轉(zhuǎn)水葫蘆磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的煙草特性分析摘要水葫蘆屬雨久花科鳳眼蓮屬多年生漂浮性宿根水生草本植物，在生長過程中能吸收大量氮磷等元素，在富營養(yǎng)化水體、工業(yè)廢水和生活污水的凈化方面有重要作用。磷轉(zhuǎn)運蛋白是膜整合蛋白，大多分布與細胞質(zhì)薄膜、質(zhì)體包膜和線粒體膜上。磷轉(zhuǎn)運蛋白是介導(dǎo)磷吸收和轉(zhuǎn)運的載體，在調(diào)節(jié)植物磷吸收、轉(zhuǎn)運和利用方面起到重要作用。本文將運用組織培養(yǎng)技術(shù)，在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出具有健康根系的煙草，再將培養(yǎng)出的K180-Pt、K180-121、K180煙草移植到缺磷和豐磷條件的液體培養(yǎng)基中，分別測三種煙草在缺磷和豐磷條件下0天、4天、12天根和葉的磷含量。本文通過研究轉(zhuǎn)水葫蘆磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的煙草在磷吸收方面的特性，從而探究水葫蘆磷轉(zhuǎn)運蛋白的功能。關(guān)鍵詞：水葫蘆,磷轉(zhuǎn)運蛋白,磷含量AbstractWhaterhyacinthisaperennialfloatingperennialaquaticherb.Itcanabsorbalotofelementssuchasnitrogenandphosphorusdruingthegrowthprocess.Waterhyacinthplaysanimportantroleinthepurificationofeutrophicwater,industrialwastewateranddomesticsewage.Phosphatetransportersaremembrane-integratingproteinsthataremostlydistributedoncytoplasmicmembranes,plastidenvelopes,andmitochondrialmembranes.Phosphatetransportersaremediatorsthatmediatephosphorusuptakeandtransportandplayanimportantroleinregulatingplantphosphorusuptake,transportandutilization.ThisarticlewillusetissueculturetechniquestogrowtobaccowithhealthyrootsonMSsolidmedium.TheculturedK180-Pt,K180-121,K180tobaccoistransplantedintoliquidmediumwithphosphorusandphosphorusdeficiencyconditions.Then,thephosphoruscontensofrootsandleavesofthreetobaccosintheabsenceofphophorusandphosphorusweremeasuredat0,4and12days.Inthispaper,weinvestigatedthefunctionofwaterhyacinthtransporterbystudyingthecharacteristicsofphosphorusabsorptionintobaccocarryingwaterhyacinthPhosphatetransportergene.Keyword:waterhyacinth,phosphrustransporter,phosphruscontent目錄1緒論 緒論1.1水葫蘆概況1.1.1水葫蘆生長特性水葫蘆學(xué)名鳳眼藍（Eichhorniacrassipes）。屬雨久花科鳳眼蓮屬多年生漂浮性宿根水生草本植物，根須發(fā)達，莖極短，葉在基部叢生，蓮座狀排列，葉片圓形，葉柄長短不等，內(nèi)有許多多邊形柱狀細胞組成的氣室，葉柄基部有鞘狀苞片，穗狀花絮，通常有6-12朵花，花瓣漏斗狀六裂，花瓣紫藍色。水葫蘆生長旺盛，適應(yīng)力極強，喜歡溫暖濕潤、陽光充足的環(huán)境，可在零下10℃到35℃的環(huán)境下生長。能在淺水或者水流速較慢的水體中生長。水葫蘆繁殖迅速，具有有性生殖和無性生殖兩種繁殖方式，通常以無性繁殖為主，通過匍匐莖增殖。在適宜條件下,每5天可繁殖一新植株,也能以開花結(jié)實產(chǎn)生種子而進行有性繁殖。穗狀花序由藍紫色到綠色,一支花序大約結(jié)300粒種子。種子成熟后落入水中,在水中可存活5~20年,在適宜條件下萌發(fā)生長。在適宜的條件下,植株長勢兇猛,可呈幾何數(shù)量級增長,每株分出多枝匍匐莖,莖端又可分出新植株。90d內(nèi)一株水葫蘆能繁衍約25萬棵新株[1]。原產(chǎn)巴西，上世紀初被作為觀賞植物引入中國，隨后被作為豬飼料推廣。現(xiàn)廣布于長江、黃河流域及華南各省。1.1.2水葫蘆的利用上世紀我國引入水葫蘆，并作為飼料推廣過，同時也開始了對水葫蘆處置和利用的研究。目前，比較成熟的是利用水葫蘆制備燃料、飼料、肥料、造紙，和利用水葫蘆凈化水質(zhì)等。燃料水葫蘆含有纖維素和木質(zhì)素。水葫蘆氣化、熱裂解和炭化三階段的主要產(chǎn)物都是木炭，但由于水葫蘆含水量高，導(dǎo)致最終得到的木炭熱值較低。水葫蘆中的大量纖維素可提供酵母發(fā)酵所需的糖類，。但是纖維素在水葫蘆中含量不高，因此水葫蘆水解發(fā)酵前需要進行預(yù)處理，這需要較大的能量成本，所以不具有實用性[2]。Mishima等研究發(fā)現(xiàn)，利用水葫蘆生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量和利用其他農(nóng)業(yè)廢物生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量相當(dāng)，在日后發(fā)酵工藝優(yōu)化后，水葫蘆作為原料生產(chǎn)乙醇是可行的[3]。水葫蘆可在無氧條件下經(jīng)過一系列化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生沼氣。沼氣可用于日常生活，是一種環(huán)境友好型的清潔能源。水葫蘆作為原料生產(chǎn)沼氣，不僅解決了水葫蘆的處置問題，也提供了大量的生物質(zhì)能。飼料水葫蘆最初就是被作為飼料引入我國的。水葫蘆資源豐富，不僅含有蛋白質(zhì)，還含有N、P、K、Ca、Fe等微量元素，以及賴氨酸、纈氨酸等氨基酸。表1.1水葫蘆的營養(yǎng)成分%[4]樣品水分粗蛋白粗脂肪粗纖維無氮浸出物粗灰分鮮質(zhì)量01.102.301.30干質(zhì)量019.673.2818.0337.7021.32表1.2水葫蘆的各元素含量[5]常量元素含量/%微量元素質(zhì)量比/（mg·kg-1）NP2O5K2OSCaFeCuZnNiCr3.301.283.360.401.660.7236.017057.812.3表1.3水葫蘆含有的氨基酸種類[6]必需氨基酸非必需氨基酸精氨酸異亮氨酸谷氨酸蛋氨酸亮氨酸天冬氨酸苯丙氨酸纈氨酸絲氨酸賴氨酸蘇氨酸脯氨酸色氨酸——丙氨酸水葫蘆作為原材料制作飼料有很大的價值，我國很多地區(qū)就直接將水葫蘆切碎作為飼料喂養(yǎng)雞、鴨、豬等農(nóng)畜。