實(shí)驗(yàn)五

禽流感的血清學(xué)診斷

（血凝與血凝抑制試驗(yàn)）

實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容1234567禽流感概述病原分離實(shí)驗(yàn)原理器材與試劑病原分離接種雞胚HA-HI禽流感病毒（AIV）感染禽后可引起各種綜合征，從無(wú)臨診癥狀感染到呼吸道疾病和產(chǎn)蛋下降，到死亡率接近100%的嚴(yán)重全身性疾病。迄今為止，高致病性AIV都是H5和H7血清亞型，而所有其它亞型毒株對(duì)禽類均為低致病性（MP）。病禽和帶毒禽是主要傳染源。鴨、鵝等和野生水禽在本病傳播中起重要作用，候鳥也可能起一定作用。感染途徑為呼吸道和消化道。本病雖無(wú)明顯季節(jié)性，但常常以冬春季多發(fā)。流行病學(xué)?低致病性禽流感（MPAI）MPAI病毒在野禽中大多數(shù)不產(chǎn)生臨診癥狀。雞和火雞的表現(xiàn)為呼吸、消化、泌尿和繁殖器官的異常。?高致病性禽流感（HPAI）急性敗血性，呼吸困難、腹瀉、高熱、神經(jīng)癥狀。發(fā)病率和死亡率很高（50～90%），有的雞群可達(dá)100%。臨床癥狀因宿主種類和免疫狀態(tài)、病毒致病性等不同而有很大差異。?MPAI病理變化主要在呼吸道，尤其是竇的損害，以卡他、纖維性、膿性或纖維膿性炎癥為特征。?HPAI

在內(nèi)臟器官和皮膚有各種水腫、出血和壞死，最急性型可能無(wú)大體病理變化。病理變化有些病毒具有凝集某種(些)動(dòng)物紅細(xì)胞的能力，利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱血球凝集(HA)試驗(yàn)，以此來推測(cè)被檢材料中有無(wú)病毒存在，是非特異性的，但病毒的凝集紅細(xì)胞的能力可被相應(yīng)的特異性抗體所抑制，即血球凝集抑制(HI)試驗(yàn)，具有特異性。通過HA-HI試驗(yàn)，可用已知血清來鑒定未知病毒，也可用已知病毒來檢查被檢血清中的相應(yīng)抗體和滴定抗體的含量。實(shí)驗(yàn)原理掌握HA和HI試驗(yàn)的基本操作技術(shù)，了解其實(shí)用價(jià)值。目的與要求96孔“V”形微量反應(yīng)板,100uL加樣器，槍頭。2.生理鹽水，0.5%雞紅細(xì)胞懸液，禽流感病毒液（尿囊液或凍干疫苗液），禽流感陽(yáng)性血清，被檢雞血清。器材與試劑在感染初期或發(fā)病急性期從死禽或活禽采取。死禽采集氣管、肺、肝、腎、脾、泄殖腔等組織樣品。組織樣品先用肉湯培養(yǎng)基或PBS制成10~20（W/V）的懸液，1000r離心10min，取上清液作為試驗(yàn)樣品。為防止細(xì)菌污染，應(yīng)加入以下抗生素：青霉素2000μg，鏈霉素2000g，卡那霉素1000g（每毫升培養(yǎng)液中所含）。樣品離心后也可用細(xì)菌過濾器過濾除菌。病毒分離病毒分離活禽用大小不等的滅菌棉拭子涂擦喉頭、氣管或泄殖腔，然后將帶有分泌物的棉拭子放入每毫升含有1000μg青霉、2000μg鏈霉素pH7.2~7.6的肉湯中，無(wú)肉湯時(shí)可用Hanks液或25%~50%的甘油鹽水。小珍禽用拭子取樣易造成損傷可取而代之以采集新鮮糞便。將棉拭子充分捻動(dòng)、擰干后除去拭子，樣品液經(jīng)1000r離心10min，取上清液作為接種材料。常用9～10日齡的雞胚，每份病料至少注入5個(gè)雞胚，接種于絨毛尿囊膜或尿囊內(nèi)，操作方法如下。1．照蛋，劃出氣室位置，在雞胚胎面觀看胚胎活動(dòng)，選擇無(wú)大血管處標(biāo)一記號(hào)。2．在氣室頂部和標(biāo)記處用碘酊和酒精消毒，并各鉆一小孔。3．用較干的碘酊棉球涂布小孔。接種雞胚4．用1毫升注射器吸取上述處理過的材料，插入小孔內(nèi)約3mm，緩緩注入0.1～0.2毫升，拔出針頭。5．用融化石臘封口，在蛋殼上標(biāo)明日期。6．置37℃溫箱培養(yǎng)，每天照蛋二次，至全部或大部分雞胚發(fā)生死亡為止（24小時(shí)內(nèi)死亡的胚棄之）。7．將死胚收藏于4℃冰箱內(nèi)，氣室向上，6～24小時(shí)獲尿囊液。接種雞胚1.在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加50μL生理鹽水。2.于左側(cè)第1孔加50μL病毒液（尿囊液或凍干疫苗液），混合均勻后，吸50μL至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，吸棄50μL；第12孔為紅細(xì)胞對(duì)照。3.自右至左依次向各孔加入0.5%雞紅細(xì)胞懸液50μL，在振蕩器上振蕩，室溫下靜置后觀察結(jié)果。血凝（HA）試驗(yàn)96孔板孔號(hào)1234567891011對(duì)照生理鹽水505050……..505050病毒505050……..5050紅細(xì)胞505050……..505050病毒稀釋倍數(shù)1：21：41：8……..1:10241:2048結(jié)果判定####

