量下降，甚至造成精子畸形。3.5精子形態(tài)比較空白組蚯蚓精子正常形態(tài)如圖3.5.1所示，未受氯氰菊酯損害的精子整體染色均勻，頭部未出現腫脹，并且頭尾連接完整。染毒實驗組蚯蚓精子畸形形態(tài)如圖3.5.2所示，精子形態(tài)畸形表現為頭部畸形、體部畸形和尾部畸形等。頭部畸形：頭部偏離正常大小范圍值、樣式各式各樣無固定形狀、出現雙頭畸形等。精子受精能力受頭部影響，若頭部發(fā)生畸形，精子受精能力將大幅下降甚至缺失。體部畸形：主要表現為體部異常粗大、精體出現斷裂折裂、不完整等。體部發(fā)生畸形時，精子運動能力可能會因此下降，影響受精過程的正常進行。尾部畸形：尾部卷曲、雙尾、缺尾等畸形時可能影響精子的游動能力和受精能力。圖3.5.1正常精子圖3.5.2畸形精子Figure3.5.1NormalspermatozoaFigure3.5.2Malformedspermatozoa3.6低濃度氯氰菊酯對蚯蚓精子畸形率的影響3.6低濃度氯氰菊酯對蚯蚓精子畸形率的影響3.6Effectoflowconcentrationofcypermethrinonspermdeformitiesinearthworms低濃度（4mgkg-1）的氯氰菊酯暴露對蚯蚓畸形率的影響如圖3.6所示。在整個暴露過程中，空白組中蚯蚓精子畸形率差異小?？瞻捉M存在的精子畸形可能是解剖過程中人為導致的。而各染毒組中蚯蚓精子畸形率呈先上升后下降趨勢。暴露第42天時，處理組中蚯蚓精子畸形率達到最大值。暴露第56天后，處理組中蚯蚓精子畸形率呈現恢復態(tài)勢且仍高于空白組。導致該趨勢的原因可能是一開始蚯蚓接觸到的氯氰菊酯濃度較高從而對Ca2+-ATP酶活性起較強的抑制作用，導致精子供能不足，從而導致畸形率上升。但隨著暴露時間延長，部分氯氰菊酯發(fā)生了降解，因此對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性的抑制作用沒有一開始的強。精子獲能得到一定滿足，所以畸形率有所降低了。此外蚯蚓體內可能產生了一定的抗藥性，因此氯氰菊酯對蚯蚓儲精囊產生的傷害降低了，但是氯氰菊酯對儲精囊的傷害并不可逆，因此精子畸形仍高于空白組。3.7高濃度下氯氰菊酯對蚯蚓精子畸形率的影響3.7高濃度氯氰菊酯對蚯蚓精子畸形率的影響3.7Effectofhighconcentrationofcypermethrinonspermdeformitiesinearthworms高濃度（6mgkg-1）的氯氰菊酯暴露對蚯蚓畸形率的影響如圖3.7所示。在整個暴露過程中，空白組中蚯蚓精子畸形率差異小?？瞻捉M存在的精子畸形可能是解剖過程中人為導致的。染毒組中蚯蚓精子畸形率呈先上升后下降趨勢。暴露第42天時，處理組中蚯蚓精子畸形率達到最大值。暴露第56天后，處理組中蚯蚓精子畸形率呈現恢復態(tài)勢仍高于空白組。導致該趨勢的原因可能是一開始蚯蚓接觸到的氯氰菊酯濃度較高從而對Ca2+-ATP酶活性起較強的抑制作用，導致精子供能不足，從而導致畸形率上升。但隨著暴露時間延長，部分氯氰菊酯發(fā)生了降解，因此對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性的抑制作用沒有一開始的強。精子獲能得到一定滿足，所以畸形率有所降低了。此外蚯蚓體內可能產生了一定的抗藥性，因此氯氰菊酯對蚯蚓儲精囊產生的傷害降低了，但是氯氰菊酯對儲精囊的傷害并不可逆，因此精子畸形仍高于空白組。3.8不同濃度氯氰菊酯對蚯蚓精子畸形率的影響3.8不同濃度氯氰菊酯對蚯蚓精子畸形率的影響3.8Effectofdifferentconcentrationsofcypermethrinonspermdeformitiesinearthworms不同濃度（4mgkg-1和6mgkg-1）的氯氰菊酯暴露對蚯蚓精子畸形率的影響如圖3.8所示?？