2026屆新高考生物精準(zhǔn)沖刺復(fù)習(xí)基因工程的基本操作程序—目的基因的篩選和獲?。◤?fù)習(xí)課）

豬是生物醫(yī)學(xué)研究的重要模型。

中科奧格生物科技通過(guò)敲除介導(dǎo)免疫排斥的關(guān)鍵基因（如GGTA1、β4GalNT2、Neu5Gc），并插入人源基因（CD46、CD55、TBM），成功培育出適用于人體移植的基因編輯豬肝臟。

這項(xiàng)研究成果引起了各界的關(guān)注?！敬笄榫场浚?）從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選；（2）利用序列數(shù)據(jù)庫(kù)篩選；（3）利用序列比對(duì)工具篩選。（1）基因文庫(kù)（2）人工合成（3）PCR擴(kuò)增（常用）【回憶】基因工程的基本操作程序【小情境1】

研究人員介紹，在獲得基因編輯豬肝臟的過(guò)程中，第一步就是目的基因的篩選和獲取。他們采用最常用的體外PCR擴(kuò)增獲取了目的基因—CD46基因。目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)考向1PCR過(guò)程：

學(xué)生活動(dòng)一：完成學(xué)歷案上的例1。例1.研究人員在擴(kuò)增CD46基因的PCR反應(yīng)中加入了兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如下圖1所示；圖2是他們PCR的部分產(chǎn)物。下列有關(guān)此PCR過(guò)程的說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）DA．PCR過(guò)程包括高溫變性-低溫復(fù)性-升溫延伸三個(gè)環(huán)節(jié)B．PCR的復(fù)性溫度主要取決于引物的GC含量和長(zhǎng)度C．PCR第三輪復(fù)制得到8個(gè)DNA分子，其中有2個(gè)等長(zhǎng)的，也就是有2個(gè)CD46基因D.PCR循環(huán)4次需要的引物總數(shù)量為32個(gè)CD46基因目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)第一輪循環(huán)第二輪循環(huán)第三輪循環(huán)3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’非目的基因序列目的基因序列引物第一輪循環(huán)DNA數(shù)=2=21引物數(shù)=2=2*21-2DNA數(shù)=4=22引物數(shù)=6=2*22-2第二輪循環(huán)第三輪循環(huán)DNA數(shù)=8=23引物數(shù)=1個(gè)DNA分子，（PCR擴(kuò)增）n次循環(huán)后，形成的DNA數(shù)為2n，需要引物數(shù)為2×2n-2。2*23-2（方法一數(shù)學(xué)模型）方法二物理模型【歸納總結(jié)1】

1.PCR的原理：__________________（高頻考點(diǎn)）。2.經(jīng)過(guò)n次擴(kuò)增循環(huán)后，DNA數(shù)為

，需要引物數(shù)量為

。（也可構(gòu)建物理模型解題）3.第____輪循環(huán)可以得到完整的目的基因（引物結(jié)合在DNA分子內(nèi)部時(shí)）（易錯(cuò)點(diǎn)）。2n2n+1-2或2(2n-1)DNA的半保留復(fù)制三目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)考向1PCR過(guò)程：目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)考向2引物的選擇和設(shè)計(jì)：【小情境2】

研究人員介紹，為了精準(zhǔn)擴(kuò)增CD46基因，他們?cè)赑CR之前進(jìn)行了引物的選擇和設(shè)計(jì)。

學(xué)生活動(dòng)二：完成學(xué)歷案上的例2及【歸納總結(jié)2】。例2．下面是他們兩次實(shí)驗(yàn)的介紹，請(qǐng)完成相關(guān)填空：（1）第1次PCR時(shí)選擇的引物位置示意圖如下。請(qǐng)推導(dǎo)引物1與____鏈、引物2與

鏈

（填α或β）形成堿基互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系。βα1.引物結(jié)合位點(diǎn)始終是模板鏈的3’端。引物的作用：

