臨床基因擴增檢驗技術(shù)人員PCR上崗證培訓(xùn)考試試題及答案一、單項選擇題（每題2分，共30分）1.以下PCR反應(yīng)的基本步驟中，溫度最高的是：A.變性B.退火C.延伸D.冷卻答案：A（變性溫度通常為9495℃，退火約5565℃，延伸約72℃）2.實時熒光PCR中，SYBRGreenI染料的作用是：A.特異性結(jié)合目標(biāo)DNAB.非特異性嵌入雙鏈DNAC.標(biāo)記引物末端D.降解探針釋放熒光答案：B（SYBRGreenI為非特異性熒光染料，嵌入雙鏈DNA后發(fā)出熒光）3.臨床基因擴增實驗室的核心工作區(qū)域不包括：A.試劑準備區(qū)B.樣本處理區(qū)C.細菌培養(yǎng)區(qū)D.擴增產(chǎn)物分析區(qū)答案：C（核心區(qū)域為四區(qū)：試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)）4.為避免PCR污染，實驗服的正確使用要求是：A.各區(qū)域共用同一件實驗服B.不同區(qū)域?qū)嶒灧伾珔^(qū)分，不可跨區(qū)穿著C.實驗服每日清洗后可跨區(qū)使用D.僅樣本處理區(qū)需穿實驗服答案：B（各區(qū)域?qū)嶒灧鑼Ｓ?，避免交叉污染?.關(guān)于PCR引物設(shè)計的基本原則，錯誤的是：A.引物長度以1825個堿基為宜B.引物GC含量應(yīng)控制在40%60%C.引物3’端可設(shè)計為A或T以提高特異性D.避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)答案：C（引物3’端應(yīng)避免A/T，優(yōu)先選擇G/C以增強結(jié)合穩(wěn)定性）6.實時熒光PCR中，Ct值的定義是：A.熒光信號達到設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)B.擴增產(chǎn)物達到平臺期的循環(huán)數(shù)C.引物退火的最佳溫度D.標(biāo)準曲線的斜率答案：A（Ct值即CycleThreshold，熒光信號超過閾值時的循環(huán)次數(shù)）7.臨床樣本核酸提取時，若使用磁珠法，關(guān)鍵步驟是：A.加入蛋白酶K消化B.磁珠與核酸在高鹽低pH環(huán)境中結(jié)合C.75%乙醇洗滌去除蛋白質(zhì)D.高溫變性破壞病毒結(jié)構(gòu)答案：B（磁珠法利用高鹽低pH條件下核酸與磁珠結(jié)合，低鹽高pH條件下洗脫）8.實驗室發(fā)生樣本潑灑時，應(yīng)首先：A.用75%乙醇直接擦拭B.覆蓋含有效氯2000mg/L的消毒巾30分鐘C.通知主管人員D.更換被污染的實驗服答案：B（高濃度含氯消毒劑需先覆蓋消毒，再清理）9.以下哪項不是PCR實驗室室內(nèi)質(zhì)控的必需項目：A.陽性對照B.陰性對照C.空白對照（無模板）D.第三方室間質(zhì)評樣本答案：D（室間質(zhì)評屬于室間質(zhì)量評價，非室內(nèi)質(zhì)控必需）10.擴增產(chǎn)物分析區(qū)的主要風(fēng)險是：A.試劑配置錯誤B.樣本核酸降解C.氣溶膠污染導(dǎo)致假陽性D.儀器溫度偏差答案：C（擴增產(chǎn)物含大量目標(biāo)DNA，易形成氣溶膠污染其他區(qū)域）11.關(guān)于定量PCR標(biāo)準曲線的制備，正確的是：A.標(biāo)準品需與樣本來源不同B.標(biāo)準品濃度梯度至少5個數(shù)量級C.相關(guān)系數(shù)（R2）應(yīng)≤0.95D.