免疫學檢驗相關知識

與儀器維護

深圳龍城醫(yī)院檢驗科

唐敬強免疫學基礎知識(一)抗原抗體反應的特點1.高度特異性2.表面化學基團之間的可逆結(jié)合3.適宜的抗原抗體濃度和比例4.抗原抗體反應的兩個階段（第一階段為抗原與抗體的特異性結(jié)合階段，快，但無可見反應。第二階段為抗原與抗體反應的可見階段，出現(xiàn)凝集、沉淀、補體結(jié)合等反應。此反應慢，需要幾分鐘至幾十分鐘，并受電解質(zhì)、溫度、酸堿度等因素的影響）免疫學基礎知識(二)適宜的抗原抗體濃度和比例1.抗原或抗體過剩，形成的IC復合物體積小，數(shù)量少,肉眼不可見。2.抗原抗體濃度和比例適當，IC復合物體積大，數(shù)量多，肉眼可見?？乖贵w反應影響因素1.在適當濃度的電解質(zhì)中:實驗中常用0.85%的NaCL等離子溶液作稀釋液。2.抗原抗體反應的最適溫度，一般常使用反應在37℃水浴或孵育箱中進行。3.最適酸堿度:pH6-8。凝集反應(1)直接凝集反應:顆粒性抗原直接與相應的抗體反應出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象，如紅細胞的凝集(ABO血型)、細菌凝集。玻片法:定性，ABO血型、菌種鑒定試管法：半定量，檢測Ab的效價。(2)間接凝集反應：將可溶性抗原或抗體先吸附在某些顆粒載體上，然后與相應抗體或抗原進行反應產(chǎn)生的凝集現(xiàn)象。沉淀反應沉淀反應:毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應抗體反應后，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物。1.液相:環(huán)狀、絮狀沉淀反應，比濁法等。2.半固相:單向、雙向瓊脂擴散、免疫電泳。ELISA常用的酶標記物1.辣根過氧化酶（HRP）

底物：1）鄰苯二胺（OPD）穩(wěn)定性差，有致異變性。2）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）從無色變藍色，加酸終止變黃，目前國內(nèi)多用。2.堿性磷酸酶（AP）底物采用對硝基笨磷酸酯（P-NPP）,產(chǎn)物黃色。穩(wěn)定性較HRP差，價格高，國內(nèi)采用少。ELISA操作的注意要點（一）加樣1.一般需進行4-5次加樣，所以在定量測定中加樣量應力求準確。2.標本和結(jié)合物的稀釋液應按規(guī)定配制。3.加樣時不可太快,應將液體加在孔底,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產(chǎn)生氣泡。4.加在孔壁上部的非包被區(qū),易導致非特異吸附，濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染，出現(xiàn)氣泡則反應液界面有差異。ELISA操作的注意要點

（二）保溫1.保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。2.各ELISA板不應疊在一起。3.為避免蒸發(fā)應加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的盒中。（三）反應

加入底物后,反應的時間和溫度通常嚴格按試劑說明書要求。避免時間因素造成的影響。ELISA操作的注意要點（四）

洗滌1.洗滌在ELISA過程中,有時是決定實驗成敗的關鍵。

2.洗滌的目的是洗去反應液中沒有與固相蛋白或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應過程中非特異性吸附的干擾物質(zhì)。

