ICS65.020.20

B39

DB12

天津市地方標(biāo)準(zhǔn)

DB12/T1012—2020

食用菌液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范

Techniquestandardforliquidspawnproductionofediblemushroom

2020-12-17發(fā)布2021-01-16實(shí)施

天津市市場監(jiān)督管理委員會發(fā)布

DB12/T1012—2020

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市林業(yè)果樹研究所。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：羅瑩、周永斌、錢磊、劉連強(qiáng)、王文治、李鳳美、訾惠君、李淑芳。

I

DB12/T1012—2020

食用菌液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食用菌液體菌種的生產(chǎn)場地、設(shè)備設(shè)施、工藝流程、生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程、使用方法以及標(biāo)

簽、貯存。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食用菌液體菌種的生產(chǎn)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

GB/T12728食用菌術(shù)語

GB50073潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范

NY5099無公害食品食用菌栽培基質(zhì)安全技術(shù)要求

NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語和定義

GB/T12728界定的術(shù)語以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

罐壓jar-pressure

食用菌液體菌種培養(yǎng)過程中培養(yǎng)器保持的空氣壓力，單位：Mpa。

3.2

通風(fēng)量quantityofaeration

液體菌種培養(yǎng)過程中每分鐘通入培養(yǎng)基中的無菌空氣的量。用V/V（培養(yǎng)基體積/通入空氣體積）標(biāo)

示。

3.3

接種量inoculum

接入培養(yǎng)器中的菌種的數(shù)量，以菌種體積與培養(yǎng)基體積的百分比標(biāo)示。

3.4

液體菌種菌齡ageofliquidspawn

菌種接入培養(yǎng)基開始計(jì)算的液體菌種生長發(fā)育時(shí)間。

3.5

空消sterilizingfermentor

利用蒸汽對無物料的發(fā)酵罐及附屬設(shè)備進(jìn)行加熱滅菌的過程。

3.6

實(shí)消intermittentsterilization

1

DB12/T1012—2020

將蒸汽通入裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行加熱滅菌的過程。

3.7

搖瓶液體種liquidspawninshakeflask

裝在玻璃三角瓶內(nèi)在搖床上恒溫振蕩培養(yǎng)的液體菌種。

4要求

4.1生產(chǎn)場地

4.1.1基本要求

環(huán)境應(yīng)干凈整潔、空氣優(yōu)良、通風(fēng)良好、水源充足且符合GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)、排水暢通、

電源充足、交通便利。

4.1.2環(huán)境衛(wèi)生要求

應(yīng)符合NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程的規(guī)定。

4.2生產(chǎn)設(shè)備設(shè)施

4.2.1廠房設(shè)置和布局應(yīng)符合NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程要求。

4.2.2發(fā)酵間應(yīng)按照GB50073潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范執(zhí)行，地面應(yīng)能防水、防腐蝕、防滲漏、防滑，易清

洗，排水坡度1.0%～1.5%，排水溝必須是圓弧式不銹鋼的明溝；墻角為圓角，墻壁和天花板應(yīng)能防潮、

防霉、防水、易清洗。

4.2.3接種間應(yīng)按照GB50073潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范執(zhí)行，液體菌種接種間設(shè)置緩沖間；入口處設(shè)置洗手、

消毒和干手設(shè)施；車間設(shè)封閉式廢物桶，安裝排氣管道或者排風(fēng)設(shè)備，門窗應(yīng)設(shè)置防蚊蠅紗網(wǎng)。

4.2.4主要儀器設(shè)備應(yīng)配備水處理設(shè)備、液體菌種培養(yǎng)器、空氣壓縮機(jī)、空氣過濾器、液體菌種接種

器、高壓蒸汽滅菌鍋、蒸汽鍋爐、凈化工作臺、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、顯微鏡、磁力攪拌機(jī)、

磅秤、天平、酸度計(jì)等。在經(jīng)常停電的地方應(yīng)有自備電源（發(fā)電機(jī)）。

4.2.5主要生產(chǎn)用具應(yīng)配備玻璃三角瓶、接種器、試管、量杯量瓶、玻璃漏斗、定量定性濾紙、精密

pH試紙等生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)用品。

4.3培養(yǎng)基質(zhì)

原材料應(yīng)符合NY5099無公害食品食用菌栽培基質(zhì)安全技術(shù)要求的規(guī)定。

4.4生產(chǎn)品種

4.4.1選用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)、商品性好的食用菌品種，使用經(jīng)省級以上農(nóng)作物品種審定委員會