水葫蘆經(jīng)過干燥粉碎，或者通過微生物工程和發(fā)酵技術(shù)，可提高水葫蘆蛋白含量，值得更有營養(yǎng)，更具價值的飼料[7]。肥料水葫蘆含有大量的氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素。可直接切碎或曬干施于田中翻耕入土，作為綠肥使用。值得注意的是，未曬干的水葫蘆在田中會繼續(xù)生長，因此需將未曬干的水葫蘆切碎[8]。也可以通過微生物降解，使得水葫蘆的營養(yǎng)元素更容易被吸收。利用水葫蘆含有大量氮磷鉀營養(yǎng)成分，可以制成復(fù)合肥，或與其他肥料混合使用。國外有研究員將水葫蘆作為鉀肥與其他化學(xué)肥料混合施于小麥田中，發(fā)現(xiàn)小麥產(chǎn)量和品質(zhì)比只施加化學(xué)肥料的小麥田高。造紙水葫蘆可用于造紙的原料。此前，造紙行業(yè)已經(jīng)對玉米稈、香蕉樹等多種非木纖維造紙進行了研究。如果能利用水葫蘆代替樹木資源造紙，不僅能解決水葫蘆的處置問題，還能生產(chǎn)大量的紙張，滿足人類的使用。研究表明，利用水葫蘆生產(chǎn)的紙張著火點和酸堿度和普通紙張相近，水葫蘆纖維紙張的吸水性比普通紙張好得多，同時水葫蘆纖維紙張的含灰量更少，更適合印刷[9]。凈化水質(zhì)隨著經(jīng)濟的發(fā)展及城市化進程加快，水體富營養(yǎng)化日益嚴重。進入21世紀后，我國湖泊水體富營養(yǎng)化情況嚴峻，對全國130個湖泊的調(diào)查顯示，富營養(yǎng)化和中營養(yǎng)化已達到88.6%，太湖、巢湖、滇池富營養(yǎng)化程度非常嚴重。目前，我國已有5000km2的湖泊發(fā)生富營養(yǎng)化[10]。水體富營養(yǎng)化已成為我國嚴重的水環(huán)境問題。水葫蘆在生長過程中能吸收水體中大量的氮磷等營養(yǎng)元素，如果在湖泊中適當(dāng)放養(yǎng)水葫蘆，能達到凈化水質(zhì)的目的。上世紀90年代，有學(xué)者在湖泊里的隔離區(qū)域放羊水葫蘆，進行物理-生態(tài)工程修復(fù)水體的研究，實驗結(jié)果表明，水葫蘆能凈化水質(zhì)，吸收氮磷等營養(yǎng)元素，對水體濁度、色度有顯著的改善[11]。世界各國學(xué)者的實驗表明，水葫蘆能夠在水體凈化方面起到巨大作用，一定程度上解決水體富營養(yǎng)化的問題。除了用于凈化湖泊富營養(yǎng)化，水葫蘆還可用于凈化生活污水和工業(yè)廢水。隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，工業(yè)廢水中重金屬污染也成為世界面臨的重要環(huán)境問題之一。重金屬在水中和生物體內(nèi)不易降解，因此在生物體內(nèi)不斷富集，破化生物機體正常機能。有實驗者通過研究發(fā)現(xiàn)，水葫蘆可吸收污水中的重金屬，尤其是鉻、鋅、鉛等金屬。被吸收的重金屬主要富集于水葫蘆的根部，而非莖葉，因此被吸收的重金屬元素不會再重新被釋放到水體中。另外，紫根水葫蘆對重金屬污染的水體的凈化效果比普通水葫蘆更好[12]。修復(fù)水體動物群落2010年王智等人對滇池人工控制性種養(yǎng)的約70hm2的水葫蘆區(qū)、近水葫蘆區(qū)、遠水葫蘆區(qū)采樣分析，探討了水葫蘆種養(yǎng)工程區(qū)域內(nèi)外底棲動物群落結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明，水葫蘆對大型無脊椎底棲動物群落未產(chǎn)生不利影響，水葫蘆區(qū)生物多樣性指數(shù)顯著高于近水葫蘆區(qū)和遠水葫蘆區(qū)[13]。1.1.3水葫蘆應(yīng)用中的問題1、生態(tài)風(fēng)險水葫蘆繁殖能力極強，同時在水體中具有漂流能力。水葫蘆的生長若缺乏管理和控制，會導(dǎo)致大量水葫蘆覆蓋水面，并向下游擴散。導(dǎo)致各種生態(tài)和環(huán)境問題，例如生物多樣性銳減、河道堵塞、堵塞灌溉水道、影響漁業(yè)等[11]。水葫蘆在水體治理方面能起到巨大的作用，但是水葫蘆的利用存在巨大的風(fēng)險，若不加控制會引起水體生態(tài)失衡，對水體生態(tài)環(huán)境造成巨大的不良影響。利用水葫蘆修復(fù)水體時，首先要考慮水體生態(tài)環(huán)境的安全，要對水葫蘆的放樣水域、放養(yǎng)規(guī)模進行嚴格的控制。2、打撈收獲難度大后期生物量的打撈和處置也面臨巨大問題。人工和機械是目前水葫蘆打撈最常見的方式。人工打撈效率低，耗時長，占用大量勞動力，存在一定的安全隱患。人工打撈只適合較小規(guī)模的水葫蘆群體[14]。機械收獲相較于人工打撈，效率更高，耗時更少。但是大型的水葫蘆收獲機械成本極其昂貴，每公頃約需600-1200美元，而且處理收獲的水葫蘆也要額外的費用。資料顯示，2005-2008年間，采用機械收獲葡萄牙與西班牙邊境瓜迪亞納河流域的20萬噸水葫，總費用達14680000歐元。中國每年用于收獲水葫蘆的費用約達10億歐元[11]。3、商業(yè)化利用可行性小在過去的幾十年里，世界各國都開展了對水葫蘆的處置和利用方面的研究。但水葫蘆商業(yè)化利用面臨的巨大問題之一是難以實現(xiàn)對水葫蘆的脫水。低密度和高含水量阻礙了水葫蘆的利用[11]。1.1.4水葫蘆的危害1、生態(tài)危害水葫蘆原產(chǎn)巴西，在我國屬于外來入侵物種。在湖泊等水體環(huán)境中沒有天敵，繁殖迅速，會迅速覆蓋整個水面。同時，在流速較慢的水體中，水葫蘆具有一定的漂流能力，能夠向下游水域擴張。密集的水葫蘆植株覆蓋在水面上，降低了光線對水體的穿透，減弱了水體的氣體交換，降低水中的溶氧，嚴重影響了其他物種的生存[15]。大量的水葫蘆死亡腐爛后，會污染水體，引起水體富營養(yǎng)化。水葫蘆會造成水體生態(tài)失衡，對生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重破壞，導(dǎo)致生物多樣性喪失。2、社會危害大量的水葫蘆會造成河道堵塞，從上游飄下來的水葫蘆在上海寧波就發(fā)生過嚴重的河道堵塞狀況。有的地方水葫蘆甚至使航運癱瘓。水葫蘆會污染水體，威脅到工廠的安全生產(chǎn)[16]。打撈水葫蘆花費巨大，水葫蘆的泛濫成災(zāi)對社會造成嚴重的經(jīng)濟損失。1.1.5水葫蘆的防治1、化學(xué)防治科學(xué)家在化學(xué)防治方面取得了一定成績?？藷o蹤、草甘膦等除草劑對水葫蘆有較好的控制效果?；瘜W(xué)方法簡便快捷，效果明顯，但是除草劑無法根除水葫蘆。而且化學(xué)藥劑對水體環(huán)境破化較大。除草劑殺死的水葫蘆腐爛也會污染水體[15]。2、生物防治目前使用較多的防治方法是生物防治。生物防治就是從產(chǎn)地引入水葫蘆的天敵。水葫蘆的生物防治效果持久，成本低廉，對環(huán)境友好。為實施生物防治，許多國家在水葫蘆的原產(chǎn)地進行天敵調(diào)查，最終發(fā)現(xiàn)了許多采食水葫蘆的生物[17]。水葫蘆象甲是生物防治中最早也是最成功的控制水葫蘆的天敵。水葫蘆象甲對水葫蘆專一性寄生，故不會采食其他物種，不會造成新的環(huán)境危害[15]。3、物理防治通過人工或者機械打撈的方式處理水葫蘆，見效快。但是勞動強度大，成本巨大，無法根除水葫蘆。機械打撈主要靠打撈船結(jié)合粉碎機的方式。此前，寧波、嘉興等地采用一種“全自動水葫蘆清理裝置”。這種裝置清理效率是人工的20倍，同時比人工打撈成本低。目前該產(chǎn)品已在嘉興南湖等地試用，取得良好效果[14]。