3.洗滌如不徹底,特別在最后一次,如有酶結(jié)合物的非特異性吸附,將使空白值升高。酶標儀的使用1.打開酶標儀、電腦主機和顯示器開關。2.運行桌面“雷杜酶聯(lián)免疫管理平臺軟件中文版”程序,在主界面點擊快捷鍵“樣本測試”,進入布板程序界面。3.點擊“項目列表”后的方框,選擇待測板中要測試的項目。4.在屏幕上依次將板上放置的“空白孔”“陰性對照”、“陽性對照”、“樣本號”、“標準”和“質(zhì)控”對應設置。5.將待測板放置在板架上,關好蓋在屏幕左下角點擊“測量”按鈕,儀器開始測試。6.點擊“保存”按鈕將結(jié)果保存取出微孔板。酶標儀項目設置酶標儀維護與注意事項［日常維護］1.定期清潔儀器外殼以保持良好的外觀,用溫度適中的中性洗滌溶液浸濕柔軟的布后即可擦拭。2.如果儀器表面有生物危險物質(zhì)污染,請用中性消毒液清潔。[注意事項］1.嚴格遵照儀器使用說明書對儀器進行正確操作和日常維護和保養(yǎng)。2.將待測板放入酶標儀載物臺時,一定要卡牢,防止測試過程中卡板。3.將待測板放入酶標儀載物臺時,不可用力過猛,否則可能造成載物臺損壞,不能測試或影響精密度。4.當開機報“405mm光強過弱”時,要檢查燈泡是否亮,不亮則要更換新燈泡。ELISA檢測要注意的幾個問題1.ELISA如果要求是定量，必須有陰性、陽性對照，有條件加質(zhì)控孔。2.每個項目必須先檢測有陰性、陽性對照的測試板。3.洗板必須徹底干凈，防止清洗不干凈帶來的假陽性影響。4.對弱陽性結(jié)果或者1、2模式對立結(jié)果要進行必要的復查。5.陽性質(zhì)控樣本檢測不出溫育的時間或溫度不夠;顯色反應時間太短;所用配制緩沖液的燕餾水有問題。ELISA檢測要注意的幾個問題6.測定的重復性差,這是由于測定操作引起的問題包括：①加樣本及試量不準;孔間不一豫②加樣過快,孔間發(fā)生污染③加錯樣本④加樣本及試劑時,加在孔璧⑤不同批號試劑盒中組分混用⑥溫育時間、洗板、顯色時間不一致。7.全部孔都不顯色可能：①漏加結(jié)合物;②洗板液配制仲中出現(xiàn)問題①漏加顯色劑A或B④終止劑當顯色劑使用。8.全部板孔均有顯色①洗板不干凈②顯色液變質(zhì)。膠體金項目的結(jié)果判讀1.按項目操作說明書進行加樣。2.判讀時間要嚴格控制，切記不能隨便發(fā)出時間過長導致的陽性結(jié)果。3.對于弱陽性結(jié)果進行必要的復查。4.膠體金檢測的敏感度較ELISA低，準確性較差，適合大規(guī)模篩查。

5.膠體金有檢查方法局限性，盡量做好臨床的解釋工作。羅氏E601儀器校準校準是常規(guī)操作前的必要部分。使用Elecsys檢測特異性校準品。校準品由低到高順序安裝，不能放反。校準不得使用過期的校準品。羅氏E601日常操作羅氏E601操作注意事項1、操作過程中要戴手套,眼睛不要正視條碼閱讀器的光源,以免造成損傷。2、校準液和質(zhì)控液按照濃度低高的位置放,并要求從低到高在同一個架子并列。3、每天關機后,將試劑取出放回科室冰箱內(nèi)保存。4、盡量保持室溫恒定,空調(diào)風不要直吹向儀器。5、樣本水浴或離心要符合要求,以免存在凝塊。6、注意進樣推板位置正確,不要碰到運動中的部件,否則可能造成停機。7、如中文軟件發(fā)生任何問題,導致儀器檢測結(jié)果傳送失敗,儀器會自動斷開傳送開關。將中文軟件恢復后,需重新打開傳送開關:開始-通訊設置--更改,將通訊打開打上勾,點確定。羅氏E601每日保養(yǎng)a、擦洗樣品針/試劑針/Sipper針/預清洗Sipper針(亦可在關機后直接擦洗):綜合功能護—手動清洗(29)選擇,選擇E模塊,點執(zhí)行,先用蘸70%酒精的干凈紗布擦拭樣品針的表面和針尖,再用蘸蒸餾水的干凈紗布擦拭,最后用干凈紗布擦拭,完成后點停止,最后對整臺儀器進行復位,綜合功能—維護復位(1)b、擦洗儀器表面(亦可在關機后直接擦洗):開始——屏蔽——選擇模塊一確定——是,用消毒水擦拭屏蔽狀態(tài)的儀器表面,然后解除模塊的屏蔽。c、關機保養(yǎng)(工作結(jié)束保養(yǎng),儀器在待機狀態(tài)下方可進行)綜合功能維護一POWEROFF,選定E模塊及測量池1、2,完成后儀器回到待機狀態(tài)。各種檢測方法的比較檢測能力：膠體金＜ELISA＜化學發(fā)光假陽性：膠體金＜化學發(fā)光＜ELISA陽性結(jié)果準確度：膠體金＜ELISA＜化學發(fā)光影響因素最多：化學發(fā)光＜膠體金＜ELISA細菌感染免疫檢測1.抗鏈球菌溶血素“O”測定?病人感染A群溶血性鏈球菌一周后ASO開始升高，4-6周達高峰，可持續(xù)幾個月或幾年，見于活動性風濕熱、風濕性關節(jié)炎、急性腎小球腎炎、急性上呼吸道感染、皮膚軟組織感染。?抗體滴度逐步下降提示疾病緩解。2.肥達氏(Widal)反應：協(xié)助傷寒與副傷寒的診斷。參考值：傷寒O凝集價＜1：80，H凝集價＜1：160。副傷寒A、B、C凝集價<1：80。細菌感染免疫檢測3.結(jié)核桿菌抗體：輔助結(jié)核病的診斷。4.結(jié)核桿菌

