基因工程制藥（2）

第三章基因工程制藥2上次課內(nèi)容的回顧(1)基因工程對藥物改造的應用實例利用基因工程生產(chǎn)藥物的優(yōu)點第三章基因工程制藥2上次課內(nèi)容的回顧(2)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品有什么優(yōu)點？①大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽；②可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便進行深入的研究③可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；④內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不足可以改造；⑤利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。第三章基因工程制藥2基因工程制藥1982年第一個基因工程產(chǎn)品--人胰島素在美國問世。第三章基因工程制藥2第三節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)

的基本過程

基因工程技術(shù)是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細胞，構(gòu)建成工程菌(或細胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進行復制和表達的技術(shù)。第三章基因工程制藥2基因工程基本過程第三章基因工程制藥2基因工程制藥的主要程序⒈目的基因的克?、矘?gòu)建DAN重組體⒊DAN重組體轉(zhuǎn)入宿主菌⒋工程菌發(fā)酵(發(fā)酵罐1；2)5.表達產(chǎn)物的分離純化

6.產(chǎn)品的檢驗等第三章基因工程制藥2制備基因工程藥物的一般程序獲得目的基因組建重組質(zhì)粒構(gòu)件基因工程菌或細胞培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定成品檢定包裝第三章基因工程制藥2下游階段是將實驗室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，它主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計和制造，電子計算機的優(yōu)化控制等。第三章基因工程制藥2工程菌的發(fā)酵工藝不同于傳統(tǒng)的抗生素和氨基酸發(fā)酵，需要對影響目的基因表達的因素進行分析，并對各種影響因素進行優(yōu)化，建立適于目的基因的高效表達發(fā)酵工藝，以便獲得較高產(chǎn)量的目的基因表達產(chǎn)物。為了獲得合格的目的產(chǎn)物的產(chǎn)品，需要建立一系列的、相應的分離純化、質(zhì)量控制、產(chǎn)品保存等技術(shù)。第三章基因工程制藥2生物制藥中所用菌種的獲得途徑：誘變育種基因工程構(gòu)建細胞工程自然界分離第三章基因工程制藥2基因工程藥物的生產(chǎn)過程上游構(gòu)建（基因工程）發(fā)酵生產(chǎn)（發(fā)酵工程）純化制備

第三章基因工程制藥2一、構(gòu)建過程示意圖①②③④⑤⑥①從細胞中分離出目的DNA②限制酶截取DNA片斷③分離表達載體（質(zhì)粒等）④DNA重組⑤用重組后的載體轉(zhuǎn)化宿主細胞⑥培養(yǎng)宿主細胞克隆大量基因第三章基因工程制藥2第四節(jié)目的基因的獲得應用基因工程技術(shù)生產(chǎn)新型藥物，首先必須構(gòu)建一個特定的目的基因無性繁殖系，即產(chǎn)生各種新藥的不同的基因工程菌株。來源于真核細胞的產(chǎn)生基因工程藥物的目的基因，是不能進行直接分離的。所以，需要采用一些技術(shù)獲得真核細胞的基因用于新型藥物的合成。第三章基因工程制藥2克隆真核基因的方法

克隆真核基因常用方法：逆轉(zhuǎn)錄法和化學合成法，RT-PCR。

一、逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，在反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行cDNA

的克隆表達。第三章基因工程制藥2為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì)多肽的DNA序列，可以從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細胞中提取mRNA，以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì)mRNA的互補DNA(cDNA的第一鏈)，再以cDNA第一鏈為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶Ⅰ(或者Klenow酶大片段)作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA序列。第三章基因工程制藥2cDNA克隆示意圖第三章基因工程制藥2一、逆轉(zhuǎn)錄法步驟

