前言頭孢喹肟是一種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，由于頭孢菌素化學(xué)結(jié)構(gòu)具有兩性特點(diǎn)，這一特性使其能夠快速穿過(guò)細(xì)菌細(xì)胞壁，與細(xì)菌細(xì)胞壁上的青霉素結(jié)合蛋白PBPs結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的合成受阻，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡，實(shí)現(xiàn)殺菌作用。與青霉素不同，頭孢喹肟對(duì)β-內(nèi)酰胺酶具有較高的穩(wěn)定性，屬于廣譜抗生素，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌有強(qiáng)大的抗菌活性，包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌、腸桿菌等。雖然對(duì)一些革蘭氏陰性厭氧菌的作用有限，但對(duì)其他細(xì)菌如腸球菌、弗式檸檬酸桿菌等具有良好的療效（武曉青，2016）。研究結(jié)果顯示，頭孢喹肟在體內(nèi)外的抗菌作用都十分良好，特別是在對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性菌方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性。其高度穩(wěn)定的特性使得其在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景，對(duì)于治療多種感染性疾病具有潛在的重要意義。肉桂醛是從肉桂精油中提取得到的一種化合物，其成分多樣，包括揮發(fā)性成分精油和非揮發(fā)性成分，如多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、木脂素類(lèi)、多酚類(lèi)等（趙凱等，2013；王秋亞等，2020）。由于肉桂精油中含有較多的易揮發(fā)的成分，肉桂精油又稱(chēng)為揮發(fā)油，肉桂精油是植物次生代謝物質(zhì)，它具有誘發(fā)同種或異種生物的化學(xué)反應(yīng)的能力，從而保護(hù)植物免受攻擊，維持生態(tài)平衡。其特性包括化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、不溶于水、易溶于有機(jī)溶劑等。肉桂精油的形態(tài)為淡黃色至紅棕色的黏稠液體，具有強(qiáng)烈的芳香氣味，可以通過(guò)水蒸氣蒸餾提?。愋竦?，2018）。肉桂精油的提取率受提取方式、植物器官、品種、產(chǎn)地及季節(jié)等因素影響而有所不同。肉桂精油具有抗菌、抗氧化、促生長(zhǎng)等特性，因此可將其作為天然食品防腐保鮮劑、天然日化品防腐劑、安全綠色添加劑和抑菌劑等。研究表明肉桂精油對(duì)微生物具有強(qiáng)烈的抑制或殺滅作用，對(duì)比于細(xì)菌的殺滅效果，發(fā)現(xiàn)其在抑制真菌方面表現(xiàn)出顯著效果。肉桂精油對(duì)細(xì)菌革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌（趙文紅等，2009；王步江等，2011）。研究發(fā)現(xiàn)肉桂精油對(duì)各類(lèi)食源性、植物性、動(dòng)物性腐敗病原菌均具有強(qiáng)大的抑菌作用。因此可以將肉桂精油作為添加劑加入食品中可以延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。肉桂精油還具有能促進(jìn)植物、動(dòng)物的生長(zhǎng)，提高機(jī)體和動(dòng)物腸道的免疫力，調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群的微生態(tài)平衡，提高飼料的利用率等作用（林紅強(qiáng)等，2018；郗洪生等，2023）。通過(guò)體外藥敏試驗(yàn)對(duì)不同細(xì)菌對(duì)肉桂精油的敏感程度時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，肉桂精油對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度（MBC）為2.0mg/mL。通過(guò)實(shí)驗(yàn)所獲得的數(shù)據(jù)顯示肉桂精油對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用大于大腸桿菌（趙文紅等，2009；余帥，2020；張赟彬等，2015）。在治療細(xì)菌感染時(shí)可以嘗試將肉桂精油與抗生素聯(lián)合作用，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，可以將其作為治療細(xì)菌感染的一種途徑，精油的抑菌作用不會(huì)廣泛性的引發(fā)細(xì)菌的耐藥性的產(chǎn)生。本研究探討的MRSA菌株是金黃色葡萄球菌耐藥菌的一種，而金黃色葡萄球菌則是一種分布廣泛的革蘭氏陽(yáng)性球菌，人和動(dòng)物都易受其感染。該菌形態(tài)典型，直徑約0.5~1.5μm，顯微鏡下呈現(xiàn)葡萄串狀排列，革蘭氏染色呈紫色，是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，金黃色葡萄球菌又被稱(chēng)為“嗜肉菌”。金黃色葡萄球菌的感染問(wèn)題廣泛存在，其感染屬于全球性難題，且被感染者隨時(shí)可能引發(fā)危害生命的后果。在正常情況下，健康人群的皮膚可能被檢測(cè)出金黃色葡萄球菌，但并不治病。但在機(jī)體免疫力下降時(shí)，金黃色葡萄球菌可能通過(guò)各種不同的渠道作為致病菌感染機(jī)體。此菌可通過(guò)以下方式感染機(jī)體，如破損皮膚、傷口、燒傷、呼吸系統(tǒng)或血液感染等。金黃色葡萄球菌是社區(qū)生活中容易感染機(jī)體的一種病原菌，同時(shí)在醫(yī)院內(nèi)感染常見(jiàn)的一種重要致病菌（顧麗萍，2021）。