為DNA聚合酶提供結(jié)合位點(diǎn)（引物的3’端）。CD46基因【歸納總結(jié)2】

目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)考向2引物的選擇和設(shè)計(jì)：引物擺放的位置不一定是它的結(jié)合位置，需要通過(guò)方向來(lái)判斷。（2）第2次選擇了自行設(shè)計(jì)引物。研究人員設(shè)計(jì)的兩組引物部分序列如下，經(jīng)過(guò)電泳鑒定發(fā)現(xiàn)PCR失敗。請(qǐng)寫出兩組引物設(shè)計(jì)不合理的原因：第1組：

；第2組：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效引物Ⅰ’自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效5’5’5’5’3’3’3’3’2.一般PCR引物設(shè)計(jì)的要求：（2）引物長(zhǎng)度一般為20-30bp（教材P77）：過(guò)短（<18bp）的引物特異性低，過(guò)長(zhǎng)（>30bp）可能增加非特異性結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)。（1）引物要與模板鏈3’端堿基序列互補(bǔ)配對(duì)（教材P77）；（3）引物內(nèi)部、引物之間的堿基不能互補(bǔ)。(解題所得)

（否則影響與模板的結(jié)合效率）【歸納總結(jié)2】

目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)考向2引物的選擇和設(shè)計(jì)：（3）電泳結(jié)果顯示，加入CD46基因擴(kuò)增產(chǎn)物的泳道出現(xiàn)了非特異性條帶，為了減少非特異性條帶的產(chǎn)生，以下措施有效的是_____。D引物與復(fù)性溫度高低的關(guān)系：1.引物中G+C含量較高，復(fù)性時(shí)溫度就較高。2.如果復(fù)性溫度太低，引物會(huì)與非目的基因片段結(jié)合，從而導(dǎo)致非特異性DNA片段的擴(kuò)增。A.增加模板DNA的量B.延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間C.延長(zhǎng)延伸的時(shí)間D.提高復(fù)性的溫度目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)考向2引物的選擇和設(shè)計(jì)：1設(shè)計(jì)增加酶切位點(diǎn)目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)考向3PCR的典型應(yīng)用：【小情境3】

研究人員介紹，獲得的CD46基因，需將其正確插入到質(zhì)粒中才能構(gòu)建表達(dá)載體。但之前設(shè)計(jì)的引物B和引物C都失敗了。于是他們對(duì)引物進(jìn)行了改造。

學(xué)生活動(dòng)三：完成學(xué)歷案上的例3及【規(guī)律總結(jié)1】。例3．CD46基因的序列和擬插入的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖如下。請(qǐng)寫出改造后的引物B’和C’的堿基序列，使CD46基因順利插入該質(zhì)粒當(dāng)中。

（轉(zhuǎn)錄方向）CD46基因:5’CATGTCCA----------------------------------CCACAACC3’3’GTACAGGT----------------------------------GGTGTTGG5’限制酶EcoRⅠBamHⅠ識(shí)別序列5’-G↓AATTC-3’5’-G↓GATCC-3’(引物B：5’CATGTCCA3’;

引物C：5’GGTTGTGG3’)

引物B’：

；

引物C’：

。

目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)考向3PCR的典型應(yīng)用：引物B’：

；

引物C’：

。

考向3PCR的典型應(yīng)用：CD46:5’CATGTCCA--------------------------------------------------CCACAACC3’3’GTACAGGT--------------------------------------------------GGTGTTGG5’B’C’CATGTCCA3’3’GGTGTTGG(轉(zhuǎn)錄方向)EcoRⅠBamHⅠ5’—GGATCCCATGTCCA—3’5’—GAATTCGGTTGTGG—3’5’5’引物C引物B1設(shè)計(jì)增加酶切位點(diǎn)目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)【規(guī)律總結(jié)1】添加酶切位點(diǎn)的引物序列（5’-3’）=（5’-3’）限制酶切序列+該DNA互補(bǔ)鏈序列考向3PCR的典型應(yīng)用：1設(shè)計(jì)增加酶切位點(diǎn)目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)考向3PCR的典型應(yīng)用：2構(gòu)建融合基因目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)【小情境4】