1.2磷轉(zhuǎn)運蛋白基因1.2.1磷元素磷元素是植物生長發(fā)育必需的大量元素，磷在植物體內(nèi)的含量僅次于氮和鉀。磷是植物體內(nèi)核酸、磷脂、ATP的重要組成成分，植物體內(nèi)許多重要的有機化合物都含有磷。磷對植物的生物合成有著重要作用，磷酸、五碳糖和堿基參與合成的核酸編碼植物的遺傳信息；一分子腺嘌呤、一分子核糖和三分子磷酸組成的三磷酸腺苷（ATP）是細胞內(nèi)能量傳遞的“能量通貨”，儲存和傳遞化學(xué)能，同時ATP在核酸合成中也具有重要作用；含有磷元素的磷脂是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，參與細胞膜系統(tǒng)的組成；磷脂酸是植物中重要的細胞內(nèi)信號分子，被稱為“脂質(zhì)第二信使”[18]。磷與植物主要代謝過程有密切聯(lián)系，磷促進碳水化合物的形成和運輸；磷對蛋白質(zhì)的合成與分解有重要作用；磷參與合成的ATP又參與細胞內(nèi)能量依賴的代謝過程，例如光合作用、電子傳遞、氧化作用以及底物水平磷酸化[19]。同時，磷元素能提高植物對外界環(huán)境的適應(yīng)能力。磷能增強植物細胞抗脫水和耐高溫的能力。植物可以從土壤中吸收無機鹽形式的磷酸鹽，但由于土壤具有吸附作用，磷元素會發(fā)生沉淀或者轉(zhuǎn)化為有機磷的形式，造成磷元素?zé)o法被植物有效吸收和利用。因此，土壤有效磷的供應(yīng)狀況和植物對磷素營養(yǎng)的吸收能力便成為植物生長發(fā)育的主要決定因素之一[20]。1.2.2磷轉(zhuǎn)運蛋白基因磷轉(zhuǎn)運蛋白是膜整合蛋白，大多分布與細胞質(zhì)薄膜、質(zhì)體包膜和線粒體膜上。磷轉(zhuǎn)運蛋白是介導(dǎo)磷吸收和轉(zhuǎn)運的載體，在調(diào)節(jié)植物磷吸收、轉(zhuǎn)運和利用方面起到重要作用。自1991年Bun-ya等從酵母中克隆得到高親和力的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因PHO84后，科研人員又陸續(xù)從一些植物中克隆得到高親和力的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因，利用對磷吸收缺陷酵母突變體功能互補技術(shù)，克隆得到了許多不同種屬的植物的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因[21]。目前已經(jīng)克隆得到的植物磷轉(zhuǎn)運蛋白很多，一般按兩個方面進行分類：一方面，根據(jù)吸收動力學(xué)參數(shù)Km值的不同，分為低親和力與高親和力磷轉(zhuǎn)運系統(tǒng)兩類。低親和力系統(tǒng)主要在介質(zhì)中磷濃度較高時起作用，能將細胞外高濃度的磷跨膜轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，同時也參與到植物體內(nèi)磷的運轉(zhuǎn)過程；其蛋白活性和基因表達一般不受細胞外部磷濃度的影響。高親和力系統(tǒng)可將細胞外低濃度的磷跨膜轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，被認為是根部磷吸收的主要系統(tǒng)；其蛋白活性和基因表達在低磷脅迫下增強[22]。另一方面，依據(jù)亞細胞定位和功能的不同可將磷轉(zhuǎn)運蛋白分為5個家族：Pht1、Pht2、Pht3、Pht4和pPT家族。其中，Pht1家族蛋白主要位于細胞膜，負責(zé)磷的吸收和轉(zhuǎn)運；Pht2定位于葉綠體，負責(zé)將磷轉(zhuǎn)入葉綠體；Pht3定位于線粒體，負責(zé)線粒體中磷的交換；Pht4位于高爾基體，負責(zé)將磷轉(zhuǎn)入高爾基；pPT位于質(zhì)體，負責(zé)將磷轉(zhuǎn)入質(zhì)體[22]。目前研究成果最多的是PHT1家族。植物上的第一個PHT1磷轉(zhuǎn)運蛋白基因是從擬南芥上克隆得到的，之后，其他植物的PHT1磷轉(zhuǎn)運蛋白基因相繼被克隆，包括豆科、禾本科等。絕大多數(shù)織物被克隆出來的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)儆赑HT1家族，而PHT1家族的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因大多數(shù)都屬于高親和力的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因，利用細胞質(zhì)膜上的親離子濃度來驅(qū)動對磷元素的吸收。主要在葉綠體膜上表達的低親和力的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因也已經(jīng)被克隆出來，分別是擬南芥葉綠體的ARAth,PHT2[23、24]；苜蓿葉綠體的MtPHT2[25]；PHT2[26]；和菠菜的PHTc[27]。第一個被發(fā)現(xiàn)的PHT2家族的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因是擬南芥葉子中優(yōu)先表達的編碼低親和力磷轉(zhuǎn)運蛋白基因PHT2。Versaw等在在對擬南芥的PHT2突變體的研究中發(fā)現(xiàn)，PHT2這類低親和力的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因不僅參與了植物對磷元素的吸收和轉(zhuǎn)運，而且與莖部磷的裝載有關(guān)[25]。在擬南芥、水稻、大豆、玉米和Lotusjaponicas的線粒體中還存在另外一類可能只有六個跨膜區(qū)的膜磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因Pht3家族，這一家族的基因無論在堿基序列還是結(jié)構(gòu)特征上，在線粒體內(nèi)所有轉(zhuǎn)運蛋白的基因家族中都具有極高度的保守性[28]。在基因組水平上，植物磷轉(zhuǎn)運蛋白基因家族的成員較少，磷轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)儆谛』蚣易?，植物種屬的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)通常含有525-550個氨基酸殘基，與酵母和共生菌根的磷轉(zhuǎn)運蛋白相比，在氨基酸序列上具有較高的同源性，且在結(jié)構(gòu)上也具有顯著的相似性[29]。磷轉(zhuǎn)運蛋白含有12個跨膜區(qū)域，兩側(cè)各6個跨膜區(qū)域被一個長約60個氨基酸殘基的帶電荷疏水區(qū)分隔。研究發(fā)現(xiàn)，磷轉(zhuǎn)運蛋白N-端肽鏈的6個保守基序與C-端的6個保守基序高度同源，表明磷轉(zhuǎn)運蛋白的12個跨膜域是由起初6個跨膜區(qū)域蛋白的初始結(jié)構(gòu)單位經(jīng)復(fù)制形成的。高親和力磷轉(zhuǎn)運蛋白PHT1家族的表達位于根部表皮細胞和根毛細胞的細胞膜上，這些蛋白從土壤中吸收磷酸鹽。PHT1也不僅在根部表達，如在水稻中，部分成員在其它組織中表達，OsPHT1;2在植物的葉片中表達；小麥和大豆的PHT1家族主要在根系和葉片中表達；除了PHT1;2、PHT1;7，玉米的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因均在根中表達[19]。