當(dāng)機(jī)體被金色葡萄球菌感染后，主要出現(xiàn)的癥狀為化膿感染，包括局部組織化膿、內(nèi)臟器官化膿或者全身性化膿感染。局部組織化膿表現(xiàn)為癤、癰、蜂窩織炎、傷口化膿等，化膿組織流出的膿液特點(diǎn)是膿液呈金黃色，并且比較黏稠，正常組織與化膿組織界限分明。如果金黃色葡萄球菌感染機(jī)體感染機(jī)體內(nèi)臟，內(nèi)臟會(huì)出現(xiàn)化膿感染，如肺炎、腦膜炎、心包炎、心內(nèi)膜炎等。嚴(yán)重者為全身化膿感染，金黃色葡萄球菌感染沖破局部組織，在機(jī)體血液中出現(xiàn)，釋放毒素，如敗血癥、膿毒血癥等（王德成等，2020）。自青霉素沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，金黃色葡萄球菌是引起細(xì)菌性感染的一大罪魁禍?zhǔn)?，自上世紀(jì)四十年代，青霉素作為抗生素問(wèn)世后，金黃色葡萄球菌感染后的治療得到了一定的控制，但隨著青霉素的廣泛性使用，金黃色葡萄球菌耐藥性產(chǎn)生（于建梅等，2022）。根據(jù)金黃色葡萄球菌對(duì)甲氧西林（methicillin）耐藥性的不同，可以將其分為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）及甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌是臨床上常見(jiàn)的毒性較強(qiáng)的細(xì)菌。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是臨床上常見(jiàn)且具有較強(qiáng)毒性的耐藥菌株，對(duì)于青霉素的廣泛使用導(dǎo)致了大量耐藥菌的產(chǎn)生。針對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌的產(chǎn)生，科學(xué)家開(kāi)發(fā)了新藥了甲氧西林（methicillin），一種能夠抵抗青霉素酶的半合成青霉素，以對(duì)抗耐藥菌株的影響。所以區(qū)分金黃色葡萄球菌耐藥菌的命名由此得來(lái)。聯(lián)合使用抗菌藥物，目的在于獲得對(duì)細(xì)菌治療效果的協(xié)同作用，提高療效，減少用藥劑量，減輕抗生素對(duì)機(jī)體帶來(lái)的毒性反應(yīng)，防止或延緩耐藥菌株的產(chǎn)生。頭孢喹肟和肉桂醛都對(duì)金黃色葡萄球菌有作用，本文主要是研究將兩藥聯(lián)合使用針對(duì)MRSA菌株產(chǎn)生的抗菌作用。體外測(cè)定抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的聯(lián)合抗菌作用的實(shí)驗(yàn)，可以為臨床選用更為有效的抗菌藥物組合進(jìn)行治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。菌血癥是指外界細(xì)菌經(jīng)感染進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)后在機(jī)體血液內(nèi)繁殖并隨血液流動(dòng)傳播至全身，從而導(dǎo)致系統(tǒng)感染，MRSA菌株是導(dǎo)致菌血癥發(fā)生的常見(jiàn)病原菌之一，被MRSA菌株感染后，往往會(huì)引起繼發(fā)感染，對(duì)后續(xù)治療越發(fā)困難。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠構(gòu)建MRSA菌株感染產(chǎn)生菌血癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。嘗試將頭孢喹肟和肉桂醛聯(lián)合使用，來(lái)證實(shí)聯(lián)合用藥對(duì)MRSA的作用，以及治療由MRSA菌株感染小鼠所出現(xiàn)的菌血癥癥狀。2材料與方法2.1材料與試劑材料與試劑：生理鹽水、肉湯、肉桂醛、手術(shù)剪、PBS緩沖液、移液槍、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、酒精燈、一次性接種環(huán)、枸櫞酸鈉抗凝管、鑷子、涂布棒、TSB粉末、1mL離心管、1mL注射器、油性記號(hào)筆、胰蛋白胨大豆肉湯、75%酒精等；抗生素：頭孢喹肟；實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)基：MRSA菌株、MH肉湯培養(yǎng)基；主要儀器和設(shè)備：冰箱、生物安全柜、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、勻漿機(jī)、渦旋儀、搖床、離心機(jī)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年健康小鼠，體重25~30g。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1頭孢喹肟和肉桂醛的MIC的測(cè)定用微量肉湯稀釋法實(shí)驗(yàn)獲得頭孢喹肟和肉桂醛各自對(duì)MRSA的最低抑菌濃度MIC（Minimalinhibitconcentration）平板的制備稱(chēng)取胰蛋白胨大豆肉湯粉末于三角瓶中，加入瓊脂，按照一定比例加入蒸餾水，配成的培養(yǎng)基，用錫紙封口，高壓蒸汽滅菌。將滅菌好的培養(yǎng)基在超凈臺(tái)中趁熱(50℃左右)倒平板，每個(gè)平板大約將培養(yǎng)皿蓋子略打開(kāi)，方便水蒸氣散發(fā)，待到平板完全凝固時(shí)，用油性記號(hào)筆做好標(biāo)記，待用。準(zhǔn)備工作：菌株復(fù)蘇與活化從冰箱中將-20℃下保存的MRSA菌株取出，連同凝固的MH肉湯平板，取出時(shí)需要用75%酒精噴酒消毒，拿到生物安全柜內(nèi)。用接種環(huán)挑取少量菌液，劃線至平板上，做3個(gè)平板，37℃恒溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜，此過(guò)程為細(xì)菌的復(fù)蘇。按照肉湯瓊脂培養(yǎng)基的制作方法，稱(chēng)取1.5gTSB粉于100mL三角瓶中，加入50mL蒸餾水，配成3%的培養(yǎng)基，用錫紙對(duì)三角瓶封口，將三角瓶放入高壓蒸汽鍋中滅菌121℃，20min，冷卻至室溫。