遺傳性肝臟疾病基因治療的研究進(jìn)展2025基因治療是一種通過(guò)將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)白質(zhì)表達(dá)，最終達(dá)到治療疾病目的的新型治療方法[1]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局將基因治療定義為利用核酸、病毒或基因工程微生物將遺傳物質(zhì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄或翻譯轉(zhuǎn)移或整合到宿主基因組中來(lái)治療疾病[2]。數(shù)十年來(lái)，基因治療的研究在遺傳性疾病治療中取得重大因遺傳疾病，且已有基因治療相關(guān)藥物被開(kāi)發(fā)和基因遞送的熱門(mén)靶器官，因?yàn)楦闻K具有血流豐但逆轉(zhuǎn)錄病毒需刺激肝細(xì)胞、腺病毒引發(fā)炎癥、慢其衣殼結(jié)構(gòu)與野生型AAV類(lèi)似，但編碼序列被替換為表達(dá)盒，兼具安全肝毒性及遺傳毒性等問(wèn)題。由成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)和CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associatedprotein,Cas)組成的CRISPR/Cas系統(tǒng)源自細(xì)菌免疫機(jī)制，可通過(guò)Cas9蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的編輯或調(diào)控，但其體內(nèi)遞送仍具挑戰(zhàn)[5]。Wan等[6開(kāi)發(fā)的外泌體RNP系統(tǒng)利用肝星狀細(xì)胞來(lái)源的外泌體裝載Cas9RNP,實(shí)現(xiàn)肝特異性遞送，在多種肝病模型中顯示良好編輯效果與治療潛力。反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides,ASO)則通過(guò)堿基配對(duì)靶向RNA,調(diào)控剪接或降解mRNA,從而影響蛋白表達(dá)，屬于廣義基因治療策略[7-8]。顆粒(lipidnanoparticles,LNPs)可封裝mRNA,保護(hù)其免于降解，并通過(guò)內(nèi)吞作用遞送入細(xì)胞質(zhì)表達(dá)目標(biāo)蛋白[11]。LNP-mRNA技術(shù)具有特點(diǎn)與適用范圍，但其安全性、特異性及持久研究的方向。本綜述探討了幾種遺傳性肝臟疾1尿素循環(huán)障礙(ureacycledisorder,UCD)UCD指在尿素循環(huán)代謝過(guò)程中因?yàn)槊富蜣D(zhuǎn)運(yùn)體缺陷引起氨解毒或精氨酸合成障礙的一組遺傳代謝疾病，以血氨升高為主要特征[14]。與尿素循CPS)、精氨酸琥珀酸合成酶(argininosuccinatesynthetase,AS)、精氨酸琥珀酸裂解酶(argininosuccinatelyase,AL)、精氨酸酶(ornithinetranscarbamylase,OTC),基因突變導(dǎo)致任包裝能力需要使用兩個(gè)AAV載體的分裂方法[15]。然而，在CPS1缺存率、改善生長(zhǎng)、氨和血漿氨基酸濃度正常化的作用[16]。一項(xiàng)由Ultragenyx(NCT02991144)支持的首次在人體內(nèi)利用AAV8基因治療OTC缺乏癥的I/Ⅱ期臨床前研究結(jié)果表明，在11例接受治療的患者中有7例應(yīng)答者。一項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)正在登記中(NCT05345171)。此外，一項(xiàng)利用嗜肝AAV-LK03載體針對(duì)兒童OTC缺乏癥的臨床試驗(yàn)顯示了在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中的安全性，目前正處于招募階段[17-18]。AAV-LK03對(duì)人肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果似乎優(yōu)于AAV8,這與其他研究的觀察兒童發(fā)育中的肝細(xì)胞增殖導(dǎo)致基因組丟失或機(jī)體的抗AAV免疫反應(yīng)相關(guān) [19]。Yang等[20]通過(guò)CRISPR-Cas9編輯單個(gè)錯(cuò)義突變，糾正高氨血癥，在OTC缺陷小鼠中成功地進(jìn)行了基因校正。然而，由于在尿素循環(huán)障礙中缺乏疾病常見(jiàn)的突變，突變特異性者。為了克服這個(gè)問(wèn)題，Cunningham等[21]開(kāi)發(fā)了一種雜交rAAV/piggyBac轉(zhuǎn)座子載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)結(jié)合了rAAV的高效肝臟靶向特性和piggyBac轉(zhuǎn)座子載體的穩(wěn)定介導(dǎo)能力，將目的基因轉(zhuǎn)座到肝細(xì)胞基因組中，并在兩種尿素循環(huán)缺陷小鼠模型中均法在OTC缺陷小鼠模型[22]、AL缺陷肝臟及ARG缺陷小鼠模型[24]中均已顯示出有效的肝臟靶向和基因糾正作潛力，但目前暫無(wú)相關(guān)的臨床試驗(yàn)結(jié)果發(fā)表。