登記的品種，并且從具有相應(yīng)技術(shù)資質(zhì)的供種單位引種且種性清楚。

4.4.2菌種生產(chǎn)過程應(yīng)符合NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程的要求。

5液體菌種生產(chǎn)工藝

5.1工藝流程

見圖1。

2

DB12/T1012—2020

搖瓶菌種←活化←母種

↓

原料→培養(yǎng)基配制→空消→實(shí)消→冷卻→種子罐→發(fā)酵培養(yǎng)→液體菌種

↑

無菌空氣

圖1液體菌種生產(chǎn)工藝流程

5.2制備母種

5.2.1容器

使用18mm×180mm或20mm×200mm玻璃試管,試管應(yīng)保持清潔、干燥。

5.2.2培養(yǎng)基

根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基，常用的配方參見附錄A。

5.2.3滅菌

高壓蒸汽滅菌，在121℃，0.11MPa～0.12MPa的壓力下，維持30min。

5.2.4接種

在超凈工作臺上嚴(yán)格按無菌操作接種。接種完成后，在試管上注明菌種名稱、接種時(shí)間。

5.2.5培養(yǎng)

根據(jù)食用菌菌種的生長要求，給予其適宜的培養(yǎng)溫度22℃～28℃，保持空氣相對濕度在65%～75%，

避光培養(yǎng)。

5.2.6留樣

菌種應(yīng)留樣備查，留樣的數(shù)量應(yīng)以每個(gè)批次母種3支～5支。草菇在13℃～16℃貯存，其他種類母種

于4℃～6℃下貯存，貯存至該批菌種出第一潮菇。

5.3制備搖瓶液體種

5.3.1容器

采用1000ml的常規(guī)三角瓶，三角瓶應(yīng)保持清潔、干燥。

5.3.2裝液量

每瓶裝量為400ml，用通氧砂芯硅膠塞封口。

5.3.3培養(yǎng)基

根據(jù)食用菌品種的營養(yǎng)需要配制不同的搖瓶培養(yǎng)基，常用的配方參見附錄B。

5.3.4滅菌

同5.2.3高壓蒸汽滅菌法。

5.3.5接種

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DB12/T1012—2020

將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至30℃以下進(jìn)行接種，每瓶接入0.5cm2的瓊脂斜面母種3塊～5塊。

5.3.6培養(yǎng)

將接種后的三角瓶放到搖床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，根據(jù)食用菌品種的不同生長要求，給予其適宜的培養(yǎng)

溫度22℃～28℃，保持空氣相對濕度在65%～75%，避光培養(yǎng)。頻率隨具體品種而定。

5.4發(fā)酵罐檢查與清洗

5.4.1檢查

檢查罐上全部閥門、安全閥、壓力表，要求完好，工作正常。

5.4.2清洗

對罐體內(nèi)、外和全部閥門用流水進(jìn)行沖洗，達(dá)到無死角、內(nèi)壁無任何培養(yǎng)料殘余物的潔凈程度。

5.5煮罐和空消

培養(yǎng)器初次使用、出現(xiàn)染菌、長期放置、更換品種時(shí)，都要求煮罐和空消進(jìn)行滅菌。有內(nèi)置電加熱

棒的培養(yǎng)器加水至容積的80%加熱至121℃，滅菌40min。用外源蒸汽滅菌的培養(yǎng)器，蒸汽壓力達(dá)到0.11

Mpa～0.12Mpa、溫度121℃～124℃、滅菌40min。

5.6液體菌種培養(yǎng)基配方

具體配方根據(jù)原料資源和生產(chǎn)品種的營養(yǎng)需求，使用適宜的配方，準(zhǔn)確掌握加水量，加入適量的消

泡劑。用水應(yīng)符合GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。常用的配方見附錄B。

5.7投料與定容

將配制好的培養(yǎng)基，加適量的水，攪拌均勻，放入培養(yǎng)器中，加水定容，培養(yǎng)基投料量為罐體總?cè)?/p>

積的70%～80%，然后擰緊上料口蓋。

5.8培養(yǎng)器實(shí)消和培養(yǎng)基滅菌

培養(yǎng)器內(nèi)蒸汽壓力達(dá)到0.11Mpa～0.12Mpa，培養(yǎng)基溫度達(dá)到121℃～124℃、保持時(shí)間40min。