在超凈工作臺(tái)中取出50mL培養(yǎng)基分裝為3份，分別為5mL、20mL和25mL。25mL液體培養(yǎng)基備用。取5mL液體培養(yǎng)基，用接種環(huán)挑取平板上單克隆菌落接種于培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，130r/min，此過(guò)程為MRSA菌株的活化。將活化的MRSA菌株用平板劃線法接種于平板中，放置37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h。之后將平板放進(jìn)4℃的冰箱中。頭孢喹肟和肉桂醛MIC測(cè)定進(jìn)行試驗(yàn)操作前，需要提前打開(kāi)超凈工作臺(tái)并進(jìn)行紫外燈下照射30min。進(jìn)行此操作目的為了防止超凈工作臺(tái)中存在有其他雜菌，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作時(shí)需要佩戴口罩、手套，做好消毒工作。抗菌藥物儲(chǔ)備液的配制方法參照抗菌藥物說(shuō)明書(shū)，用肉湯作為稀釋液來(lái)配置儲(chǔ)備液。其中：頭孢喹肟稀釋配置成256mg/L儲(chǔ)備液；肉桂醛稀釋配置成5000mg/L的儲(chǔ)備液；取出保存在4℃冰箱接種MRSA菌株的瓊脂板，使用一次性接種環(huán)挑取瓊脂板第三區(qū)的單菌落，將挑取的MRSA單菌落加入含2mLMH肉湯培養(yǎng)基的15mL離心管中，充分震蕩后放置于37℃恒溫?fù)u床，200rmp/min培養(yǎng)2~3個(gè)小時(shí)。取出離心管，吸取適量菌液加入盛有2mL的MH肉湯培養(yǎng)基的玻璃管中，渦旋振蕩器震蕩均勻后，用眼睛觀察菌液渾濁度，最終將MRSA菌液濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞舛龋ㄏ喈?dāng)于1.5×108CFU/mL的細(xì)菌濃度），然后使用肉湯作為稀釋液對(duì)菌液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)罱K將菌液濃度稀釋為1.5×106CFU/mL備用。在進(jìn)行操作實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要在超凈工作臺(tái)中點(diǎn)燃酒精燈。取無(wú)菌96孔板和抗菌藥物儲(chǔ)備液，使用MH肉湯培養(yǎng)基通過(guò)倍比稀釋法進(jìn)行藥物稀釋?zhuān)涸O(shè)置8個(gè)濃度梯度，在前7個(gè)孔中加入100μL無(wú)菌培養(yǎng)基，然后在第一孔中加入100μL的抗菌藥物并充分混勻，從第一孔中吸取100μL加入第二孔中，充分混勻后再吸取100μL加入第三孔，以次類(lèi)推。通過(guò)倍比稀釋法獲得濃度遞減的抗菌藥物溶液，倍比稀釋后的頭孢喹肟單藥濃度分別為256mg/L、128mg/L、64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L，肉桂醛單藥濃度為5000mg/L、2500mg/L、1250mg/L、625mg/L、312.5mg/L、156mg/L、78mg/L、39mg/L。再依次加入100μL提前稀釋好的菌液（1.5×108CFU/mL的細(xì)菌濃度）。加完樣后將96孔板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)，然后取出96孔板，先觀察空白對(duì)照組以及陽(yáng)性對(duì)照組是否異常，排除人為因素造成的污染，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，當(dāng)出現(xiàn)連續(xù)跳孔時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。頭孢喹肟和肉桂醛的單獨(dú)MIC測(cè)定，都按照以上操作進(jìn)行。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)做三次。2.2.2棋盤(pán)法測(cè)定聯(lián)合使用的FIC指數(shù)FIC指數(shù)（fractionalinhibitoryconcentration）測(cè)定：提前測(cè)得對(duì)應(yīng)菌株各抗菌藥物的MIC，然后根據(jù)待測(cè)兩藥的MIC設(shè)置8個(gè)濃度梯度的抗菌藥物，分別為藥物2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、0倍MIC。采取肉湯作為稀釋溶液，稀釋為1/32MIC～2MIC（mg/L）濃度的頭孢喹肟和肉桂醛溶液，分為八個(gè)梯度濃度。頭孢喹肟稀釋后所得到的濃度分別為0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L、32mg/L（頭孢喹肟對(duì)MRSA菌株的MIC為16mg/L）。肉桂醛的稀釋濃度為0mg/L、20mg/L、39mg/L、78mg/L、156mg/L、312mg/L、625mg/L、1250mg/L（肉桂醛對(duì)MRSA菌株的MIC為625mg/L）。按棋盤(pán)法兩兩組合加到96孔板中，每種藥物加入50μL，接種菌懸液100μL，吸取50μL抗菌藥物加入各孔，不同濃度的藥物進(jìn)行兩兩聯(lián)合，再加入100μL提前稀釋好的細(xì)菌懸液（細(xì)菌懸液制備同測(cè)定MIC制備），總體積為200μL，此時(shí)藥物濃度經(jīng)稀釋變?yōu)?、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、0倍MIC，同時(shí)設(shè)置不加細(xì)菌的陰性對(duì)照組和不加抗菌藥物的陽(yáng)性對(duì)照組，最后將96孔板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)后取出，在燈下判斷每個(gè)孔的渾濁程度，根據(jù)渾濁程度判斷兩藥聯(lián)合MIC，記錄并計(jì)算FIC指數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。