Citrin缺乏癥(citrindeficiency,CD)是一種常染色體隱性遺傳的尿素循環(huán)障礙，由SLC25A13基因的雙等位基因功能喪失變異引起。Citrin蛋白是一種線(xiàn)粒體內(nèi)鈣結(jié)合天冬氨酸/谷氨酸載體(aspartate/glutamatecarrier,AGC)蛋白。在尿素循環(huán)和能量代謝中起關(guān)鍵作用型瓜氨酸血癥(adultonsetcausedbycitrindeficiency,Nc.469-2922G>T,該變異導(dǎo)致偽外顯子(SLC25A13-PE5)異常插入，從而產(chǎn)生含有提前終止密碼子的異常轉(zhuǎn)錄本[25]。通過(guò)將剪切轉(zhuǎn)換寡核這種策略為其他由深層內(nèi)含子變異引起的遺傳性肝臟疾病提供了治療思2a1-抗胰蛋白酶缺乏癥(alpha1-antitrypsindeficiency,AATD)AATD是一種以血清a1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏為特征的常染色體顯性系統(tǒng)，并保護(hù)肺泡和肺小管[26]。AAT蛋白由SERPINA1基因編碼，SERPINA1基因突變會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的突變型AAT(Z-AAT)在肝臟積聚[27],血清正常AAT降低，最終導(dǎo)致慢性肝病和(或)慢性肺病的發(fā)生[28]。肝移植是晚期肝硬化的唯一治療方法。目前AATD相關(guān)肝病的治療臨床研究旨在通過(guò)糾正或穩(wěn)定突變Z-AAT異常折疊以減輕肝臟一項(xiàng)基于ASORNA干擾的Fazirsiran(TAK-999/ARO-AAT)治療AATD相關(guān)肝病的Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究結(jié)果表明，全部患者(n=16)肝臟降低，且肝臟Z-AAT的濃度降低與組織炎癥改善呈現(xiàn)相關(guān)性[30]。同的實(shí)驗(yàn)和研究可以證明Fazirsiran對(duì)于降低Z-AAT累積、緩解肝臟損傷的作用，那么藥物治療AATD相關(guān)肝病將在未來(lái)成為可能。3糖原貯積病(glycogenstoragediseases,GSD)GSD是一組以糖原合成、分解或酵解缺陷為主要特征的罕見(jiàn)的單基因遺傳疾病，根據(jù)不同的病因分為各種類(lèi)型，以累及肝 [31]。其中，GSDIa與葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)缺乏相關(guān)，患者會(huì)出現(xiàn)低血糖、肝臟腫大、高脂血癥以及腎臟疾其他臨床對(duì)癥治療。已有相關(guān)研究表明，利用rAAV載體基因遞送治療GSDIa的犬模型和小鼠模型，均可實(shí)現(xiàn)顯著的基因糾正，預(yù)防低血糖的發(fā)生，存活率延長(zhǎng)，但并不能徹底阻止肝臟受累的進(jìn)展[32-34]。一項(xiàng)正在進(jìn)行的I/Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT03517085)的初步數(shù)據(jù)表明，禁食耐受性的增加具有一定程度的療效。一項(xiàng)由Ultragenyx開(kāi)發(fā)的基于單鏈AAV8實(shí)驗(yàn)性基因療法治療GSDIa的治療藥物DTX-401已完成I/Ⅱ期臨床試驗(yàn)，所有患者(n=9)都表現(xiàn)出了玉米淀粉需求量下降、低血糖Ia的I/Ⅱ期臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谡心糋SDIa成人和兒童患者。有研究設(shè)計(jì)了一種基于CRISPR/Cas9的雙鏈DNA寡核苷酸(dsODN)插入突變小鼠模型觀察到顯著療效，單次或多次給約4%,維持血糖穩(wěn)定并預(yù)防低血糖發(fā)作，且效果可持續(xù)至少16周[35]。目前該方法尚未運(yùn)用于臨床領(lǐng)域，但相比AAV載體的基因替代療法，基4Crigler-Najjar綜合征(Crigler-Najjarsyndrome,CNS)CNS是一種與尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1缺乏有關(guān)的罕見(jiàn)的常染膽紅素，肝移植是唯一根治性治療方法。一項(xiàng)基于AAV8的基因治療的I/Ⅱ期研究的劑量增加部分結(jié)果顯示，接受最低劑量的患者膽紅素水平顯著降低[36]。