無錫市中醫(yī)院科研實驗技術(shù)（如ELISA、分子生物學(xué)）操作考核一、單項選擇題（共10題，每題2分，合計20分）1.ELISA實驗中，用于封閉非特異性結(jié)合位點最常用的試劑是？A.HRP標(biāo)記的抗體B.稀釋的樣本C.牛血清白蛋白（BSA）或脫脂奶粉D.洗滌緩沖液2.在PCR實驗中，引物退火溫度的確定主要依據(jù)是？A.DNA模板的長度B.引物的GC含量C.儀器的品牌D.實驗者的經(jīng)驗3.WesternBlot實驗中，用于轉(zhuǎn)移蛋白的膜材料最常用的是？A.PVDF膜B.涂蠟玻璃膜C.硝酸纖維素膜（NC膜）D.尼龍膜4.ELISA實驗中，酶標(biāo)儀檢測的波長范圍通常在？A.200-300nmB.300-400nmC.450-600nmD.700-800nm5.RNA提取時，為防止RNA降解，應(yīng)使用？A.高濃度氯仿B.無RNA酶的試劑C.高溫加熱D.金屬離子催化劑6.PCR實驗中，加入dNTPs的目的是？A.延長引物鏈B.增強退火效率C.提供合成DNA的原料D.抑制非特異性擴增7.ELISA實驗中，辣根過氧化物酶（HRP）常用于哪種檢測模式？A.直接法B.間接法C.競爭法D.雙抗體夾心法8.在Real-TimePCR實驗中，熒光染料SYBRGreenI的作用是？A.特異性地結(jié)合RNAB.特異性地結(jié)合DNAC.抑制引物二聚體形成D.增強擴增效率9.WesternBlot實驗中，一抗通常需要孵育多久？A.30分鐘B.1小時C.4小時（室溫）或過夜（4℃）D.12小時10.細(xì)胞培養(yǎng)過程中，用于胰酶消化貼壁細(xì)胞的最佳濃度是？A.0.25%B.0.5%C.1.0%D.2.0%二、多項選擇題（共5題，每題2分，合計10分）1.ELISA實驗中，洗滌步驟的主要目的是？A.去除未結(jié)合的試劑B.增強信號強度C.減少背景干擾D.促進酶與底物的結(jié)合2.PCR實驗中，影響退火溫度的因素包括？A.引物的GC含量B.引物的長度C.DNA模板的復(fù)雜度D.儀器的性能3.WesternBlot實驗中，增強信號常用的方法包括？A.稀釋一抗?jié)舛菳.延長二抗孵育時間C.使用增強化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒D.增加抗體濃度4.RNA提取過程中，為提高效率可采取的措施有？A.使用酸性溶液裂解細(xì)胞B.加入氯仿進行有機抽提C.使用商業(yè)化的RNA提取試劑盒D.預(yù)處理樣本以去除抑制劑5.細(xì)胞培養(yǎng)過程中，影響細(xì)胞生長的因素包括？A.溫度和CO?濃度B.培養(yǎng)基成分C.細(xì)胞密度D.細(xì)胞污染三、判斷題（共10題，每題1分，合計10分）1.ELISA實驗中，樣本濃度越高，吸光度值越大。（×）2.PCR實驗中，引物二聚體過多會導(dǎo)致擴增效率降低。（√）3.WesternBlot實驗中，一抗和二抗不能同時使用。（×）4.RNA提取時，使用酚-氯仿法可有效去除蛋白質(zhì)。（√）5.Real-TimePCR實驗中，使用探針法比染料法更靈敏。（√）6.細(xì)胞培養(yǎng)過程中，無菌操作是保證實驗結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。（√）7.ELISA實驗中，封閉時間過長會導(dǎo)致信號增強。（×）8.PCR實驗中，退火溫度過高會導(dǎo)致引物結(jié)合效率降低。（√）9.WesternBlot實驗中，膜封閉不充分會導(dǎo)致背景過高。（√）10.細(xì)胞培養(yǎng)過程中，使用胰酶消化時間過長會損傷細(xì)胞。（√）四、簡答題（共5題，每題4分，合計20分）1.簡述ELISA實驗的基本步驟。2.解釋PCR實驗中引物設(shè)計的基本原則。