抗體檢測：可以確定結(jié)核病的診斷，但應防止假陽性。5.C反應蛋白測定急性時相反應蛋白，增高見于：1).組織損傷2).各種細菌性感染3).風濕熱4).惡性腫瘤，器官移植后排斥反應，妊娠等病毒感染免疫檢測

1.漢坦病毒抗體IgM：協(xié)助腎綜合征出血熱早期診斷。2.乙腦病毒抗體IgM：協(xié)助乙腦的早期診斷。3.輪狀病毒抗體IgM、IgG；輪狀病毒RNA:陽性提示現(xiàn)癥感染。

4.柯薩奇病毒抗體IgM、IgGIgM陽性示現(xiàn)癥感染。當IgM抗體陰性IgG陽性提示既往感染

。5.EB病毒抗原、抗體測定：抗-VCAIgM陽性常見于傳染性單核細胞增多癥；抗-VCAIgA陽性主要見于鼻咽癌

。TORCH感染免疫檢測

1.弓形蟲抗體IgM和IgGIgM陽性提示現(xiàn)癥感染，IgG陽性提示既往感染。2.巨細胞病毒抗體IgM、IgG：IgM陽性示現(xiàn)癥感染或病毒活動期。IgG既往或潛伏感染。巨細胞病毒DNA:陽性提示現(xiàn)癥感染。3.風疹病毒抗體測定4.HSV抗體測定蛋白質(zhì)類腫瘤標志物：包括甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、癌抗原125（CA125）、癌抗原15-3（CA15-3）、組織多肽抗原（TPA）、前列腺特異抗原（PSA）鱗狀上皮細胞癌抗原（SCC）等。AFP主要用于原發(fā)性肝癌的輔助診斷，此外生殖腺胚胎癌、胃癌和胰腺癌血中AFP也可增高。CEA明顯增高見于胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和乳腺癌。CA125特別是卵巢癌水平明顯升高。CA15-3主要用于乳腺癌的輔助診斷和療效觀察。PSA可用于前列腺癌的輔助診斷、療效觀察以及轉(zhuǎn)移和復發(fā)判斷。SCC在上皮細胞源性惡性腫瘤中升高。糖脂類腫瘤標志物包括癌抗原-50（CA-50）、癌抗原72-4（CA72-4）、癌抗原242（CA242）、糖鏈抗原19-9（CA19-9）等。CA-50增高見于大部分惡性腫瘤，動態(tài)觀察其水平變化對癌腫療效、預后判斷、復發(fā)檢測頗有價值。CA72-4是卵巢腫瘤和胃腸道腫瘤的標志物。CA242是胰腺癌和結(jié)腸癌的標志物。CA19-9在胰腺癌、膽道腫瘤和胃腸道癌中水平明顯升高。酶類腫瘤標志物包括前列腺酸性磷酸酶（PAP）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、異常凝血酶原（APT）、α-L-巖藻糖苷酶（AFU）等。PAP對前列腺癌的療效觀察、有無復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后判斷有重要意義。NSE是神經(jīng)母細胞瘤和小細胞肺癌的標志物。APT和AFU在肝細胞肝癌中水平明顯升高。自身免疫檢測1.抗核抗體?ANA陽性：血清滴度>1：40為陽性。最多見于未治療的SLE，活動期SLE幾乎100%陽性。也可見于其他自身免疫性疾病。2.抗脫氧核糖核酸測定：分為抗雙鏈DNA抗體（ds-DNA）、抗單鏈DNA抗體（ss-DNA）、抗Z-DNA抗體?？闺p鏈DNA抗體的檢測有重要的臨床意義，它