FIC指數(shù)結(jié)果判斷：96孔板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，陰性對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為澄清液體，陽(yáng)性對(duì)照組的MRSA菌株正常生長(zhǎng)。FIC指數(shù)=MIC（頭孢喹肟和肉桂醛）聯(lián)用/MIC頭孢喹肟單用+MIC（頭孢喹肟和肉桂醛）聯(lián)用/MIC肉桂醛單用。FIC指數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)FIC指數(shù)≤0.5時(shí)，兩藥聯(lián)合作用方式為協(xié)同；0.5<FIC指數(shù)≤1時(shí)，兩藥聯(lián)合作用方式為相加；1<FIC指數(shù)≤2時(shí)，兩藥聯(lián)合作用方式為無(wú)關(guān)；FIC指數(shù)>2時(shí)，兩藥聯(lián)合作用方式為拮抗。2.2.3殺菌曲線的測(cè)定時(shí)間-殺菌曲線（Time-Killcurve，TKC），即將一定濃度的抗菌藥物加入受試菌液共同培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行菌落形成單位（CFUcolonyformingunits）計(jì)數(shù)，繪制時(shí)間-菌落計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)值曲線。時(shí)間-殺菌曲線的斜率反映殺菌速度，可通過(guò)該曲線比較不同抗菌藥物或同一藥物不同濃度的殺菌速度和作用持續(xù)時(shí)間。從冰箱中取出MRSA菌株，復(fù)蘇后使用一次性接種環(huán)通過(guò)平板劃線法獲取新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)板。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)挑取培養(yǎng)板上單菌落，加入MH肉湯培養(yǎng)基中，放置于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)2~3小時(shí)后，再使用無(wú)菌MH肉湯將孵育的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌菌懸液調(diào)節(jié)1.5×108CFU/mL。設(shè)置空白對(duì)照組、頭孢喹肟單藥組、肉桂醛單藥組以及肉桂醛和頭孢喹肟聯(lián)合使用組，分別吸取5mL菌懸液加入15mL離心管，根據(jù)選取株菌株單藥MIC結(jié)果，配制不同MIC濃度的頭孢喹肟與肉桂醛抗菌藥物，頭孢喹肟藥物對(duì)應(yīng)的濃度應(yīng)配置為8mg/L，肉桂醛配置的濃度為312mg/L，兩藥合用的殺菌曲線濃度為各加入頭孢喹肟的濃度8mg/L，加入肉桂醛的濃度312mg/L。各為1/2MIC。并加入對(duì)應(yīng)15mL無(wú)菌離心管中。接著將離心管放入37℃恒溫?fù)u床，200rmp/min培養(yǎng)。分別在0h、6h、12h、18h、24h從各組中取10μL菌液，取完菌液后將離心管繼續(xù)放回?fù)u床中培養(yǎng)細(xì)菌。使用無(wú)菌PBS對(duì)所取菌液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)♂尀?0、102、103、104、105、106倍，混勻后各取10μL菌液接種于MH肉湯瓊脂平板上，設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔。將接種后的瓊脂平板靜置，自然風(fēng)干后倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)。取出瓊脂平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋的倍數(shù)計(jì)算菌落數(shù)，并構(gòu)建殺菌曲線。判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)：協(xié)同效應(yīng)定義為聯(lián)合比單藥最強(qiáng)效應(yīng)的抗生素超過(guò)細(xì)菌初始量2log10CFU/mL的減少；殺菌效應(yīng)定義為細(xì)菌菌落數(shù)較初始接種菌落數(shù)降低≥3log10CFU/mL。2.2.4小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：兩藥聯(lián)合治療菌血癥的效果菌株的活化將MRSA菌株從冰箱中取出，用一次性接種環(huán)蘸取菌液用平板劃線法接種至平板中，將平板放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)48h。48h取出平板，用接種環(huán)挑取單菌落移植在肉湯液體培養(yǎng)基中37℃，130r/min振蕩過(guò)夜生長(zhǎng)，第2天再重新接種至新的肉湯培養(yǎng)基中;當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，取培養(yǎng)液離心6000r/min，15min，用無(wú)菌PBS緩沖液快速洗滌2次，然后將懸浮細(xì)菌控制在107CFU/mL。制作小鼠模型用健康成年小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物載體，并分3組，每組10只，雌雄各半。一組為空白對(duì)照組，一組為單藥頭孢喹肟，另一組為肉桂醛聯(lián)合頭孢喹肟。在適宜環(huán)境下混養(yǎng)。用健康飼料喂養(yǎng)小鼠。飼養(yǎng)7天后，用1mL注射器，每只小鼠經(jīng)尾靜脈接種濃度1×107CFU/mL的菌液進(jìn)行感染，接種劑量根據(jù)小鼠體重進(jìn)行換算，每20g小鼠接種0.2mL，對(duì)照組空白組小鼠給予生理鹽水。