ICS65.020.30

CCSB43

43

湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB43/T2473—2022

濱湖水牛人工授精技術(shù)規(guī)程

Codeofpracticeforartificialinseminationofbinhubuff

2022-12-09發(fā)布2023-03-09實施

湖南省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB43/T2473—2022

目次

前言...............................................................................III

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3術(shù)語和定義........................................................................1

4牛基本條件........................................................................1

5冷凍精液的貯存....................................................................1

6輸精準(zhǔn)備..........................................................................2

7母牛發(fā)情鑒定......................................................................2

8輸精..............................................................................2

9妊娠檢查..........................................................................3

10記錄內(nèi)容.........................................................................3

附錄A（規(guī)范性）A輸精器具的清洗和消毒..............................................4

附錄B（規(guī)范性）發(fā)情外部表現(xiàn)癥狀、外生殖器官和卵巢的變化.............................5

附錄C（資料性）妊娠特異性糖蛋白（PAGs）診斷........................................6

附錄D（資料性）配種記錄表..........................................................7

I

DB43/T2473—2022

II

DB43/T2473—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由湖南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。

本文件由湖南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。

本文件起草單位：湖南省畜牧獸醫(yī)研究所、湖南省光大牧業(yè)科技有限公司、湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)

學(xué)院、瀏陽市農(nóng)業(yè)發(fā)展事務(wù)中心，長沙市動植物疫病預(yù)防控制中心。

本文件主要起草人：張佰忠、段洪峰、劉海林、朱立軍、宋武、張翠永、李劍波、易康樂、樊志堅、

劉東翔、文貴輝、李安定、薛爽、趙曉。

III

DB43/T2473—2022

濱湖水牛人工授精技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了濱湖水牛冷凍精液人工授精的冷凍精液與母牛要求、冷凍精液的貯存、輸精準(zhǔn)備、母

牛發(fā)情鑒定、輸精、妊娠檢查、記錄等技術(shù)要求。

本規(guī)程適用于濱湖水牛人工授精。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T4143牛冷凍精液

GB/T5458液氮生物容器

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

冷凍精液frozensemen

經(jīng)特殊方法處理，超低溫冷凍后可在液氮中（-196℃）長期保存的精液。

注：本文件冷凍精液特指細(xì)管冷凍精液。

冷凍精液解凍thawingoffrozensemen

冷凍精液使用前使冷凍精子重新恢復(fù)活力的處理方法。

發(fā)情鑒定estrusdetection

通過外部觀察或其他方法確定母牛發(fā)情程度的方法。

4?；緱l件

精液品質(zhì)

