2026屆新高考生物精準(zhǔn)沖刺復(fù)習(xí)PCR和電池1PCR的概念全稱：原理：操作環(huán)境：目的：優(yōu)點：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制可以在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎PCR擴(kuò)增儀大量基因模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過程，在體外快速擴(kuò)增特定的DNA片段。PCR某基因體內(nèi)DNA復(fù)制參與的組分在DNA復(fù)制中的作用PCR中參與的組分

反應(yīng)還需要其它條件：解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常為小的單鏈RNA）無需解旋酶，用高溫代替DNA（目的基因）模板4種脫氧核苷酸(dNTP)耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常與兩條模板鏈結(jié)合的2種短的單鏈DNA）如緩沖液（一般添加Mg2+）和控溫設(shè)備dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP）打開DNA雙鏈，破壞氫鍵提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸功能：①提供原料；②提供能量2PCR的進(jìn)行需要的條件激活Taq酶PCR技術(shù)體內(nèi)DNA復(fù)制相同點原則堿基互補(bǔ)配對條件DNA母鏈作為模板、引物(體內(nèi)引物RNA、體外引物DNA)、4種脫氧核苷酸為原料延伸方向新鏈都是從5′端向3′端延伸不同點解旋方式90℃以上高溫解旋解旋酶催化場所PCR擴(kuò)增儀主要在細(xì)胞核延伸用酶耐高溫的DNA聚合酶DNA聚合酶溫度控制溫度、需要在不同溫度下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)溫和條件過程結(jié)果大量的DNA片段(或目的基因)形成完整的子代DNA當(dāng)溫度超過______以上時，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條

。

(1)變性：氫鍵單鏈DNA變性90℃待擴(kuò)增的DNA片段3’3’5’5’3’5’3’5’不需要解旋酶思考：變性的溫度為何是90℃以上的一個溫度范圍，而不是95℃？因為變性的溫度與氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時，所需溫度也就越低。變性復(fù)性延伸3PCR的過程3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’思考：為什么需要引物？

引物結(jié)合在模板鏈的什么位置？①因為Taq酶不能從頭開始添加核苷酸。②引物結(jié)合在DNA模板鏈3'端位置，引導(dǎo)子鏈從5'端→3'端方向復(fù)制。當(dāng)溫度下降到

左右時，

種引物通過

與兩條單鏈DNA結(jié)合。

(2)復(fù)性：堿基互補(bǔ)配對50℃兩便于引物與互補(bǔ)DNA鏈結(jié)合變性復(fù)性延伸3PCR的過程當(dāng)溫度上升到______左右時，溶液中的4種_____________在耐高溫的________________________的作用下，根據(jù)_____________原則合成新的DNA鏈。

脫氧核苷酸DNA聚合酶72℃(3)延伸：(Taq酶)3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’Taq酶3’Taq酶3’思考1：為什么溫度要上升至72℃？72℃是Taq酶的最適溫度堿基互補(bǔ)配對思考1：Taq酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？Taq酶結(jié)合在引物的3’端變性復(fù)性延伸3PCR的過程DNA解鏈為單鏈高溫(95℃)變性低溫(50℃)復(fù)性中溫(72℃)延伸引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈Taq酶從引物起始進(jìn)行子鏈的合成PCR過程可以在PCR擴(kuò)增(PCR儀)中自動完成。3PCR的過程2、PCR擴(kuò)增過程中

需要源源不斷的加入。1、一個循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個循環(huán)的

。模板引物、原料第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪的產(chǎn)物第一輪循環(huán)的產(chǎn)物復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)含引物的DNA分子數(shù)含引物1的DNA分子數(shù)同時含引物1和2的DNA分子數(shù)消耗引物數(shù)量2n2n2n-12n-22n+1-224824813702626144PCR中的數(shù)量關(guān)系要求：1.寫出互補(bǔ)鏈的堿基序列，并注明方向。2.從①－④中選擇2個合適的位置設(shè)計引物，寫出引物的部分序列，并注明方向。5’-ATG……ATCGAGACCGGT……TAA-3’3’-TAC……TAGCTCTGGCCA……ATT-5’①②③④3’…ATT-5’5’-ATG…3’問題1：根據(jù)查詢的Bt基因編碼鏈序列，嘗試設(shè)計引物。1、PCR擴(kuò)增時至少需要____種引物，原因是________________________________________22、設(shè)計引物的要求：①2種引物之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，原因是：_______________________________。②同種引物之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，原因是：_________________________防止引物自身配對折疊防止引物之間配對，導(dǎo)致引物不能與模板鏈結(jié)合DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模ㄐ蛄胁煌┧伎?/p>

·

討論一般不是；擴(kuò)增的是兩種引物之間所對應(yīng)的特定DNA片段；問題2：PCR擴(kuò)增的是完整的模板DNA分子嗎？思考

·

討論設(shè)計引物時必須依據(jù)：目的基因的核苷酸序列

問題3：由此可知在擴(kuò)增目的基因時，引物是根據(jù)什么來設(shè)計的？PCR進(jìn)行的前提條件是：已知目的基因的DNA序列問題4：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在第幾輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段(即出現(xiàn)完整的目的基因)？5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’思考