5.9冷卻降溫

滅菌結(jié)束通過冷卻系統(tǒng)，使培養(yǎng)基降溫至24℃～28℃。保持壓力平穩(wěn)，防止罐壓回零。

5.10接種

菌種罐接種處設(shè)置百級層流罩，用帶有手柄的內(nèi)徑略大于接種口的鐵絲圈纏繞紗布，蘸上95%的酒

精，套在接種口上點(diǎn)燃。打開液體搖瓶種瓶塞，用火焰灼燒瓶口30～40秒，打開接種口蓋，將液體搖瓶

種迅速倒入罐中，迅速蓋好接種口，擰緊。

5.11液體菌種培養(yǎng)條件

5.11.1通風(fēng)量

通過進(jìn)氣閥和排氣閥將通風(fēng)量調(diào)節(jié)至1：0.5V／V～1：1.2V／V(料液體積／空氣體積)。

5.11.2罐壓

4

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罐壓保持在0.02Mpa～0.04Mpa。

5.11.3溫度

常見品種培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)在24℃～28℃，少數(shù)品種根據(jù)特殊需求具體設(shè)定。

5.11.4培養(yǎng)時(shí)間

菌種培養(yǎng)時(shí)間由品種而定。

5.12留樣與檢測

5.12.1留樣

搖瓶液體菌種樣品；培養(yǎng)器滅菌后的空白培養(yǎng)基樣品；培養(yǎng)過程中定期從培養(yǎng)器中取出的樣品，用

作鏡檢和其它理化指標(biāo)測定。上述樣品放4℃冰箱內(nèi)保存一周以上。

5.12.2無菌檢測

對上述留存樣品應(yīng)在無菌檢測瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，在28℃恒溫培養(yǎng)2d～5d，每天觀察菌落生長情

況，若劃痕上沒有細(xì)菌、霉菌、酵母菌菌落生長，則表明該樣品無雜菌。對留樣樣品應(yīng)在取樣后及時(shí)鏡

檢，確定菌絲生長發(fā)育狀態(tài)和有無雜菌污染。

5.12.3pH值

采用酸度計(jì)測定，應(yīng)在正常發(fā)酵液PH值范圍之內(nèi)。

5.12.4菌絲濕重

采用Φ15cm的定量濾紙，將100ml液體菌液，過濾至無水滴滴下，稱重后減去濾紙濕重。

5.12.5鏡檢

觀察菌絲生長狀況和有無雜菌污染。

5.13液體菌種放罐指標(biāo)

5.13.1經(jīng)鏡檢和其它理化指標(biāo)等方法檢驗(yàn)質(zhì)量合格即可放罐接種。

5.13.2感官指標(biāo)見表1。

表1感官指標(biāo)

項(xiàng)目指標(biāo)

菌液色澤球狀菌絲體呈白色，濾液呈棕色。

菌液形態(tài)菌液稍粘稠，有大量片狀或球狀菌絲體懸浮、分布均勻、

不迅速分層，菌球間液不混濁。

菌液氣味有食用菌液體培養(yǎng)液特有的香氣，無異味，如酸、臭味等。

培養(yǎng)器排氣口氣味正常，無明顯改變。

5.13.3理化指標(biāo)見表2

表2理化指標(biāo)

5

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項(xiàng)目指標(biāo)

pH值在該品種正常范圍內(nèi)

菌絲濕重（g／100ml）＞8

顯微鏡下菌絲形態(tài)和雜菌鑒別可見食用菌菌種液體培養(yǎng)中特有的菌絲形態(tài)，球狀和叢狀

菌絲體大量分布，菌絲粗壯，菌絲內(nèi)原生質(zhì)分布均勻、染

色劑著色深；無霉菌菌絲、酵母和細(xì)菌菌體。

留存樣品無菌檢查有食用菌菌絲生長，劃痕處無霉菌、酵母菌、細(xì)菌菌落生

長。

6使用方法

將待接種的食用菌三級固體種袋（瓶）或栽培袋放置在輸送帶，輸入至無菌接種區(qū)。在接種區(qū)用接

種器將液體菌種注入，每個(gè)接種點(diǎn)15ml～30ml。移至發(fā)菌室培養(yǎng)。

7標(biāo)簽、貯存

7.1標(biāo)志

注明菌種種類、級別、品種、生產(chǎn)單位、接種日期。

7.2貯存

7.2.1搖瓶種保存方法

搖瓶培養(yǎng)的液體菌種用牛皮紙包好，放在4℃的溫度下可保存5天～7天。

7.2.2種子罐液體菌種保存方法

15℃～20℃室溫可保存1天～2天。

6

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AA

附錄A

（資料性附錄）