斜率絕對值應(yīng)＞3.8答案：B（標(biāo)準品需與樣本同源，R2應(yīng)≥0.98，斜率范圍通常為3.1~3.6）12.核酸提取時，若樣本中存在大量蛋白質(zhì)，可能導(dǎo)致：A.Ct值偏低B.擴增效率升高C.酶活性抑制D.熒光信號增強答案：C（蛋白質(zhì)殘留可能抑制Taq酶活性，導(dǎo)致擴增失敗或Ct值偏高）13.實驗室高壓蒸汽滅菌的標(biāo)準條件是：A.100℃，30分鐘B.121℃，1520分鐘C.134℃，5分鐘D.65℃，60分鐘答案：B（壓力蒸汽滅菌常規(guī)條件為121℃，1520分鐘，用于耐濕熱物品）14.以下哪種情況會導(dǎo)致PCR結(jié)果假陰性：A.樣本中存在擴增抑制物B.引物與目標(biāo)序列錯配C.擴增儀溫度偏差（退火溫度過高）D.以上均是答案：D（抑制物、引物錯配、退火溫度過高均可能導(dǎo)致擴增失敗）15.臨床基因擴增檢驗報告的基本內(nèi)容不包括：A.患者姓名、性別、年齡B.檢測方法及儀器型號C.實驗室生物安全等級D.檢測結(jié)果及參考范圍答案：C（報告需包含患者信息、方法、結(jié)果，但無需標(biāo)注實驗室安全等級）二、多項選擇題（每題3分，共15分，多選、少選、錯選均不得分）1.臨床PCR實驗室的污染來源包括：A.擴增產(chǎn)物氣溶膠B.樣本間交叉污染C.試劑中攜帶的外源性核酸D.實驗人員皮膚脫落細胞答案：ABCD（以上均為常見污染來源）2.核酸提取質(zhì)量的評價指標(biāo)包括：A.濃度（OD260）B.純度（OD260/OD280）C.完整性（電泳條帶）D.擴增效率（標(biāo)準曲線斜率）答案：ABC（擴增效率反映PCR體系性能，非核酸提取直接評價指標(biāo)）3.實時熒光PCR儀的日常維護內(nèi)容包括：A.清潔光學(xué)系統(tǒng)（如鏡頭、濾光片）B.校準溫度模塊C.更換損壞的熱蓋密封墊D.定期進行核酸污染清除答案：ABCD（均為儀器維護的關(guān)鍵步驟）4.關(guān)于實驗室生物安全，正確的操作是：A.樣本處理時佩戴N95口罩、護目鏡B.銳器（如移液器吸頭）直接投入普通垃圾桶C.實驗結(jié)束后用75%乙醇擦拭臺面D.離心時使用帶螺旋蓋的離心管答案：ACD（銳器需投入專用防刺容器，不可混入普通垃圾）5.以下哪些情況需重新進行室內(nèi)質(zhì)控：A.更換PCR試劑批次B.維修后重新校準擴增儀C.更換核酸提取試劑盒D.連續(xù)5次檢測結(jié)果均在控答案：ABC（試劑、儀器、方法變更時需重新質(zhì)控，結(jié)果穩(wěn)定時無需）三、判斷題（每題1分，共10分，正確填“√”，錯誤填“×”）1.PCR實驗室各區(qū)域可根據(jù)工作需要逆向流動（如從產(chǎn)物分析區(qū)返回樣本處理區(qū)）。（×）2.陽性對照應(yīng)選擇與檢測樣本同源的高濃度核酸，Ct值通常在1525之間。（√）3.核酸提取時，為提高得率，可將樣本體積超過提取試劑盒規(guī)定的最大量。（×）4.擴增儀溫度校準應(yīng)使用經(jīng)計量認證的溫度驗證系統(tǒng)，每年至少1次。（√）5.醫(yī)療廢物需分類收集，感染性廢物需雙層黃色垃圾袋包裝，標(biāo)注“感染性廢物”。（√）6.SYBRGreen法比TaqMan探針法的特異性更高。（×）（探針法特異性更高）7.樣本保存不當(dāng)（如反復(fù)凍融）可能導(dǎo)致核酸降解，Ct值偏高或無擴增。（√）8.實驗室可使用普通冰箱（非專用）存放PCR試劑。