PHT基因參與磷元素的吸收和轉(zhuǎn)運。PHT基因?qū)儆诠δ芑?，它的表達定位與其功能有一定的聯(lián)系，大部分的PHT基因在根部細胞膜表達，說明其與磷的攝取有關(guān)，而在其他部位的表達也可能和磷的轉(zhuǎn)移相關(guān)。PHT基因?qū)χ参锏目剐杂杏绊憽：芏嗫共』虻谋磉_會影響植株的正常生長，所以正常情況下，PHT1基因的表達會抑制一些抗病基因的表達，以維持植物正常生長發(fā)育。但植物受到危害時，植物會下調(diào)PHT基因的表達已解除對抗性基因的限制[19]。1.3轉(zhuǎn)基因煙草1.3.1煙草概況煙草屬管狀花科目，茄科，一年生或有限多年生草本植物。原產(chǎn)南美洲，我國各省均有栽培?？勺鳛闊煵莨I(yè)的原材料；全株可做殺蟲劑；也可藥用，作麻醉、鎮(zhèn)靜、催吐劑。煙草除了用于煙草工業(yè)外，它的根、莖、芽、頂?shù)仍谒幱?、食用方面均有重要作用。煙葉占煙草生物產(chǎn)量的一半，主要作為煙草工業(yè)的原材料，同時，煙葉中還含有數(shù)量可觀的蛋白質(zhì)；鹽莖含有大量纖維素，纖維質(zhì)量好，易于提取和加工，可用于造紙工業(yè)；煙籽的主要成分為油脂，煙籽成熟后一般不含煙堿，可直接用作畜牧飼料；煙草廢次物中可提取出煙堿、色素等化學(xué)成分，用一系列化學(xué)方法進行提純精制，具有很高的經(jīng)濟價值。1.3.2模式植物模式植物是指那些生長周期短，基因組小并且已經(jīng)測序完成的植物。常見的有擬南芥，水稻，煙草等。煙草是最有價值的生物科研材料之一，許多植物學(xué)知識都是以煙草作為實驗材料研究出的，如光周期、光呼吸、光合作用等。煙草和擬南芥一樣，是分子生物學(xué)和基因工程研究的模式植物。近年來隨著研究的深入，又發(fā)現(xiàn)很多可作為模式植物的物種，如構(gòu)樹。構(gòu)樹是桑科構(gòu)屬多年生喬木。構(gòu)樹分布廣，材料易獲得，繁殖力強，種植方便，多年生，時代周期短，種子數(shù)量多，染色體少，基因組緊湊，遺傳背景簡單，表型性狀豐富構(gòu)樹抗逆性強適應(yīng)性廣，是逆境適應(yīng)機制研究的理想材料[30]。1.3.3轉(zhuǎn)基因煙草的應(yīng)用煙草是典型的基因工程模式植物，在醫(yī)藥基因工程方面的研究和利用中起到重要作用。轉(zhuǎn)基因煙草更是取得了其他植物無法比擬的巨大成就，已經(jīng)成功的作為生物反應(yīng)器應(yīng)用于多種藥用蛋白、抗體、以及疫苗的生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因煙草已經(jīng)成功應(yīng)用于生產(chǎn)多種醫(yī)藥蛋白質(zhì)，如干擾素，人生長激素、葡萄腦苷脂酶等。其中葡萄腦苷脂酶用于治療人類Guacher氏病，價格非常昂貴?，F(xiàn)利用轉(zhuǎn)基因煙草可大量且低成本的生產(chǎn)葡萄腦苷脂酶。轉(zhuǎn)基因煙草也成功地用于生產(chǎn)預(yù)防人類和動物疾病的疫苗。美國科學(xué)家曾獲得表達乙型肝炎表面抗原的轉(zhuǎn)基因煙草，并證明這種抗原與從人血清和酵母中誘導(dǎo)獲得的抗原幾乎相同，可以作為乙肝疫苗使用。1.3.4轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本技術(shù)路線：提取目的基因，目的基因與載體結(jié)合，將目的基因?qū)胧荏w細胞，目的基因的檢測和表達。提取目的基因在自然界的長期進化過程中，生物積累了大量對人類有用的基因，這些基因被成為目的基因，目的基因通常是不編碼蛋白質(zhì)的基因。目的基因的分離制備方法如下：直接分離法構(gòu)建基因組文庫分離法利用PCR聚合酶鏈式反應(yīng)擴增目的基因基因的化學(xué)合成構(gòu)建基因組文庫的基本步驟：制備基因組DNA并片段化：利用一定的方法提取制備生物材料的基因組DNA，并對基因組DNA進行隨機切割，以獲得一定大小的含目的基因的DNA片段DNA片段與載體重組連接：在連接之前應(yīng)用限制酶切割載體以便于載體與外源DNA片段的連接重組DNA導(dǎo)入受體菌細胞并擴增篩選鑒定基因組文庫目的基因與載體結(jié)合克隆載體實際上是一種具有特定功能的DNA分子，它們能攜帶外源DNA片段或基因進入受體細胞，并使其在受體細胞中得以維持或表達。作為克隆載體的條件：在宿主細胞內(nèi)能獨立復(fù)制有選擇性標記基因具有一段多克隆位點，外源DNA插入其中不影響載體復(fù)制分子量小，拷貝數(shù)多易從宿主細胞中分離純化將目的基因?qū)胧荏w細胞受體細胞又稱宿主細胞，從實驗技術(shù)上講是指能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞；從實驗?zāi)康纳现v是指具有應(yīng)用價值和理論研究價值的細胞。受體細胞應(yīng)符合以下基本原則：便于重組DNA分子的導(dǎo)入能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中便于重組體穩(wěn)定遺傳穩(wěn)定性高，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生產(chǎn)安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染重組基因?qū)刖壓问荏w細胞的主要途徑：轉(zhuǎn)化：感受態(tài)大腸桿菌通過重組質(zhì)粒DNA分子將外源基因帶入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持與表達轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過λ噬菌體顆粒感染宿主細胞將外源DNA分子導(dǎo)入到受體細胞內(nèi)并穩(wěn)定遺傳的過程轉(zhuǎn)染：將重組λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細胞的過程電激穿孔重組基因?qū)胫参锸荏w細胞的主要途徑：土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移化學(xué)誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化：多聚物介導(dǎo)法、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移物理方法介導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化：基因槍轉(zhuǎn)化、超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、激光微束穿孔轉(zhuǎn)化、顯微注射花粉管通道法重組基因?qū)雱游锸荏w細胞的主要途徑：轉(zhuǎn)染法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染、EDTA-葡聚糖轉(zhuǎn)染、聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化動物病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