應(yīng)符合GB4143的要求。

母牛

健康、繁殖機(jī)能正常的發(fā)情母牛。

5冷凍精液的貯存

1

DB43/T2473—2022

冷凍精液應(yīng)浸泡在液氮生物容器中貯存，液氮生物容器應(yīng)符合GB/T5458有關(guān)規(guī)定。包裝好的冷

凍精液由一個液氮容器轉(zhuǎn)換到另一液氮容器時，在液氮容器外停留時間不得超過5s。

6輸精準(zhǔn)備

人員準(zhǔn)備

配種員應(yīng)修剪平指甲，戴好口罩，戴上手套。

器具準(zhǔn)備

接觸精液和母牛生殖道的輸精用器具均應(yīng)按附錄A要求清洗和消毒。

冷凍精液解凍

冷凍精液的解凍方法應(yīng)符合GB4143的要求。

精液質(zhì)量檢查

精液質(zhì)量應(yīng)符合GB4143的要求。

牛體衛(wèi)生

輸精前，用手掏凈母牛直腸宿糞后，再用溫水清洗母牛外陰部，消毒后擦拭干凈。

輸精裝槍

6.6.1采用金屬輸精器。

6.6.2剪去細(xì)管精液封口，剪口應(yīng)正，斷面應(yīng)齊。

6.6.3將剪去封口的細(xì)管精液迅速裝入輸精器管內(nèi)，步驟為：剪去封口端的為前端，輸精器推桿后退，

細(xì)管裝至管內(nèi)，輸精器插入塑料外套管，管口頂緊外套管中固定圈，輸精器管前推到頭，外套管后部與

輸精器后部螺紋處擰緊，卡式的外套則應(yīng)推入卡槽里，全部結(jié)合應(yīng)緊密。

7母牛發(fā)情鑒定

外部觀察

通過母牛的外部表現(xiàn)癥狀和外生殖器官的變化判斷母牛是否發(fā)情和發(fā)情程度，見附錄B。

直腸檢查

通過直腸檢查卵巢，觸摸卵泡發(fā)育程度，判斷發(fā)情程度及排卵時間，見附錄B。

8輸精

輸精時間確定

8.1.1觸摸卵泡

在卵泡壁薄、滿而軟、有彈性和波動感明顯接近成熟排卵時輸精一次；6h～10h卵泡仍未破裂，

再輸精一次。

2

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8.1.2外部觀察法

母牛接受爬跨后8h～12h是適宜輸精時間。如采用兩次輸精，第二次輸精時間為母牛接受爬跨后

12h～24h。青年母牛的輸精時間宜適當(dāng)提前。

輸精部位

子宮體，即子宮頸后端與子宮角間溝分岔部中間部位。

直腸把握輸精法

輸精員一手五指并握，呈圓錐形從肛門伸進(jìn)直腸，動作要輕柔，在直腸內(nèi)觸摸并把握住子宮頸，使

子宮頸把握在手掌之中，另一手將輸精器從陰道下口斜上方約45°角向里輕輕插入，雙手配合，輸精器

頭對準(zhǔn)子宮頸口，輕輕旋轉(zhuǎn)插進(jìn)，過子宮頸螺旋狀皺壁到達(dá)子宮體2cm～3cm即為輸精部位，把輸精器

推桿緩緩向前推動細(xì)管中棉塞，將精液注入子宮體，再緩慢撤出輸精器。

一頭母牛應(yīng)使用一支消毒塑料輸精外套管。

9妊娠檢查

外部觀察

妊娠母牛外部表現(xiàn)發(fā)情周期停止，食欲增進(jìn)，毛色潤澤，性情變溫和，行為變安穩(wěn)。懷孕中后期腹

圍增大，腹壁一側(cè)突出，甚至可觀察到胎動，乳房脹大。

直腸檢查

輸精后第二個情期未發(fā)情（40d左右），通過直腸觸摸檢查子宮，可查出兩側(cè)子宮角不對稱，孕側(cè)