梢钥闯鲵球颈┞队诓煌瑵舛龋?mgkg-1和6mgkg-1）氯氰菊酯，其蚯蚓精子畸形率隨時間增長呈現上升趨勢，并在暴露42天時達到最大值。但在暴露56天時，蚯蚓精子開始恢復正常，畸形率逐漸降低。在同周期染毒暴露時間段，4mgkg-1和6mgkg-1染毒實驗組相比，高濃度實驗組（6mgkg-1）中蚯蚓精子畸形率明顯高于低濃度實驗組（4mgkg-1）。這表明隨著氯氰菊酯的濃度增加，蚯蚓精子畸形率概率增加。在染毒暴露第42天及以前，6mgkg-1實驗組中蚯蚓精子畸形率最高，空白組畸形率最低，而4mgkg-1的染毒實驗組畸形率則介于高濃度實驗組和空白組之間。這表明氯氰菊酯劑量是影響精子正常與否的重要指標，劑量越高對蚯蚓儲精囊生殖毒性破壞作用就越強。但是在暴露第56天的時候，高濃度組（6mgkg-1）的蚯蚓精子畸形率比低濃度組（4mgkg-1）低?？赡苁球球緦Ω邼舛嚷惹杈挣ギa生了更強的抗藥性。3結果與分析4結論本實驗研究不同的濃度氯氰菊酯對蚯蚓儲精囊中Ca2+-ATP酶活性和精子畸形的影響，通過實驗發(fā)現：在氯氰菊酯農藥的染毒暴露過程中，使用4mgkg-1和6mgkg-1劑量的農藥對蚯蚓進行污染暴露作用，會造成儲精囊損傷，不同濃度的氯氰菊酯對蚯蚓的儲精囊Ca2+-ATP酶活性也均表現為抑制作用，且都低于空白組的正常范圍值。其中，高濃度(6mgkg-1)氯氰菊酯對蚯蚓儲精囊損傷程度更明顯；同時，除染毒周期長短外，氯氰菊酯農藥濃度劑量也是引起蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶活性變化的重要因素。在氯氰菊酯農藥的染毒周期中，不同濃度（4mgkg-1和6mgkg-1）劑量對蚯蚓精子畸形率隨時間增長呈現上升趨勢，且都高于空白組。隨著暴露時間的增加，蚯蚓精子畸形率呈現上升趨勢。這表明隨著污染時間在增加，蚯蚓的精子畸形率概率上升。綜上所述：通過對蚯蚓儲精囊Ca2+-ATP酶進行檢測分析，土壤中氯氰菊酯農藥的毒性對Ca2+-ATP酶是有一定的影響，毒性越強，對Ca2+-ATP酶的活性起到抑制作用就越強，由此表明氯氰菊酯暴露作用會對蚯蚓的生殖繁育產生生殖毒性，造成生殖毒性影響。該研究結果可作為土壤中氯氰菊酯農藥污染風險監(jiān)測的重要依據，為我國農業(yè)技術發(fā)展和農業(yè)安全生產提供技術支持。參考文獻BednarskaAJ,ChoczyńskiM,LaskowskiR,etal.Combinedeffectsofchlorpyriphos,copperandtemperatureonacetylcholinesteraseactivityandtoxicokineticsofthechemicalsintheearthwormEiseniafetida[J].EnvironmentalPollution,2017.無.國家市場監(jiān)督管理總局市場監(jiān)管總局關于特種設備行政許可有關事項的公告(2021年第41號)[J].西部特種設備,2022,(1):5-15.RajanDK,MohanK,RajarajeswaranJ,etal.Toxiceffectsoforganophosphatepesticidemonocrotophosinaquaticorganisms:Areviewofchallenges,regulationsandfutureperspectives[J].EnvironmentalResearch,2023:117947.BuralliRJ,DultraAF,RibeiroH.RespiratoryandallergiceffectsinchildrenexposedtoPesticides—Asystematicreview[J].Internationaljournalofenvironme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