（×）（需專用冰箱避免污染）9.結(jié)果判讀時，若陰性對照出現(xiàn)Ct值，說明實驗過程中存在污染，需重新檢測。（√）10.定量PCR中，標(biāo)準品的濃度必須與樣本濃度完全一致才能準確定量。（×）（通過標(biāo)準曲線外推即可）四、簡答題（每題5分，共20分）1.簡述PCR實驗室“四區(qū)一室”的功能及單向流程要求。答案：四區(qū)指試劑準備區(qū)（配制PCR反應(yīng)體系）、樣本處理區(qū)（核酸提?。?、擴增區(qū)（PCR擴增）、產(chǎn)物分析區(qū)（結(jié)果檢測）；一室指緩沖間（清潔區(qū)與污染區(qū)過渡）。單向流程要求：試劑準備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)，不可逆向流動，避免交叉污染。2.列舉3種PCR實驗中常見的污染控制措施。答案：①各區(qū)域?qū)Ｓ脙x器、耗材（如移液器、離心管）；②使用帶濾芯吸頭防止氣溶膠污染；③實驗前后用紫外線照射或含氯消毒劑清潔臺面；④設(shè)立陰性、空白對照監(jiān)測污染；⑤嚴格區(qū)分清潔區(qū)與污染區(qū)工作服。3.簡述實時熒光PCR中“閾值”的設(shè)定原則及意義。答案：閾值設(shè)定原則：通常位于指數(shù)擴增期的起始階段，熒光信號顯著高于基線噪音（一般為315個循環(huán)的熒光信號標(biāo)準差的10倍）。意義：用于準確定量Ct值，避免平臺期信號干擾，確保不同反應(yīng)管間Ct值的可比性。4.核酸提取過程中，若檢測到樣本OD260/OD280比值＜1.8，可能的原因及處理措施是什么？答案：可能原因：蛋白質(zhì)污染（如裂解不充分、洗滌不徹底）或苯酚殘留。處理措施：①增加洗滌步驟（如用75%乙醇多洗1次）；②延長離心時間確保磁珠/沉淀完全分離；③檢查裂解液是否有效（如蛋白酶K是否失效）；④必要時重復(fù)提取或更換提取試劑盒。五、案例分析題（共25分）某實驗室進行新冠病毒核酸檢測時，出現(xiàn)以下情況：陽性對照Ct=18（正常范圍1525）；陰性對照Ct=32（正常應(yīng)無Ct值）；3份患者樣本Ct值分別為：28、30、無擴增（NTC）。問題：1.分析陰性對照出現(xiàn)Ct值的可能原因（5分）；2.患者樣本“無擴增”的可能原因（5分）；3.針對上述情況，應(yīng)采取的處理措施（15分）。答案：1.陰性對照Ct=32的可能原因：①擴增產(chǎn)物氣溶膠污染（如產(chǎn)物分析區(qū)與其他區(qū)域未嚴格隔離）；②樣本處理區(qū)與擴增區(qū)物品交叉使用（如移液器、離心管跨區(qū)）；③試劑污染（如PCR混合液配制時混入目標(biāo)核酸）；④實驗人員操作不當(dāng)（如未戴手套或手套污染后接觸陰性對照）；⑤核酸提取時交叉污染（如樣本間移液器吸頭未更換）。2.患者樣本無擴增的可能原因：①樣本中病毒載量極低（低于檢測限）；②核酸提取失?。ㄈ缌呀庖菏?、磁珠未完全結(jié)合核酸）；③PCR反應(yīng)體系錯誤（如漏加Taq酶、引物濃度過低）；④擴增儀故障（如溫度模塊偏差導(dǎo)致退火/延伸失?。?；⑤樣本中存在抑制物（如血紅蛋白、黏液等抑制Taq酶活性）。3.處理措施：①立即終止實驗，標(biāo)記所有樣本為“無效”，禁止發(fā)布結(jié)果；②分析污染來源：檢查各區(qū)域清潔記錄（如紫外線照射時間、消毒劑使用情況），追溯陰性對照與患者樣本的操作流程（如是否使用帶濾芯吸頭、是否跨區(qū)操作）；③清除實驗室污染：用10%次氯酸鈉（有效氯10000mg/L）擦拭臺面