感染情況出現(xiàn)4~5天后，實(shí)驗(yàn)組分別用頭孢喹肟單獨(dú)使用和肉桂醛聯(lián)合頭孢喹肟治療小鼠感染，采用灌胃的方式將藥物灌注給小鼠，給小鼠灌胃的藥物濃度從1/8~2MIC遞增。頭孢喹肟遞增的濃度為2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L、32mg/L。給藥前，需要對(duì)小鼠進(jìn)行12h的禁食。每日觀察各組小鼠的精神狀況、活動(dòng)量、小鼠食量的變化、飲水量變化情況，注意將各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比查看，并寫(xiě)好每天觀察記錄。每天觀察小鼠2次。樣本的采取及處理采取小鼠的血液、內(nèi)臟：脾、腎，根據(jù)處理后，血液，腎臟和脾臟在平板上的菌落數(shù)量的情況來(lái)判斷頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛治療由MRSA感染小鼠產(chǎn)生的菌血癥效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定：對(duì)小鼠進(jìn)行眼球采血，操作者用左手拇指及食指抓住小鼠兩耳之間的皮膚，稍用力壓迫眼球，固定小鼠，盡量使眼球突出造成充血，右手用鑷子迅速摘除眼球，眼眶內(nèi)立即會(huì)流出血液，立即將小鼠倒置，頭朝下，血液即可流入已準(zhǔn)備好的抗凝管中，小鼠的采血量需要大于0.5mL。采血結(jié)束后，將盛有血液的抗凝管輕輕上下顛倒混勻，以防止血液發(fā)生凝固。采完血后，采用頸椎脫臼法將小鼠處死。處死后，用手術(shù)剪剪開(kāi)小鼠的腹部獲取內(nèi)臟：脾臟和腎臟，觀察小鼠脾臟和腎臟的紅腫情況，并稱(chēng)取每只小鼠的脾臟和腎臟的重量，記錄。血液細(xì)菌培養(yǎng)取1mL離心管作為容器，稀釋三個(gè)濃度。每管內(nèi)加入180μL無(wú)菌PBS緩沖液，以所采取血液為原液，依次從上一級(jí)稀釋液中吸取20μL至下一級(jí)PBS緩沖液中，稀釋前需要在渦旋儀中混勻，再用移液槍吸取液體。從而將原菌液依次稀釋至10-1、10-2、10-3。分別取100μL稀釋倍數(shù)為10-2、10-3的稀釋液用涂布棒涂布到倒好的平板上，接種平板時(shí)，在超凈工作臺(tái)中操作。每個(gè)倍數(shù)做2個(gè)重復(fù)測(cè)定平板，并設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照平板，將接種后的瓊脂平板靜置，自然風(fēng)干后倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。挑取菌落數(shù)量在30~300之間的范圍內(nèi)的平版進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，逐級(jí)推算出小鼠血液細(xì)菌濃度(CFU/mL血液)。小鼠內(nèi)臟腎臟和脾臟的細(xì)菌培養(yǎng)用勻漿機(jī)將所獲得的小鼠的腎臟和脾臟打碎，取1mL離心管作為容器，每管內(nèi)加入180μL無(wú)菌PBS緩沖液，吸取勻漿液用所取的腎臟和脾臟的組織勻漿為原液，依次從上一級(jí)稀釋液中吸取20μL至下一級(jí)PBS緩沖液中，操作同血液稀釋步驟。將得到的每個(gè)倍數(shù)做2個(gè)重復(fù)測(cè)定平板，并設(shè)一個(gè)空白對(duì)照平板，將接種后的瓊脂平板靜置，接種后倒置。自然風(fēng)干后倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，從培養(yǎng)箱中取出并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。并挑取菌落數(shù)量在30~300之間的范圍內(nèi)的平板。根據(jù)平板計(jì)數(shù)結(jié)果來(lái)推斷出小鼠腎臟和脾臟的細(xì)菌濃度（CFU/mL）。如果得到的結(jié)果不好需要重復(fù)做以上實(shí)驗(yàn)。3結(jié)果與分析3.1稀釋梯度法測(cè)量頭孢喹肟和肉桂醛單獨(dú)的MIC結(jié)果為了檢驗(yàn)頭孢喹肟和肉桂醛對(duì)MRSA菌株的抑菌效果，我們進(jìn)行了抗菌藥敏實(shí)驗(yàn)，用微量肉湯稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明頭孢喹肟對(duì)MRSA菌株的抑制作用在16mg/L時(shí)，此時(shí)的濃度是最低抑菌濃度MIC，在檢測(cè)肉桂醛對(duì)MRSA菌株的抗菌抑制作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)肉桂醛的濃度達(dá)到625mg/L時(shí)，此時(shí)的濃度是肉桂醛對(duì)MRSA菌株的最低抑菌濃度MIC。表1稀釋梯度法測(cè)量頭孢喹肟和肉桂醛單獨(dú)的MIC菌種(strains)MIC（mg/L）耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）CEF(頭孢喹肟)CIN（肉桂醛）166253.2殺菌曲線結(jié)果為了檢驗(yàn)頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛使用對(duì)MRSA菌株的影響，分別設(shè)置了空白對(duì)照組、頭孢喹肟單藥組，肉桂醛單藥組，頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛組。由以下圖表我們可以看出，空白對(duì)照組在沒(méi)有加入任何抑菌藥的作用下，細(xì)菌的數(shù)量一直在增長(zhǎng)，并在24h達(dá)到頂峰。頭孢喹肟單藥組，我們從圖1種可以看到，細(xì)菌在0~6h生長(zhǎng)被抑制，過(guò)后細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)。肉桂醛單藥組，對(duì)比于頭孢喹肟單藥組來(lái)說(shuō)，剛開(kāi)始細(xì)菌的生長(zhǎng)并沒(méi)有得到抑制，到6~24h，將肉桂醛單藥組與空白對(duì)照組相比較，可以看到，肉桂醛單藥組的抑制作用較弱。