)法胚胎干細胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因生殖細胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因重組子篩選：遺傳表型直接篩選：利用載體選擇標記篩選轉(zhuǎn)化子、利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞依賴與重組子結(jié)構(gòu)特征分析篩選核酸分子雜交分析：分子探針、核酸探針雜交分析目的基因的檢測和表達外源目的基因表達產(chǎn)物的檢測：外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測報告基因的酶法檢測免疫學(xué)檢測基因表達產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測1、4實驗?zāi)康谋疚难芯繉⑺J磷轉(zhuǎn)運蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草中，分析轉(zhuǎn)基因煙草在磷吸收方面的特性的改變，為水葫蘆磷轉(zhuǎn)運蛋白功能的研究奠定基礎(chǔ)。2實驗部分2.1實驗試劑表2.1實驗試劑表試劑名純度生產(chǎn)廠家硝酸鉀KNO3分析純天津致遠化學(xué)試劑有限公司硝酸銨KH4NO3分析純天津致遠化學(xué)試劑有限公司磷酸二氫鉀KH2PO4分析純廣州化學(xué)試劑廠硫酸鎂MgSO4·7H2O分析純廣州化學(xué)試劑廠氯化鈣CaCl2分析純廣州化學(xué)試劑廠碘化鉀KI分析純廣州化學(xué)試劑廠硼酸H3BO3分析純廣州化學(xué)試劑廠硫酸錳MnSO4·H2O分析純廣州化學(xué)試劑廠硫酸鋅ZnSO4·7H2O分析純廣州化學(xué)試劑廠鉬酸鈉Na2MoO4·2H2O分析純廣州化學(xué)試劑廠硫酸銅CuSO4·5H2O分析純天津致遠化學(xué)試劑有限公司氯化鈷CoCl2·6H2O分析純天津致遠化學(xué)試劑有限公司乙二胺四乙酸二鈉分析純天津市百世化工有限公司硫酸亞鐵FeSO4·7H2O分析純天津市大茂化學(xué)試劑廠肌醇分析純海埃博商貿(mào)有限公司甘氨酸（500g）分析純北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司鹽酸硫胺素VB1分析純中國新興化工試劑研究所·上海鹽酸吡哆醇VB6分析純中國新興化工試劑研究所·上海煙酸VB5分析純中國新興化工試劑研究所·上海蔗糖分析純天津市大茂化學(xué)試劑廠技術(shù)瓊脂粉（500g）分析純廣東環(huán)凱微生物科技有限公司冰醋酸CH3COOH（500ml）分析純天津市富宇精細化工有限公司三羥甲基氨基甲烷Tris（500g）分析純北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司四乙酸乙二胺EDTA（250g）分析純國藥集團化學(xué)試劑有限公司續(xù)表2.1實驗試劑表試劑名純度生產(chǎn)廠家氯化鈉NaCl（500g）分析純國藥集團化學(xué)試劑有限公司β-巰基乙醇（25ml）優(yōu)級純上海麥克林生化科技有限公司苯丙磺酰氯（5g）化學(xué)純上海麥克林生化科技有限公司鉬酸銨（NH4）2MoO4（100g）分析純上海麥克林生化科技有限公司硫酸H2SO4（500ml）分析純廣州化學(xué)試劑廠抗壞血酸C6H8O4（25g）分析純天津市致遠化學(xué)試劑有限公司氫氧化鈉NaOH（500g）分析純天津致遠化學(xué)試劑有限公司鹽酸（500ml）分析純廣州化學(xué)試劑廠2.2實驗器材2.2.1實驗主要儀器表2.2實驗主要儀器表儀器名稱規(guī)格儀器名稱規(guī)格燒杯100ml試劑瓶100ml燒杯500ml試劑瓶500ml燒杯1L移液槍10μl培養(yǎng)瓶——移液槍100μl量筒25ml移液槍1000μl量筒100ml膠頭滴管——量筒500ml離心管50ml容量瓶500ml玻璃棒——刻度管25ml2.2.2輔助工具藥匙、鑷子、剪刀、試管架、研缽2.2.3實驗設(shè)備表2.3實驗設(shè)備表設(shè)備名稱型號生產(chǎn)廠家冰箱BCD-206TAS青島海爾股份有限公司精密電子天平AUY220島津集團（香港）暨成都島津儀器設(shè)備有限公司立式壓力蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-70A上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠續(xù)表2.3實驗設(shè)備表設(shè)備名稱型號生產(chǎn)廠家潔凈工作臺SW-CJ-2FD蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司電熱鼓風(fēng)干燥箱DHG-9140上海一恒科學(xué)儀器有限公司臺式高速冷凍離心機H1850R湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司電熱恒溫水浴鍋HHS上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠雙光束紫外可見分光光度計TU-1901北京普析通用儀器有限責(zé)任公司架盤藥物天平JYT-5上海光正醫(yī)療儀器有限公司2.3實驗內(nèi)容2.3.1配置固體培養(yǎng)基按照MS固體培養(yǎng)基的配方[31]，量取75mlMS大量元素母液、7.5mlMS有機成分母液、7.5mlMS微量元素母液、7.5ml鐵鹽母液于1L的大燒杯中，再稱取22.5g蔗糖倒入燒杯中，再向燒杯中加652.5ml去離子水。攪拌，使各種試劑溶解均勻。再用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液PH至5.6-5.8。再將配置好的溶液分裝至30只培養(yǎng)瓶中。再向每一只培養(yǎng)瓶中加入0.2g瓊脂粉。MS固體培養(yǎng)基的配方如下表：表2.4MS固體培養(yǎng)基配方表/L成分含量MS大量元素10×100mlMS微量元素100×10mlMS有機成分100×10ml鐵鹽100×10ml蔗糖30g瓊脂8g表2.5MS培養(yǎng)基具體成分表配方成分分子量使用濃度mg/L母液g/L大量元素硝酸鉀KNO3101.111900×1019硝酸銨NH4NO380.04165016.5磷酸二氫鉀KH2PO4136.091701.7硫酸鎂MgSO4·7H2O246.473703.7氯化鈣CaCl2111332.243.32微量元素碘化鉀KI166.010.83×1000.083硼酸H3BO361.836.20.62硫酸錳MnSO4·H2O16916.91.69硫酸鋅ZnSO4·7H2O287.548.60.86鉬酸鈉Na2MoO4·2H2O241.950.250.025硫酸銅CuSO4·5H2O249.680.0250.0025氯化鈷CoCl2·6H2O237.930.0250.0025鐵鹽乙二胺四乙酸二鈉372.2537.3×1003.73硫酸亞鐵FeSO4·7H2O278.0327.82.78有機成分肌醇——100×10010甘氨酸——20.2鹽酸硫胺素VB1——0.10.01鹽酸吡哆醇VB6——0.50.05煙酸VB5或VPP——0.50.05其他蔗糖342.3130000——瓊脂——7000將30只培養(yǎng)瓶用高溫蒸汽滅菌鍋滅菌15分鐘后，分成3組，每組10瓶并貼標簽。