#

#

#

+

+﹣﹣﹣棄去50μL以100%凝集病毒最大稀釋孔為該病毒的凝集價(jià)血凝（HA）試驗(yàn)

4.結(jié)果判定：從靜置后10min開始觀察結(jié)果，待對(duì)照孔紅細(xì)胞已沉淀即可進(jìn)行結(jié)果觀察。紅細(xì)胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100%凝集（#），不凝集者（-）紅細(xì)胞沉于孔底呈點(diǎn)狀。以100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價(jià)，即為一個(gè)凝集單位。例如表中，該禽流感病毒液的血凝價(jià)為1:128，則l:128為1個(gè)血凝單位，1:64、l:32分別為2、4個(gè)血凝單位，或?qū)?28/4=32，即1:32稀釋的病毒液為4個(gè)血凝單位。血凝（HA）試驗(yàn)1.根據(jù)HA試驗(yàn)結(jié)果，確定病毒的血凝價(jià)，配制出4個(gè)血凝單位的病毒液。2.在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，用固定病毒稀釋血清的方法，自第1孔至第11孔各加50uL生理鹽水。3.第1孔加被檢雞血清50uL，吹吸混合均勻，吸50uL至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，吸棄50uL，稀釋度分別為：1:2、1:4、1:8……；第12孔加禽流感陽(yáng)性血清50uL，作為血清對(duì)照。血凝抑制（HI）試驗(yàn)4.自第1孔至12孔各加50uL4個(gè)血凝單位的禽流感病毒液，其中第11孔為4單位禽流感病毒液對(duì)照，振蕩混合均勻，置室溫中作用10min。

5.自第l孔至12孔各加0.5%雞紅細(xì)胞懸液50uL，振蕩混合均勻，室溫下靜置后觀察結(jié)果。血凝抑制（HI）試驗(yàn)血凝抑制（HI）試驗(yàn)

孔號(hào)12345678910病毒對(duì)照血清對(duì)照血清稀釋倍數(shù)1：21：41：8……..1：1024生理鹽水505050……..505050血清505050……..50504單位病毒505050……..50150

振蕩1分鐘，室溫10分鐘

棄50μL紅細(xì)胞懸液50505050……..5050

振蕩1分鐘，室溫10分鐘結(jié)果判定﹣﹣－－

＋

＋

#####﹣以100%抑制凝集的血清最大稀釋度為該血清的滴度，即血清效價(jià)6.結(jié)果判定：待病毒對(duì)照孔（第11孔）出現(xiàn)紅細(xì)胞100%凝集（#），而血清對(duì)照孔（第12孔）為完全不凝集（-）時(shí)，即可進(jìn)行結(jié)果觀察。

以100%抑制凝集（完全不凝集）的被檢血清最大稀釋度為該血清的血凝抑制效價(jià)，即HI效價(jià)。凡被已知禽流感陽(yáng)性血清抑制血凝者，該病毒為禽流感病毒。例如表中血清的HI效價(jià)為1:64，用以2為底的負(fù)對(duì)數(shù)(-log2)表示，即6log2。判定標(biāo)準(zhǔn)：HI效價(jià)小于或等于3lg2判定HI試驗(yàn)陰性；HI效價(jià)等于4lg2為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)；HI效價(jià)大于或等于5lg2為陽(yáng)性血凝抑制（HI）試驗(yàn)禽流感滅活疫苗免疫效果判斷：HI抗體效價(jià)≥4log2(1:16)為免疫合格。禽流感弱毒疫苗免疫效果判斷：雞群免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率≥50%判定合格。正常合格為從高