由圖可以看出，加入頭孢喹肟單藥組對(duì)比于頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛聯(lián)合組，聯(lián)合組的斜率更為陡峭，說(shuō)明加入聯(lián)合用藥的對(duì)MRSA菌株的殺滅作用強(qiáng)于單藥作用。頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛組，由圖表中，我們可以看出，頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛對(duì)MRSA的作用隨著時(shí)間的推移，兩藥聯(lián)合使用的殺菌速度大于任一單藥的使用的殺菌速度，由圖1看出24h后縱坐標(biāo)細(xì)菌濃度降低至低于3log10CFU/mL，所以頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛對(duì)MRSA菌株的作用表現(xiàn)為殺菌作用。同時(shí)，對(duì)比于頭孢喹肟單藥組和肉桂醛單藥組的時(shí)間殺菌曲線，圖表說(shuō)明了，頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛使用對(duì)殺滅MRSA菌株的作用為協(xié)同作用。圖1頭孢喹肟、肉桂醛、頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛使用、空白對(duì)照的殺菌曲線時(shí)間-殺菌曲線3.3棋盤(pán)法測(cè)定FIC指數(shù)的結(jié)果為了驗(yàn)證頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛體外實(shí)驗(yàn)對(duì)MRSA菌株所產(chǎn)生的效果，采取了體外藥敏試驗(yàn)：棋盤(pán)法。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的圖2可以看出，當(dāng)?shù)陀陬^孢喹肟對(duì)MRSA菌株的MIC時(shí)，加入的肉桂醛能和頭孢喹肟相互作用，對(duì)MRSA表現(xiàn)出協(xié)同作用。FIC指數(shù)=MIC（頭孢喹肟和肉桂醛）聯(lián)用/MIC頭孢喹肟單用+MIC（頭孢喹肟和肉桂醛）聯(lián)用/MIC肉桂醛單用；通過(guò)計(jì)算可以得到FIC指數(shù)小于0.5，所以頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛對(duì)MRSA菌株的結(jié)果所得到的結(jié)果為協(xié)同作用。圖2棋盤(pán)法測(cè)定頭孢喹肟和肉桂醛聯(lián)合使用對(duì)MRSA菌株的結(jié)果3.4小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：兩藥聯(lián)合治療菌血癥的結(jié)果為了驗(yàn)證頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛對(duì)治療由MRSA菌株感染引起小鼠出現(xiàn)菌血癥的治療效果，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行眼球采血、采取小鼠的腎臟和脾臟用于涂板，根據(jù)長(zhǎng)出來(lái)的菌落數(shù)量來(lái)判斷兩種藥物聯(lián)合使用對(duì)治療MRSA感染導(dǎo)致的小鼠出現(xiàn)的菌血癥的治療效果。（如圖3所示）當(dāng)頭孢喹肟單藥使用時(shí)，我們可以從圖3中看出，隨著給藥濃度的上升，小鼠血液、腎臟、脾臟中的所檢測(cè)菌落的數(shù)量開(kāi)始逐步降低，說(shuō)明頭孢喹肟單藥使用對(duì)小鼠被MRSA菌株感染所引起的菌血癥有一定的治療作用。另一個(gè)曲線為頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛使用，我們可以看到兩藥聯(lián)合的治療效果更為明顯?？梢钥吹皆趦伤幝?lián)合使用的情況下，小鼠的血液中、腎臟、脾臟中的涂板所顯示的出現(xiàn)的菌落數(shù)量大大降低。說(shuō)明頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛使用對(duì)治療MRSA感染的小鼠引起的菌血癥有協(xié)同作用。圖3頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛對(duì)治療MRSA菌株感染引起小鼠出現(xiàn)菌血癥的治療效果4討論4.1肉桂醛和頭孢喹肟的聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)為臨床治療提供經(jīng)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外藥敏試驗(yàn)測(cè)定頭孢喹肟和肉桂醛的MIC所獲得的結(jié)果，和頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛使用所得到殺菌曲線的結(jié)果，和肉桂醛聯(lián)合頭孢喹肟對(duì)小鼠體內(nèi)感染MRSA菌株出現(xiàn)的菌血癥的治療的結(jié)果，我們可以看到，頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛治療由MRSA所出現(xiàn)的菌血癥的治療效果為協(xié)同作用。在臨床上，在實(shí)驗(yàn)中，我們常常采用藥物聯(lián)合用于更好的治療疾病。聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物，目的是在于獲得協(xié)同作用，提高療效，減少用藥劑量，減輕毒性反應(yīng)，防止或延緩耐藥菌株的產(chǎn)生。體外測(cè)定抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的聯(lián)合抗菌作用，可以為臨床選用更為有效的抗菌藥物組合進(jìn)行治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。