⒈mRNA的純化⒉cDNA第一鏈的合成⒊cDNA第二鏈的合成⒋cDNA的克隆(載體)⒌將重組體導入宿主細胞⒍cDNA文庫的鑒定⒎目的cDNA克隆的分離和鑒定第三章基因工程制藥2二、RT-PCR法1985年聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)創(chuàng)立后，將它與逆轉(zhuǎn)錄方法結(jié)合起來，得到一種新的合成cDNA的方法，即逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應法（RT-PCR）。該方法是mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，不需再合成cDNA第二鏈，而是在特異引物協(xié)助下，用PCR法進行擴增，特異地合成目的cDNA鏈，用于重組、克隆。第三章基因工程制藥2

具備的條件：較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。三、化學合成法第三章基因工程制藥2三、化學合成法（2）

用化學法合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火，成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進行退火使連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。第三章基因工程制藥2人工化學合成基因的限制（1）

⒈不能合成太長的基因。目前DNA

合成儀所合成的寡核苷酸片段為50～60bp，因此只適用于克隆小分子肽的基因。第三章基因工程制藥2人工化學合成基因的限制（2）

⒉遺傳密碼的簡并使選擇密碼子困難，用氨基酸順序推測核苷酸序列，得到的結(jié)果可能與天然基因不完全一致，易造成中性突變。

⒊費用高。第三章基因工程制藥2四、其他方法1、編碼序列富集法2、島嶼獲救PCR法3、動物雜交法4、功能克隆法5、構(gòu)建cDNA文庫6、差異顯示技術(shù)的應用7、對已發(fā)現(xiàn)基因的改造第三章基因工程制藥21、編碼序列富集法利用磁場力對cDNA文庫中的目的基因進行富集的一種技術(shù)。將質(zhì)粒DNA庫用識別位點較多的酶酶切后連上接頭，用5′端用生物素標記的與接頭序列相同的引物進行PCR擴增。將cDNA文庫的插入片段同樣擴增后，兩者雜交得到帶有生物素的DNA雙鏈，當溶液中加入含有磁珠核心的鏈霉抗生素蛋白時，DNA雙鏈結(jié)合到磁株上，在外加磁場的作用，目的基因與其他的DNA片段分離，達到富集的目的。第三章基因工程制藥22、島嶼獲救PCR法直接從已測序的基因組DNA上尋找編碼序列，通過計算機分析找出開放閱讀框，采用外顯子陷阱法和尋找CpG島的方法克隆編碼基因。第三章基因工程制藥23、動物雜交法許多基因由于進化過程中存在保守性而在人和其他物種中具有高度同源性，因此利用已知序列的其他物種的基因從構(gòu)建的人基因組文庫或cDNA文庫中可以將目的基因調(diào)出。第三章基因工程制藥24、功能克隆法依賴于基因表達產(chǎn)物和生物學功能的基因克隆法稱為功能克隆法。該法不適于在不知道基因相關(guān)功能信息的條件下有效地可隆新的基因。可采用基因敲除技術(shù)、RNA干擾技術(shù)、酵母雙雜交技術(shù)、高通量表達技術(shù)及流式細胞技術(shù)等手段，從基因水平、表達調(diào)控水平、蛋白質(zhì)水平、細胞水平獲得基因功能信息。第三章基因工程制藥25、構(gòu)建cDNA文庫通過表達序列標簽(expressedsequencetag,EST)進行基因作圖和基因組序列中編碼序列的鑒別，EST能提供設(shè)計引物的足夠信息，可以用PCR技術(shù)擴增基因組中特異片段，是一種有用的DNA位標。第三章基因工程制藥26、差異顯示技術(shù)的應用用mRNA差異顯示技術(shù)、減數(shù)PCR技術(shù)、差減雜交技術(shù)尋找新基因。如通過正常組織和腫瘤組織某些基因和蛋白質(zhì)的差異表達，尋找在腫瘤細胞中的高表達基因或沉默基因，從而推測其可能是癌基因或抑癌基因。第三章基因工程制藥27、對已發(fā)現(xiàn)基因的改造用基因修飾或點突變技術(shù)以提高目的基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性和體內(nèi)的半衰期，提高表達產(chǎn)物的生物學活性，降低有效使用劑量或提高