第一組為轉(zhuǎn)磷轉(zhuǎn)運蛋白基因即K180-Pt，第二組為轉(zhuǎn)空載體即K180-121，第三組為野生型即K180。滅菌完成后，將培養(yǎng)瓶和預(yù)先準備的抗生素、移液槍、槍頭放入超凈工作臺中，打開紫外燈照射10分鐘，再通風(fēng)三分鐘。在培養(yǎng)基未冷卻，大約在50-60度時，向K180-Pt和K180-121的培養(yǎng)基中加入抗生素，每瓶加入25μlKan和50μlTim。將所有培養(yǎng)瓶放在試驗臺冷卻。2.3.2固體培養(yǎng)生根打開超凈工作臺，將預(yù)先配置的培養(yǎng)基和已滅菌的剪刀、鑷子放入超凈臺，打開紫外光照射10分鐘后關(guān)閉，再通風(fēng)3分鐘后關(guān)閉紫外燈，打開照明燈。從培養(yǎng)室取出轉(zhuǎn)磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的煙草K180-Pt十瓶、轉(zhuǎn)空載體的煙草K180-121十瓶、野生型的煙草K180十瓶。用酒精將取來的煙草的培養(yǎng)瓶滅菌后放入超凈臺。用剪刀從K180-pt的煙草、K180-121的煙草、K180的煙草各剪下一片嫩芽，分別插入對應(yīng)的K180-Pt、K180-121、K180的培養(yǎng)瓶中。再將三十瓶培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室培養(yǎng)生根。2.3.3觀察生長情況將植物放入培養(yǎng)室后，需要擱3天觀察植物生長情況。圖2.1嫩芽在培養(yǎng)室中繼代培養(yǎng)在一周后，剪下的嫩芽形成愈傷組織，二十天時，愈傷組織已形成根和葉。觀察三種煙草的生根情況，煙草K180-Pt有2瓶生根，生根率為20%;煙草K180-121有4瓶生根，生根率為40%；煙草K180有5瓶生根，生根率為50%。共有11瓶煙草生根，總生根率為36.67%。通過比較，此次生根率較低，為了實驗順利開展，進行第二批繼代，培養(yǎng)煙草K180-Pt、煙草K180-121、煙草K180各十瓶。過程與第一批培養(yǎng)相同。觀察第二批培養(yǎng)情況，煙草K180-Pt有2瓶生根，生根率為20%；煙草K180-121有3瓶生根，生根率為30%；煙草K180有4瓶生根，生根率為40%。共有9瓶煙草生根，生根率為30%圖2.2愈傷組織形成根和葉經(jīng)過兩次繼代，煙草K180-Pt共有3瓶生根，生根率為15%；煙草K180-121共有6瓶生根，生根率為30%；煙草K180共有7瓶生根，生根率為35%。共有16瓶煙草生根，生根率為26.67%。表2.6第一批繼代生根情況煙草類型生根數(shù)（瓶）生根率煙草K180-Pt220%煙草K180-121440%煙草K180550%總計1136.67%表2.7第二批繼代生根情況煙草類型生根數(shù)（瓶）生根率煙草K180-Pt220%煙草K180-121330%煙草K180440%總計930%表2.8總繼代生根情況煙草類型生根數(shù)（瓶）生根率煙草K180-Pt420%煙草K180-121735%煙草K180945%總計2033.33%2.3.4配置MS液體培養(yǎng)基因需探究轉(zhuǎn)基因煙草在不同磷濃度條件下對磷元素的吸收情況，所以需要配置不同的磷濃度的液體培養(yǎng)基，即缺磷和豐磷的液體培養(yǎng)基。缺磷條件為磷濃度是0.1mM/L。豐磷條件為磷濃度是2mM/L。缺磷和豐磷條件的創(chuàng)造方法是，將MS大量元素中的磷酸二氫鉀去除，再根據(jù)缺磷和豐磷所需要的磷濃度補充磷酸二氫鉀，所需要的鉀元素再用氯化鉀補充。在MS大量元素成分中，磷酸二氫鉀的濃度是170mg/L，即1.249mM/L。豐磷的液體培養(yǎng)基所需要的磷濃度為2mM/L，所以配制每升豐磷的液體培養(yǎng)基需要再加入2mM的磷酸二氫鉀，此時，補充的鉀離子濃度為2mM/L。缺磷的液體培養(yǎng)基所需要的磷濃度為0.1mM/L的，所以配置每升缺磷的液體培養(yǎng)基需要再加入0.1mM。的磷酸二氫鉀，同時，為了保持鉀離子濃度相同，需要再補充1.9mM的氯化鉀。預(yù)先配制不含磷酸二氫鉀的MS大量元素母液，即按照MS大量元素成分配制時，去除磷酸二氫鉀。再配制0.1mol/L的磷酸二氫鉀和氯化鉀，用于調(diào)節(jié)磷元素和鉀元素濃度。1、缺磷的MS液體培養(yǎng)基按照配方配制液體培養(yǎng)基，量取25ml不含磷酸二氫鉀的MS大量元素母液、2.5mlMS有機成分母液、2.5mlMS微量元素母液、2.5ml鐵鹽母液于500ml的燒杯中，稱取7.5g蔗糖倒入燒杯中，加入0.25ml的0.1mol/L的磷酸二氫鉀和4.75ml的0.1mol/L的氯化鉀，向燒杯中加212.5ml去離子水。攪拌，使各種試劑溶解均勻。再用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液PH至5.6-5.8。再將配置好的溶液分裝至10只培養(yǎng)瓶中，再貼上標簽。兩瓶貼上標簽K180-Pt缺磷，三瓶貼上標簽K180-121缺磷，五瓶貼上標簽K180缺磷。表2.9缺磷的MS液體培養(yǎng)基配方表/L成分含量不含KH2PO4的MS大量元素10×100mlMS微量元素100×10mlMS有機成分100×10ml鐵鹽100×10ml0.1mol/LKH2PO41ml0.1mol/LKCl19ml蔗糖30g2、豐磷的MS液體培養(yǎng)基按照配方配制液體培養(yǎng)基，量取25ml不含磷酸二氫鉀的MS大量元素母液、2.5mlMS有機成分母液、2.5mlMS微量元素母液、2.5ml鐵鹽母液于500ml的燒杯中，再稱取7.5g蔗糖倒入燒杯中，加入5ml的0.1mol/L的磷酸二氫鉀，再向燒杯中加212.5ml去離子水。攪拌，使各種試劑溶解均勻。再用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液PH至5.6-5.8。再將配置好的溶液分裝至10只培養(yǎng)瓶中，再貼上標簽。兩瓶貼上標簽K180-Pt豐磷，四瓶貼上標簽K180-121豐磷，四瓶貼上標簽K180豐磷。表2.10豐磷的MS液體培養(yǎng)基配方表/L成分含量MS大量元素10×100mlMS微量元素100×10mlMS有機成分100×10ml鐵鹽100×10ml0.1mol/LKH2PO420ml蔗糖30g再用20只培養(yǎng)瓶分別裝50ml去離子水。將所有四十只培養(yǎng)瓶用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌十五分鐘。滅菌結(jié)束后，將培養(yǎng)瓶放在試驗臺上冷卻。2.3.5配置ExtractionBuffer、檢測液和冰醋酸實驗中每次測根和葉磷含量時，都需要預(yù)先配制100mlExtractionBuffer、500ml檢測液和500ml1%的冰醋酸。。1、配制100mlExtractionBuffer稱取0.1211gTris、0.0292gEDTA、0.5844gNaCl、0.0174g苯甲基磺酰氯，放入100ml燒杯中，用移液槍吸取7μl的β-巰基乙醇加入燒杯中。再向燒杯中加入100ml去離子水，攪拌溶解。因苯甲基磺酰氯難溶，將溶液置于磁力攪拌器加熱并攪拌，直至多種試劑全部溶解。將配好的溶液裝入100ml的棕色試劑瓶。