所以在臨床治療由MRSA菌中感染引起出現(xiàn)的癥狀的情況中，我們可以考慮將抗生素與植物精油聯(lián)合使用，來(lái)提高臨床治療的作用。4.2植物精油的應(yīng)用目前對(duì)于植物精油的研究主要在于其的用途，植物精油目前在各個(gè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，包括醫(yī)學(xué)、美容、健康保健、環(huán)境清潔等。以下是一些植物常見(jiàn)的應(yīng)用領(lǐng)域：1芳香療法：植物精油被廣泛用于芳香療法，通過(guò)吸入或按摩的方式來(lái)促進(jìn)身心健康。不同的精油具有不同的功效，如薰衣草精油有放松和舒緩的作用，薄荷精油則能提神醒腦。2美容護(hù)膚：許多植物精油具有抗氧化、抗炎和保濕等功效，因此被添加到護(hù)膚品中，用于保持皮膚健康和美容。例如，茶樹(shù)精油常用于治療痘痘，玫瑰精油有助于皮膚保濕和抗衰老。3藥物：一些植物精油具有抗菌、抗病毒和抗真菌的活性，因此被用作藥物成分，用于治療感染性疾病。例如，茶樹(shù)精油被用于治療皮膚感染，薄荷精油可以緩解頭痛。4健康保?。褐参锞捅挥糜诟纳粕眢w健康和預(yù)防疾病。例如，某些精油被認(rèn)為具有提高免疫力、促進(jìn)消化和緩解肌肉疼痛的作用。5環(huán)境清潔：一些植物精油具有抗菌和消臭的作用，因此被添加到清潔用品中，用于清潔和消毒環(huán)境。例如，檸檬精油可以用于清潔廚房表面，殺菌消毒。6驅(qū)蟲(chóng)：某些植物精油具有驅(qū)蟲(chóng)作用，可用于防止蚊蟲(chóng)、蟑螂等昆蟲(chóng)的侵?jǐn)_。例如，薄荷精油可以驅(qū)趕蚊蟲(chóng)，茶樹(shù)精油可以驅(qū)趕頭虱。4.3耐藥菌的危害和預(yù)防MRSA菌株作為一種耐藥菌，在使用抗生素治療時(shí)，需要選擇合適的抗生素用于治療。MRSA菌株會(huì)產(chǎn)生滅活酶使得青霉素活性消失。由于目前對(duì)抗生素的使用規(guī)定的不規(guī)范，使得耐藥菌的產(chǎn)生出現(xiàn)的越來(lái)越多。耐藥菌的出現(xiàn)對(duì)人類(lèi)健康和公共衛(wèi)生造成了嚴(yán)重的危害，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1治療難度增加：耐藥菌對(duì)常規(guī)抗生素產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療相應(yīng)感染疾病變得更加困難。耐藥菌可能需要使用更昂貴、更有毒或更少使用的抗生素來(lái)治療，增加了治療的成本和風(fēng)險(xiǎn)。2治療失敗和并發(fā)癥增加：由于耐藥菌的存在，治療常見(jiàn)感染疾病的成功率下降，治療失敗和并發(fā)癥的發(fā)生率增加。這可能導(dǎo)致感染的嚴(yán)重性增加，甚至危及患者的生命。3傳播擴(kuò)散：耐藥菌的傳播和擴(kuò)散增加了感染的風(fēng)險(xiǎn)，特別是在醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)和社區(qū)環(huán)境中。耐藥菌可通過(guò)接觸、空氣傳播、水源或食物傳播等多種途徑傳播，對(duì)公共衛(wèi)生造成威脅。4健康危害：耐藥菌可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的疾病和健康問(wèn)題，尤其是對(duì)于免疫功能低下的人群或患有基礎(chǔ)疾病的人來(lái)說(shuō)，可能會(huì)造成嚴(yán)重后果。5經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)增：治療耐藥菌感染所需的更昂貴和復(fù)雜的治療方案增加了醫(yī)療成本，對(duì)患者、家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)都造成了負(fù)擔(dān)。6限制治療選擇：隨著耐藥性的擴(kuò)散，常規(guī)抗生素的可用性和效力受到限制，降低了治療選擇的范圍，加劇了抗生素藥物的耗竭問(wèn)題。綜上所述，耐藥菌的出現(xiàn)對(duì)人類(lèi)健康和公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，需要采取綜合性的策略來(lái)應(yīng)對(duì)，包括加強(qiáng)感染控制措施、促進(jìn)合理使用抗生素、推動(dòng)新抗生素和替代療法的研發(fā)等措施。為了嚴(yán)格規(guī)范抗生素的使用，我們國(guó)家和政府應(yīng)該出臺(tái)一些政策使得抗生素的使用得到一些控制，避免抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥菌的廣泛產(chǎn)生。在養(yǎng)殖場(chǎng)中，為了應(yīng)對(duì)抗生素使用的不規(guī)范導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性的普遍性的產(chǎn)生，就本次論文中發(fā)現(xiàn)的植物精油可以應(yīng)用于對(duì)細(xì)菌的治療。我們可以運(yùn)用將精油聯(lián)合抗生素治療細(xì)菌感染的疾病，用于提高治療效果。將精油加入到動(dòng)物飼料中，代替抗生素，提高動(dòng)物的防病能力，同時(shí)降低因?yàn)榭股氐牟灰?guī)范使用導(dǎo)致出現(xiàn)的細(xì)菌廣泛性的耐藥。5結(jié)論本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外藥敏試驗(yàn)，微量肉湯稀釋法獲得了頭孢喹肟對(duì)MRSA菌株的MIC為16mg/L，肉桂醛對(duì)MRSA菌株的MIC為625mg/L通過(guò)棋盤(pán)法測(cè)定頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛對(duì)MRSA的作用，可以從實(shí)驗(yàn)得到的圖表中看出，兩藥聯(lián)合對(duì)MRSA菌株具有協(xié)同作用。