3.描述WesternBlot實驗中一抗和二抗的作用。4.說明RNA提取過程中防止降解的注意事項。5.列舉細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的污染類型及預(yù)防措施。五、操作題（共3題，每題10分，合計30分）1.假設(shè)你需要檢測某樣本中某蛋白的表達水平，請設(shè)計一個WesternBlot實驗的基本流程，包括試劑準(zhǔn)備、關(guān)鍵步驟及注意事項。2.如果你要進行Real-TimePCR實驗檢測某基因的轉(zhuǎn)錄水平，請簡述實驗設(shè)計要點，包括引物設(shè)計、反應(yīng)體系及數(shù)據(jù)分析方法。3.在進行ELISA實驗時，如果發(fā)現(xiàn)背景過高，可能的原因有哪些？如何解決？答案與解析一、單項選擇題答案1.C2.B3.C4.C5.B6.C7.D8.B9.C10.A解析：1.ELISA實驗中，封閉非特異性結(jié)合位點常用BSA或脫脂奶粉，防止抗體與板孔直接結(jié)合。2.PCR引物退火溫度主要由GC含量決定，GC含量越高，Tm值越高。3.WesternBlot常用NC膜，因其蛋白結(jié)合能力強且穩(wěn)定。4.ELISA酶標(biāo)儀檢測常用450-600nm波長范圍，對應(yīng)HRP或AP的催化產(chǎn)物。5.RNA易降解，需使用無RNA酶試劑和低溫操作。6.dNTPs是DNA合成的原料，缺之無法延伸。7.雙抗體夾心法需HRP標(biāo)記的二抗檢測。8.SYBRGreenI特異性結(jié)合雙鏈DNA，用于Real-TimePCR定量。9.WesternBlot一抗孵育通常4小時（室溫）或過夜（4℃）以提高結(jié)合效率。10.胰酶消化細(xì)胞常用0.25%濃度，過高會損傷細(xì)胞。二、多項選擇題答案1.A,C2.A,B,C3.C,D4.A,B,C5.A,B,C,D解析：1.洗滌去除未結(jié)合試劑，降低背景干擾。2.引物GC含量、長度及模板復(fù)雜度均影響Tm值，進而決定退火溫度。3.增強信號可通過ECL試劑盒或提高抗體濃度。4.RNA提取需預(yù)處理樣本、使用試劑盒、有機抽提等提高效率。5.細(xì)胞生長受溫度、CO?、培養(yǎng)基、密度及污染等多因素影響。三、判斷題答案1.×2.√3.×（可同時使用）4.√5.√6.√7.×（過長封閉會飽和）8.√9.√10.√解析：1.樣本濃度過高可能超過線性范圍，需稀釋后再測。2.引物二聚體會競爭模板，降低擴增效率。3.一抗和二抗可同時孵育提高效率。4.酚-氯仿法通過有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)。5.探針法比染料法更靈敏，但成本更高。10.胰酶消化時間過長會損傷細(xì)胞膜。四、簡答題答案1.ELISA基本步驟：-板孔封閉→樣本或標(biāo)準(zhǔn)品孵育→一抗孵育→二抗孵育→底物孵育→酶標(biāo)儀檢測。2.PCR引物設(shè)計原則：-Tm值適中（55-65℃）→避免引物二聚體和非特異性結(jié)合→3'端G/C含量較高→無重復(fù)序列。3.WesternBlot抗體作用：-一抗識別目標(biāo)蛋白，二抗結(jié)合一抗，放大信號。4.RNA提取防止降解措施：-使用無RNA酶試劑→低溫操作→加入RNA酶抑制劑→快速離心。5.細(xì)胞培養(yǎng)污染及預(yù)防：-類型：細(xì)菌、真菌、支原體；預(yù)防：無菌操作、定期更換培養(yǎng)基、使用無菌耗材。五、操作題答案1.WesternBlot流程：-試劑：抗體、TBST、ECL試劑盒；步驟：膜封閉（2h）、一抗（4h或過夜）、二抗（1h）、洗滌（3次）、ECL發(fā)光、成像。-注意事項：抗體稀釋、避光孵育、膜保存。2.Real-TimePC