表2.11ExtractionBuffer成分表/L成分含量Tris10mMEDTA1mMNaCl100mMβ-巰基乙醇1mM苯甲基磺酰氯1mM2、配制500ml檢測液稱取1.75g鉬酸銨、7g抗壞血酸，放入500ml燒杯中。向燒杯中加入488.5ml去離子水，攪拌使試劑溶劑。再量取11.5ml硫酸，沿?zé)趽Q換加入燒杯中，并不斷攪拌。將配制好的溶液裝入500ml棕色試劑瓶。表2.12檢測液成分表成分含量鉬酸銨0.35%硫酸0.86N抗壞血酸1.4%3、配制500ml1%的冰醋酸欲配制1%的冰醋酸，需用1g冰醋酸混合99g去離子水。故配制500ml的1%冰醋酸，先量取495ml去離子水于500ml燒杯中，再量取4.77ml冰醋酸，與燒杯中去離子水充分混勻。將配制好的溶液裝入500ml棕色試劑瓶。2.3.6移植到液體培養(yǎng)基打開超凈工作臺，將已經(jīng)冷卻的培養(yǎng)基、和去離子水以及鑷子放在超凈工作臺面，打開紫外燈照射十分鐘，再通風(fēng)三分鐘后關(guān)閉紫外燈，打開照明燈。將所有裝有生根的煙草培養(yǎng)瓶用酒精消毒過后，拿入超凈工作臺。用鑷子將在固體培養(yǎng)基里培養(yǎng)的煙草拔出，謹慎操作，保證根系完整不被破壞。用鑷子輕輕剔除掉粘在根系上的固體培養(yǎng)基，清理掉大部分固體培養(yǎng)基后，再放入去離子水中涮洗，洗去粘留在根系上殘存的固體培養(yǎng)基，盡量使煙草根系上少殘留固體培養(yǎng)基，以免影響根系對液體培養(yǎng)基的吸收。洗凈后，再將各種煙草移植到標簽對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。四株K180-Pt的煙草，其中兩株移植到K180-Pt缺磷的液體培養(yǎng)基，兩株移植到K180-Pt豐磷的液體培養(yǎng)基；七株K180-121的煙草，其中三株移植到K180-121缺磷的液體培養(yǎng)基，四株移植到K180-121豐磷的液體培養(yǎng)基；九株K180的煙草，其中五銖移植到K180缺磷的液體培養(yǎng)基，四株移植到K180豐磷的液體培養(yǎng)基。2.3.7測液體培養(yǎng)0天時根葉磷含量在將煙草從固體培養(yǎng)基移植到液體培養(yǎng)基后，先不將植株放進培養(yǎng)室培養(yǎng)，而是先測液體培養(yǎng)第零天時，K180-Pt、K180-121、K180三種煙草根和葉部位的磷含量。注意根和葉的取材時，從相同類型的多株植物上各取一部分，后混合均勻，測其混合物的磷含量。1、打開超凈工作臺，將已滅菌的剪刀、鑷子、玻璃平板放入工作臺面。打開紫外燈照射十五分鐘，再通風(fēng)三分鐘后關(guān)閉紫外燈，打開照明燈。用酒精把裝有煙草的培養(yǎng)瓶消毒后，將培養(yǎng)瓶拿入超凈臺。2、用鑷子將煙草從液體培養(yǎng)基中夾出，用剪刀從煙草植株上剪下一些根和一小塊葉，放在玻璃平板上，并在玻璃平板上寫上標簽。從植株上剪下根和葉時注意盡量不影響植株正常生長。再拿剪掉的根和葉去稱重，稱取K180-Pt缺磷、K180-Pt豐磷、K180-121缺磷、K180-豐磷、K180缺磷、K180豐磷的根和葉各0.1g。3、將0.1g的K180-Pt缺磷、K180-Pt豐磷、K180-121缺磷、K180-豐磷、K180缺磷、K180豐磷的根和葉分別放入研缽，加入液氮研磨。磨成粉末后，將樣品分別放入50ml離心管中。并分別貼上標簽。分別為：K180-Pt缺磷根、K180-Pt缺磷葉、K180-Pt豐磷根、K180-Pt豐磷葉、K180-121缺磷根、K180-121缺磷葉、K180-121豐磷根、K180-121豐磷葉、K180缺磷根、K180缺磷葉、K180豐磷根、K180豐磷葉。4、向每只離心管中加入到2ml的ExtractionBuffer。用移液槍吸取2ml的ExtractionBuffer，加入到離心管中。5、向每只離心管中加入18ml的1%冰醋酸。用移液槍吸取18ml的冰醋酸，加入到離心管中，再振蕩混勻。6、將所有離心管放入大燒杯中，向大燒杯中加水，使燒杯中液面高于離心管中的液面。再將裝有離心管的燒杯放入電熱恒溫水浴鍋。調(diào)節(jié)水浴溫度為42攝氏度，水浴30分鐘。水浴結(jié)束后，將離心管取出，擦干凈離心管表面水。7、將對應(yīng)兩只離心管用架盤天平，用去離子水配平。配平后將對應(yīng)的離心管放在臺式高速冷凍離心機，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速8000轉(zhuǎn)，室溫下離心10分鐘。8、離心結(jié)束后，從離心機取出離心管，再用移液槍從離心結(jié)束后的離心管中吸取6ml的樣品到25ml刻度試管中。再用移液槍向刻度試管中加入14ml檢測液。再將刻度試管貼上標簽，和離心管對應(yīng)，分別為K180-Pt根、K180-Pt葉、K180-121根、K180-121葉、K180根、K180葉。9、將所有刻度試管放在大燒杯，燒杯里加入水，使燒杯中液面高于刻度試管中的液面。再將大燒杯放入電熱恒溫水浴鍋，調(diào)節(jié)水浴溫度為42攝氏度，水浴30分鐘。水浴結(jié)束后，將刻度試管取出，放在試管架上。10、用紫外分光光度計測量每管待測刻度試管液體的吸光值。打開電腦，打開紫外分光光度計預(yù)熱三十分鐘。先用去離子水潤洗比色皿，再用參比溶液潤洗比色皿，再將參比溶液倒入比色皿，將比色皿放入紫外分光光度計，校零。再用去離子水清洗比色皿，用待測溶液潤洗比色皿，將待測溶液倒入比色皿，將比色皿放入紫外分光光度計測量其OD=700時的吸光值，每組數(shù)據(jù)測量三次，取其平均值。重復(fù)此步驟，測量完所有待測溶液的吸光值。表2.12零天煙草根葉吸光值樣品K180-Pt根K180-Pt葉K180-121根K180-121葉K180根K180葉A0.0160.0150.0350.0420.0150.036B0.0160.0160.0360.0410.0170.036C0.0170.0160.0370.0430.0180.038平均0.01630.01570.03600.04200.01670.0367圖2.3第零天煙草生長情況零天時，煙草植株較小，根系完整。葉片較小，不能充滿整個培養(yǎng)瓶，植株高約五厘米，葉片翠綠。測完吸光值后，將煙草植株放入培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)。2.3.8測液體培養(yǎng)四天時的根葉磷含量將煙草培養(yǎng)四天后，再次測K180-Pt、K180-121、K180三種煙草在缺磷和豐磷條件下根和葉的吸光值。步驟與測零天吸光值相似。稱取0.1g新鮮樣品，用液氮樣品研磨成粉末狀，將樣品放到50mL的離心管中，再將離心管貼上標簽，分別為K180-Pt缺磷根、K180-Pt缺磷葉、K180-Pt豐磷根、K180-Pt豐磷葉、K180-121缺磷根、K180-121缺磷葉、K180-121豐磷根、K180-121豐磷葉、K180缺磷根、K180缺磷葉、K180豐磷根、K180豐磷葉。吸取2mL的Extractionbuffer加入到50mL的離心管，加入18mL的1%冰醋酸，振蕩混勻，將離心管放在42°C水浴鍋中，水浴30分鐘，室溫13000xg離心5分鐘，吸取6mL的樣品到25mL的刻度試管，貼上與離心管對應(yīng)的標簽，分別為K180-Pt缺磷根、K180-Pt缺磷葉、K180-Pt豐磷根、K180-Pt豐磷葉、K180-121缺磷根、K180-121缺磷葉、K180-121豐磷根、K180-121豐磷葉、K180缺磷根、K180缺磷葉、K180豐磷根、K180豐磷葉。