子宮角較另側(cè)略大，且柔軟。60d后直腸觸摸孕側(cè)子宮角增大，可觸摸到胎囊。直腸觸摸妊娠側(cè)卵巢較

另側(cè)略大，并有妊娠黃體，黃體質(zhì)柔軟、豐滿，頂端能觸感突起物。

超聲波診斷

用B超檢查母牛的子宮及胎兒、胎動、胎心搏動等。

妊娠特異性糖蛋白（PAGs）診斷

對配種28d后的牛采血，用檢測試劑盒（PAG-ELISA）測定PAGs，按檢測試劑盒說明書操作，或按

附錄C規(guī)定操作。

10記錄內(nèi)容

包括母牛號、公牛號、母牛發(fā)情時間、發(fā)情情況、輸精時間、配種次數(shù)、輸精員、孕檢結(jié)果。記錄

內(nèi)容以表格方式記錄，見附錄D。

3

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

A輸精器具的清洗和消毒

A.1玻璃器皿

使用前用水浸泡和洗滌，有污物的宜用加洗滌劑的溫?zé)崴蛑亟j(luò)酸鉀洗液浸泡數(shù)小時后，用水洗凈

涼干備用。玻璃輸精管放置在電熱干燥箱160℃保持0.5h，自然冷卻后待用。

A.2金屬器械

金屬類輸精器洗凈后，置電熱干燥箱120℃保持lh，自然冷卻待用。

4

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B

B

附錄B

（規(guī)范性）

發(fā)情外部表現(xiàn)癥狀、外生殖器官和卵巢的變化

表B.1發(fā)情外部表現(xiàn)癥狀、外生殖器官和卵巢的變化

發(fā)情階段發(fā)情初期（不接受爬跨期）發(fā)情盛期（接受爬跨期）發(fā)情末期（拒絕爬跨期）

母牛興奮不安，哞叫，游

走，采食漸少，泌乳牛產(chǎn)奶母牛游走減少，其它牛爬跨母牛轉(zhuǎn)入平靜，其它牛爬

發(fā)情外部表現(xiàn)癥狀量降低，追逐、爬跨它牛而時站立不動、后肢張開，頻跨時，臀部避開，但很少奔

它牛爬跨不予接受，一爬即頻舉尾，接受爬跨。跑。

跑。

陰戶腫脹、松弛、充血、發(fā)黏液量減少，混濁黏稠。子

子宮頸口紅潤開張，陰道壁

亮，子宮頸口微張，有稀薄宮頸口緊閉，有少量濃稠黏

外生殖器官變化充血，黏液顯著增加，流出

透明黏液流出，陰道壁潮液，陰唇消腫起皺，尾根緊

大量透明而黏稠的分泌物。

紅。貼陰門。

卵巢變軟，光滑，有時略有

卵巢增大，卵泡突出變大，卵泡增大，波動明顯，泡壁

卵巢變化增大，卵泡開始生長，并突

直徑0.5cm～1.0cm。由厚變薄。

出于卵巢表面。

5

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C

C

附錄C

（資料性）

妊娠特異性糖蛋白（PAGs）診斷

C.1采集血樣品

用一次性采血針和5mL采血管，對配種28d～30d的母牛尾根酒精消毒采血2mL～3mL,采血管做

好標(biāo)記和填寫采樣單，靜置1h，3000g離心10min，離心后血清可直接用于檢測，不立即檢測的血清

轉(zhuǎn)入新的離心管，在-20℃冰箱內(nèi)保存。

C.2準(zhǔn)備檢測用品

準(zhǔn)備手套、吸管、洗瓶、移液槍、槍頭、恒溫箱，酶標(biāo)儀等，將試劑盒、樣品恢復(fù)至室溫，搖勻試

劑。

C.3加樣反應(yīng)

C.3.1將微孔板置于平整干凈的臺面上，用吸管分別向微孔內(nèi)加入50μL緩沖液，再加標(biāo)準(zhǔn)品（陽性

對照和陰性對照）和待測樣品150μL填寫加樣登記單，記錄下每個微孔的位置，確認(rèn)加樣準(zhǔn)確無誤。

C.3.2用封口膜將微孔板密封以防蒸發(fā)，輕輕搖勻，在20℃的恒溫培養(yǎng)箱孵育1h。

C.3.3孵育后，去掉膜，翻轉(zhuǎn)微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，再用洗液清洗微孔4次。

C.3.4洗滌后，向微孔內(nèi)加入檢測溶液，輕輕搖勻，隨后在20℃的恒溫培養(yǎng)箱孵育1h。

C.3.5孵育后，重復(fù)步驟A.3.3的洗板過程。

C.3.6洗滌后，再向孔內(nèi)加入酶標(biāo)抗體，輕輕搖勻幾次，隨后在20℃的恒溫培養(yǎng)箱孵育1h。

C.3.7孵育后，重復(fù)步驟A.3.3的洗板過程。

C.3.8加入顯色液孵育10min，再加入終止液即可觀察顏色變化。

C.4結(jié)果判斷

陽性：陽性對照孔和樣品孔呈藍(lán)色。

陰性：陽性對照孔呈藍(lán)色，樣品孔無顏色

可疑：陽性對照孔呈藍(lán)色，樣品孔顏色很淡。復(fù)檢1次。

6

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D

D

附錄D