通過(guò)時(shí)間殺菌曲線實(shí)驗(yàn)，我們從獲得的時(shí)間殺菌曲線圖表中，我們可以看到，在頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛的作用下，隨著時(shí)間的推移，對(duì)比頭孢喹肟和肉桂醛的單藥的使用，MRSA菌株的生長(zhǎng)得到大大的抑制。這表明頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛的作用為協(xié)同作用。從頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛的時(shí)間殺菌曲線中，我們從曲線斜率的陡峭程度看出來(lái)，兩種藥物聯(lián)合對(duì)MRSA表現(xiàn)出來(lái)的是殺菌作用。通過(guò)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了頭孢喹肟聯(lián)合肉桂醛治療被MRSA菌株感染小鼠所出現(xiàn)的菌血癥的作用為協(xié)同作用。兩藥聯(lián)合使用能夠有效治療由MRSA菌株感。染的引起出現(xiàn)的癥狀，在肉桂醛聯(lián)合頭孢喹肟的作用下，在治療藥量范圍中，并且隨著治療藥物量的增多，治療效果越好。小鼠的血液，腎臟和脾臟中所出現(xiàn)的MRSA菌的數(shù)量得到了控制，使出現(xiàn)的感染癥狀得到治療。參考文獻(xiàn)柴向華，鄒冬鋅，吳克剛，等.肉桂精油復(fù)配香芹酚和百里香酚對(duì)食用畜禽有害微生物熏蒸的抗菌活性[J].現(xiàn)代食品科技，2024，40(02):187-195.DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2024.2.0288.陳暢宇，陳鐫，楊菁，等.三種植物精油的抗氧化活性對(duì)比及其復(fù)方精油的制備[J].山東化工，2023，52(09):40-44.DOI:10.19319/ki.issn.1008-021x.2023.09.029.陳娣.從結(jié)構(gòu)看第四代頭孢菌素的藥理特點(diǎn)和作用[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2019，39(11):1011-1014.DOI:10.19538/j.nk2019110122.陳詩(shī)琪，黃珊，談琦，等.金黃色葡萄球菌的耐藥機(jī)制及治療進(jìn)展[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2022，42(09):976-980+990.陳雪雨.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）致SKH-1無(wú)毛小鼠感染模型的實(shí)驗(yàn)研究[D].復(fù)旦大學(xué),2012.陳詠琪，姜金珠，馬志遠(yuǎn)，等.肉桂精油對(duì)動(dòng)物體內(nèi)外抗菌作用的研究進(jìn)展[J].飼料研究，2023，46(11):168-171.DOI:10.13557/ki.issn1002-2813.2023.11.035.程政，劉捷.香料肉桂在食品中的應(yīng)用及前景[J].焦作大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，37(01):80-83.DOI:10.16214/41-1276/g4.2023.01.017.戴向榮.肉桂油抑制黃曲霉作用研究[D].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.杜向黨，李新生，吳寧鵬，等.頭孢喹諾的最新研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2006，(09):87-89.顧麗萍.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的臨床分布及耐藥性研究[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2021，19(33):58-60.DOI:10.15912/ki.gocm.2021.33.020.侯茂洋.金黃色葡萄球菌的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科學(xué)(電子版)，2021，(17):131-132.李京晶，籍保平，周峰，等.丁香和肉桂揮發(fā)油的提取、主要成分測(cè)定及其抗菌活性研究[J].食品科學(xué)，2006，(08):64-68.林紅強(qiáng)，周柏松，譚靜，等.肉桂的化學(xué)成分、藥理活性及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].特產(chǎn)研究，2018，40(02):65-69.DOI:10.16720/ki.tcyj.2018.02.014.劉美端，趙地順，劉寶樹(shù)，等.頭孢喹肟研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013，40(04):216-221.路露，束成杰，葛翎，等.肉桂精油和肉桂醛的抑菌、抗氧化和酪氨酸酶抑制活性研究[J]林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2022，42(03):105-110.路美玉，趙世煒，王成達(dá)，等.硫酸頭孢喹肟研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物保健，2023，25(10):115-116.蒲忠慧，王雄清.肉桂揮發(fā)油抗菌活性研究[J].綿陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，32(08):39-43.DOI:10.16276/51-1670/g.2013.08.012.宋志偉，蔡艷群，郟伊范，等.醫(yī)院耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的風(fēng)險(xiǎn)模型建立及耐藥基因檢測(cè)[J].浙江醫(yī)學(xué)，2022，44(06):598-602.王步江,劉金福,樊秀花,等.