研究人員介紹，在研究過(guò)程中他們發(fā)現(xiàn)，單一的在豬細(xì)胞內(nèi)插入CD46基因不足以完全解決異種移植排斥，需結(jié)合其他基因（如THBD）才能實(shí)現(xiàn)更優(yōu)免疫耐受。于是科研小組在分別擴(kuò)增得到CD46基因和THBD基因片段后，采用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建了CD46—THBD融合基因。

學(xué)生活動(dòng)四：完成學(xué)歷案上的例4及【規(guī)律總結(jié)2】。例4.研究人員構(gòu)建融合基因的過(guò)程如圖所示，請(qǐng)根據(jù)所學(xué)知識(shí)分析回答下列問(wèn)題：(1)設(shè)計(jì)引物時(shí)，引物P1與引物P2的堿基序列

（填“能”或“不能”）互補(bǔ)。從引物P2和引物P3的角度分析，CD46基因的PCR過(guò)程與THBD基因的PCR過(guò)程不能在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行，原因是

。不能引物P2和引物P3之間能結(jié)合，會(huì)干擾引物和模板鏈的結(jié)合，影響PCR過(guò)程考向3PCR的典型應(yīng)用：2構(gòu)建融合基因目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)例4.研究人員構(gòu)建融合基因的過(guò)程如圖所示，請(qǐng)根據(jù)所學(xué)知識(shí)分析回答下列問(wèn)題：(2)為了得到圖中①②或③④的PCR產(chǎn)物，CD46基因與THBD基因的PCR過(guò)程至少分別需要進(jìn)行_____次循環(huán)；從①②③④中，各選一條鏈兩兩結(jié)合有_____種可能；請(qǐng)?jiān)趫D中的小方框內(nèi)標(biāo)出能擴(kuò)增出融合基因的雜交鏈的方向。（3）獲得CD46-THBD融合基因后，若要大量擴(kuò)增該序列，可選擇圖中引物

繼續(xù)進(jìn)行PCR。24引物P1和引物P4考向3PCR的典型應(yīng)用：2構(gòu)建融合基因目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)【規(guī)律總結(jié)2】1.融合基因設(shè)計(jì)引物時(shí)與一般PCR引物設(shè)計(jì)的不同點(diǎn)是：______________________________________________________________。2.PCR過(guò)程中互補(bǔ)的兩條DNA單鏈可以互為_____、_____。兩個(gè)基因的兩對(duì)引物中，需要有2種引物能堿基互補(bǔ)配對(duì)模板引物各對(duì)當(dāng)中的一種的5’端四種考向3PCR的典型應(yīng)用：2構(gòu)建融合基因目的基因的篩選和獲取—PCR技術(shù)

1.PCR技術(shù)廣泛用于對(duì)少量DNA

樣品的大量擴(kuò)增過(guò)程，尤其在法醫(yī)鑒定中有重要的意義。PCR

擴(kuò)增過(guò)程示意圖如下，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）PCR技術(shù)的原理是______________。PCR反應(yīng)中需要加入緩沖液、引物、模板DNA

、______________、_______________。

（2）圖中步驟1代表_____，步驟2代表_____，步驟3代表延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。DNA的半保留復(fù)制四種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶變性復(fù)性達(dá)標(biāo)檢測(cè)

不同

引物個(gè)數(shù)=新增單鏈達(dá)標(biāo)檢測(cè)

1.PCR技術(shù)廣泛用于對(duì)少量DNA

樣品的大量擴(kuò)增過(guò)程，尤其在法醫(yī)鑒定中有重要的意義。PCR

擴(kuò)增過(guò)程示意圖如下，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

引物與模板②③達(dá)標(biāo)檢測(cè)

1.PCR技術(shù)廣泛用于對(duì)少量DNA

樣品的大量擴(kuò)增過(guò)程，尤其在法醫(yī)鑒定中有重要的意義。PCR

擴(kuò)增過(guò)程示意圖如下，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：2.

CD46是一種I型跨膜蛋白，可保護(hù)宿主細(xì)胞免受補(bǔ)體介導(dǎo)的損傷。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在CD46基因中的特定位點(diǎn)引入特定突變，使該I型跨膜蛋白第47位地天冬酰胺（密碼子為AAU）替換為賴氨酸（密碼子為AAA），從而提高了其活性