再向刻度試管加入14mL的檢測液，將刻度試管放在42°C水浴鍋中，水浴30分鐘，在紫外分光光度計測量每管待測刻度試管的OD=700的吸光值。表2.13第四天煙草根吸光值樣品K180-Pt缺磷K180-Pt豐磷K180-121缺磷K180-121豐磷K180缺磷K180豐磷A0.0200.0160.0210.0180.0370.032B0.0220.0180.0240.0210.0370.034C0.0210.0170.0230.0200.0360.034平均0.02100.01700.02270.01970.03670.0333表2.14第四天煙草葉吸光值樣品K180-Pt缺磷K180-Pt豐磷K180-121缺磷K180-121豐磷K180缺磷K180豐磷A0.0660.0230.0480.0240.0390.035B0.0680.0240.0470.0260.0390.034C0.0680.0250.0490.0250.0400.034平均0.06730.02400.04800.02500.03900.0343圖2.4第四天煙草生長情況培養(yǎng)至第四天時，煙草植株基本充滿培養(yǎng)瓶，葉片較大，葉片翠綠，煙草植株比零天時更高，植株高約八厘米。測完吸光值后，將煙草植株放入培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)。2.3.9測液體培養(yǎng)十二天時的根葉磷含量將煙草培養(yǎng)至第十二天，再次測K180-Pt、K180-121、K180三種煙草在缺磷和豐磷條件下根和葉的吸光值。步驟與測第四天吸光值相同。表2.15第十二天煙草根吸光值樣品K180-Pt缺磷K180-Pt豐磷K180-121缺磷K180-121豐磷K180缺磷K180豐磷A0.0140.0450.0440.0630.0300.055B0.0160.0460.0470.0650.0270.050C0.0170.0460.0480.0640.0290.050平均0.01570.04570.04630.06400.02870.0517表2.16第十二天煙草葉吸光值樣品K180-Pt缺磷K180-Pt豐磷K180-121缺磷K180-121豐磷K180缺磷K180豐磷A0.0370.0590.0210.0580.0300.032B0.0360.0600.0220.0600.0300.034C0.0360.0580.0210.0580.0310.035平均0.03630.0590.02130.05670.03030.0337圖2.5第十二天煙草生長情況培養(yǎng)至第十二天時，植株充滿整個培養(yǎng)瓶。植株漸漸枯萎，部分葉片發(fā)黃，植株高約九厘米。培養(yǎng)瓶內(nèi)液體培養(yǎng)基明顯減少。2.4實驗結(jié)論根據(jù)測得的吸光值數(shù)據(jù)得：K180-Pt缺磷根的磷含量：4天＞0天，12天＜4天；K180-Pt缺磷葉的磷含量：4天＞0天，12天＜4天；K180-Pt豐磷根的磷含量：4天＞0天，12天＞4天；K180-Pt豐磷葉的磷含量：4天＞0天，12天＞4天；K180-121缺磷根的磷含量：4天＜0天，12天＞4天；K180-121缺磷葉的磷含量：4天＞0天，12天＜4天；K180-121豐磷根的磷含量：4天＜0天，12天＞4天；K180-121豐磷葉的磷含量：4天＜0天，12天＞4天；K180缺磷根的磷含量：4天＞0天，12天＜4天；K180缺磷葉的磷含量：4天＞0天。12天＜4天；K180豐磷根的磷含量：4天＞0天，12天＞4天；K180豐磷葉的磷含量：4天＜0天12天＜4天。轉(zhuǎn)磷轉(zhuǎn)運蛋白的煙草的根葉在4天和12天的磷含量比0天時高。而且轉(zhuǎn)磷轉(zhuǎn)運蛋白的煙草根葉4天、12天與0天磷含量的差值，比轉(zhuǎn)空載體的煙草和野生型煙草4天、12天與0天磷含量的差值更大，說明，磷轉(zhuǎn)運蛋白對煙草根葉吸收林的作用是正向的，轉(zhuǎn)磷轉(zhuǎn)運蛋白的煙草對磷的吸收能力更強。2.5實驗中的思考本次實驗煙草的生根率為33.33%，查閱資料知，生根率應(yīng)約為50%，本次實驗的生根率很低。仔細探究實驗過程發(fā)現(xiàn)，在配置固體和液體MS培養(yǎng)基時，調(diào)節(jié)PH為5.6-5.8后再高溫高壓滅菌。查閱資料知，高溫高壓滅菌會影響MS培養(yǎng)基的PH值，使培養(yǎng)基PH有所下降[32]。所以，在調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH時，應(yīng)適當(dāng)調(diào)高PH，控制PH值在6.2-6.4范圍內(nèi)。參考文獻[1]吳丹,望志方,馮利.水葫蘆繁殖過度的危害及其防治措施[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2001(S2):35-37.[2]陳廣銀,鄭正,鄒星星.水葫蘆能源化利用研究進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(03):5-9.[3]D.Mishima,M.Kuniki,K.Sei,S.Soda,M.Ike,M.Fujita.Ethanolproductionfromcandidateenergycrops:Waterhyacinth(Eichhorniacrassipes)andwaterlettuce(PistiastratiotesL.)[J].BioresourceTechnology,2007,99(7).[4]周文宗.水葫蘆的放養(yǎng)與利用[J].特種經(jīng)濟動植物,2003(9):31.[5]郎詠梅,劉勃,季華東,等.水葫蘆在污水處理中的應(yīng)用[J].節(jié)能與環(huán)保,2006(12):33-35.[6]余有成.水葫蘆的營養(yǎng)成分及青貯方法[J].畜產(chǎn)研究,1988(2):38-41.[7]蔣偉軍,顏幼平,李萍.水葫蘆資源化利用綜述[J].水資源保護,2010,26(06):79-83.[8]徐祖信,高月霞,王晟.水葫蘆資源化處置與綜合利用研究評述[J].長江流域資源與環(huán)境,2008(02):201-205.[9]鄧麗娟,蘇夢冰,陳曉珊,黃俊生.水葫蘆纖維造紙的研究[J].韓山師范學(xué)院學(xué)報,2012,33(06):68-72.[10]金相燦,胡小貞.湖泊流域清水產(chǎn)流機制修復(fù)方法及其修復(fù)策略[J].中國環(huán)境科學(xué),2010,30(03):374-379.[11]張志勇,嚴少華,徐寸發(fā),劉海琴,張迎穎.水葫蘆修復(fù)污染水體的功能及其在工程應(yīng)用中所面臨的挑戰(zhàn)[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報,2017,26(09):1612-1618.[12]陳文萍,徐舒陽,那中元,楊紅軍,黃柏炎,王瑩.紫根水葫蘆對重金屬水體的凈化作用[J].環(huán)境工程學(xué)報,2016,10(05):2284-2290.[13]王智,張志勇,張君倩,張迎穎,嚴少華.水葫蘆修復(fù)富營養(yǎng)化湖泊水體區(qū)域內(nèi)外底棲動物群落特征[J].中國環(huán)境科學(xué),2012,32(01):142-149.[14]陶信益.水葫蘆的防治與利用[J].浙江水利科技,2004(04):83-84