·

討論引物A引物B第1輪產(chǎn)物第2輪產(chǎn)物第3輪產(chǎn)物模板鏈畫出PCR擴(kuò)增3輪的產(chǎn)物，注意標(biāo)出方向(虛線內(nèi)的為目的基因)

5’引物A引物B3’3’5’引物A引物B5’5’第1次第2次第3次引物A引物B5’5’引物A引物B3’3’引物A引物B引物A引物B引物A引物A引物B引物B問題5：若想在DNA兩側(cè)添加限制酶識別序列，可利用PCR技術(shù)對DNA進(jìn)行擴(kuò)增時，在引物A、B的

端分別添加限制酶識別序列。5’5PCR定點突變——重疊延伸PCR技術(shù)如何實現(xiàn)基因的定點突變？6PCR定點突變——大引物PCR技術(shù)

7反向PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列問題：當(dāng)DNA的某些序列已知，而需要擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列時，如何解決？①用限制酶切割該DNA②隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產(chǎn)物環(huán)化，這樣就獲得了已知序列兩側(cè)攜帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子。③以該已知序列為模板設(shè)計一對相反方向的特異性引物，該引物對已知序列反向，但對未知序列卻是相向的，從而得以擴(kuò)增出未知序列。擴(kuò)增未知序列

已知序列_______________________________________________________________________________②④7反向PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列

重組PCR技術(shù)是一項新的PCR技術(shù)，可將原來兩個不相關(guān)的DNA連接起來，組成一個新的分子。實驗小組從豬源大腸桿菌中擴(kuò)增得到LTB基因和ST1基因片段，用重組PCR技術(shù)構(gòu)建了LTB-ST1融合基因。融合基因的制備過程如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)設(shè)計引物時，引物P1與引物P2的堿基序列

互補(bǔ)；引物P2與引物P3的堿基序列應(yīng)

，目的是

。(2)為了使雜交鏈順利延伸子鏈，至少需要經(jīng)過2次循環(huán)才能得到用于雜交的目的鏈L、S，則第2次循環(huán)的目的是

。(3)雜交鏈延伸生成LTB-ST1融合基因的過程中，

（填“需要”或“不需要”）加入引物。在圖中標(biāo)出雜交鏈兩條母鏈的3′端和5′端。8重組（融合）PCR技術(shù)部分互補(bǔ)不能使LTB基因與STI基因的單鏈融合在一起為雜交鏈延伸子鏈起始部位提供3’端不需要3’3’5’5’問題：如何將兩個不相關(guān)的DNA連接起來？利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增（1）電泳：DNA分子具有_______________，在一定的________下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷________的電極移動，這個過程就是電泳?？山怆x的基團(tuán)pH相反利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物1實驗原理一般使用的電泳緩沖液pH=8，DNA分子帶

，在電場中DNA便向

泳動。負(fù)電荷正極磷酸電離形成的磷酸基團(tuán)帶負(fù)電樣品點樣孔應(yīng)靠近

極。負(fù)問題1：PCR的產(chǎn)物是什么？問題2：如何鑒定PCR的產(chǎn)物？DNA片段瓊脂糖凝膠電泳（2）鑒定方法：PCR的產(chǎn)物一般通過

來鑒定。瓊脂糖來源于紅藻的多糖，其主要成分為多聚半乳糖，瓊脂糖在水中一般加熱到90℃以上溶解，溫度下降到35-40℃時形成良好的半固體狀的凝膠。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（孔徑），孔徑大小與瓊脂糖凝膠濃度有關(guān)，濃度越高，孔徑越

，能夠通過的核酸分子越

。1實驗原理瓊脂糖凝膠電泳在凝膠中DNA分子的遷移速率與_____________、_________________和______等有關(guān)凝膠的濃度DNA分子的大小構(gòu)象小小利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物核酸染色劑常用的核酸染色劑有EB（溴化乙錠）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的堿基對之間，導(dǎo)致EB與DNA結(jié)合。嵌入核酸堿基間的EB能吸收300nm波長的紫外光，發(fā)出可見熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA分子的含量成正比。1實驗原理【問題1】DNA本身沒有顏色，怎么在結(jié)果中觀察到？【問題2】如何監(jiān)測電泳進(jìn)程？樣品密度小可能流入附近加樣孔，造成交叉污染。緩沖液中含有甘油或蔗糖等成分增加樣品密度，保證每個樣品都容易沉入各自的加樣孔中，防止飄散。1實驗原理①利用指示劑如溴酚藍(lán)，有顏色，使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣。②分子量較小，指示樣品遷移的速率及方向，移動到距凝膠前沿1-2cm時停止電泳。【問題3】如何保證加樣時DNA不會飄散到緩沖液中？【問題4】如何確定待測DNA分子的大小和含量？DNAMarker是

的片段，在實驗時和樣本DNA同時進(jìn)行凝膠電泳，通過對比兩者的遷移速率，可以大致估計

。樣本DNA的大小已知的DNA分子大小制備凝膠觀察鑒定進(jìn)行電泳電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。①熔化：②倒模:③凝固:3方法步驟利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物制備凝膠觀察鑒定進(jìn)行電泳將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（marker）。接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待

前沿遷移接近凝膠邊緣時，