接受更高劑量治療的2例患者(n=3)可以停止光療，第DeCaneva等[38]為了提高肝臟基因靶向白蛋白位點(diǎn)的治療效果，將GeneRide與靶向插入位點(diǎn)的CRISPR/SaCas9系統(tǒng)結(jié)合，發(fā)現(xiàn)在CNS位未觀察到脫靶效應(yīng)，也沒(méi)有腫瘤發(fā)生。一項(xiàng)基于GeneRide聯(lián)合CRISPR/SaCas9成功挽救CNS小鼠致死性模型的研究表明，插入的轉(zhuǎn)基因在肝細(xì)胞增殖過(guò)程中能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染給子治療提供了新的思路和方法[39]。然而，該方法尚未運(yùn)用于臨床領(lǐng)域，5肝豆?fàn)詈俗冃愿味範(fàn)詈俗冃杂址Q(chēng)Wilson病(Wilsondisease,WD),是一種常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙性疾病，由ATP7B基編碼銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶，基因突變會(huì)導(dǎo)致ATP酶活性降低或消失，血清腎損傷等[40]。目前WD的治療包括忌銅飲食，以金屬螯合劑和鋅鹽ATP7B基因大小5.2kb,達(dá)到最大AAV包裝容量。miniATP7B基因其中6個(gè)金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的4個(gè)從野生型ATP7B的編碼序列中缺失，包裝在嗜肝AAV-Anc80衣殼中，并在WD成年小鼠中成功實(shí)驗(yàn)，在提高存活率、恢復(fù)銅穩(wěn)態(tài)和防止肝損傷方面具有相似的療效[41]。一種為了獲得全長(zhǎng)的ATP7B蛋白利用雙AAV載體編碼野生型轉(zhuǎn)基因的同源重組策略的分裂方法也成功地治療了WD小鼠[42]。已有臨床前數(shù)據(jù)表明，AAV介導(dǎo)的無(wú)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因在白蛋白(Alb)基因座內(nèi)的靶向整合已被開(kāi)發(fā)為一種安全有效的肝臟定向基因組編輯方法。將無(wú)啟動(dòng)子的miniATP7B基因的cDNA整合到白蛋白基因座中，在WD小鼠模型中使用AAV-Alb-mini-ATP7B能導(dǎo)致基因組編輯的肝細(xì)胞比未編輯的肝細(xì)胞具有增殖優(yōu)勢(shì)，并改善肝損傷和銅代謝[43]。此外，與單獨(dú)使用螯合療法病改善。這種無(wú)核酸酶的基因編輯方法，可能代表了一種新型的、比WD6進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥(progressivefamilialintrahepaticPFIC是一組罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳疾病[44]。PFIC患者的發(fā)病從新之前發(fā)展為肝硬化和肝衰竭[45]。根據(jù)致病基因不同，PFIC分為1~6型，分別由ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2、NR1H4基因突變導(dǎo)致。以熊去氧膽酸(ursodeoxycholicacid,UDCA)為首的適用于所有疾病類(lèi)型，基因治療的治療效果也受突變類(lèi)型的影響[46]。大量臨床前研究表明，有些PFIC類(lèi)型具有肝外臨床表現(xiàn)，會(huì)影響肝臟靶會(huì)降低臨床治療安全性；非整合載體(例如AAV)的基因治療在兒科患者[47]。一項(xiàng)在進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥3型(PFIC3)小鼠模型中使用肝細(xì)胞移植的研究結(jié)果表明，植入12%的健康肝細(xì)胞足以達(dá)到治療效果，這意味著ABCB4基因突變所致的PFIC3型在肝臟基因治療方面比其他的PFIC類(lèi)型具有優(yōu)勢(shì)[48]。已有研究表明使用非整合性AAV載體對(duì)引起肝細(xì)胞增殖的疾病進(jìn)行長(zhǎng)期矯正是可行的，但前提是療效足夠[49]。如果療效不夠、糾正不充分，持續(xù)的肝細(xì)胞增殖將導(dǎo)致AAV載體的丟失，進(jìn)一步減少膽汁中的磷脂酰膽堿水基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的穩(wěn)定性比治療成年動(dòng)物差，出現(xiàn)AAV載體的丟失，以及療效的降低增快[50]。為了克服這個(gè)障礙，Siew等[51]嘗試了一種整合基因組成，兩側(cè)是piggyBac轉(zhuǎn)座酶短末端重復(fù)序列。將該構(gòu)建體與含有piggyBac表達(dá)盒的AAV2/8載體共同施用于幼年小鼠，可以整合治療構(gòu)建體，提供終身hABCB4表達(dá)并糾正疾病。近期一項(xiàng)基于攜帶ABCB4基因序列的rAAV載體治療PF