2025年大學(xué)《化學(xué)生物學(xué)》專業(yè)題庫——RNA干涉技術(shù)在疾病基因治療中的潛在應(yīng)用考試時(shí)間：______分鐘總分：______分姓名：______一、簡答題1.請簡述小干擾RNA（siRNA）在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)基因沉默的主要生物學(xué)過程。2.與脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)相比，病毒載體（如腺相關(guān)病毒）在遞送RNAi分子方面具有哪些潛在優(yōu)勢？3.簡述在利用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因治療時(shí)，可能出現(xiàn)的“脫靶效應(yīng)”及其潛在原因。4.以鐮狀細(xì)胞貧血為例，說明RNAi技術(shù)可能的作用機(jī)制。5.RNAi技術(shù)在治療神經(jīng)退行性疾病方面面臨哪些獨(dú)特的挑戰(zhàn)？二、論述題6.論述設(shè)計(jì)有效治療性siRNA分子時(shí)需要考慮的關(guān)鍵因素。7.分析影響RNAi基因治療臨床轉(zhuǎn)化的主要障礙，并提出可能的克服策略。8.假設(shè)你要設(shè)計(jì)一個(gè)針對某種病毒感染的RNAi治療策略，請闡述你的設(shè)計(jì)思路，包括靶點(diǎn)選擇、siRNA遞送方式的選擇依據(jù)以及預(yù)期效果。9.結(jié)合當(dāng)前研究進(jìn)展，探討RNAi技術(shù)與其他基因治療技術(shù)（如CRISPR/Cas9）在疾病治療中結(jié)合應(yīng)用的潛力。試卷答案一、簡答題1.答案：siRNA首先在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶識別并切割成雙鏈RNA（dsRNA）。隨后，siRNA被導(dǎo)入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。在RISC中，siRNA的導(dǎo)向鏈（guidestrand）被選擇并保留了，而反導(dǎo)向鏈（passengerstrand）被降解。攜帶導(dǎo)向鏈的RISC復(fù)合體能夠識別并結(jié)合到與之序列互補(bǔ)的靶標(biāo)mRNA上。最后，RISC中的RNaseH或Argonaute蛋白的核酸酶活性切割靶標(biāo)mRNA，導(dǎo)致靶標(biāo)mRNA降解，進(jìn)而抑制靶基因的翻譯，實(shí)現(xiàn)基因沉默。解析思路：考察對RNAi分子生物學(xué)機(jī)制的理解。需要清晰描述從siRNA的生成、RISC復(fù)合體的形成、靶標(biāo)識別到mRNA切割降解的完整流程，并提及關(guān)鍵酶（Dicer,RNaseH）和蛋白（RISC,Argonaute）的作用。2.答案：病毒載體（如腺相關(guān)病毒）在遞送RNAi分子方面的潛在優(yōu)勢包括：①組織親和性和細(xì)胞靶向性較好，可通過基因工程改造實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞或組織的靶向遞送；②通常免疫原性低于某些病毒載體（如腺病毒）；③部分病毒載體（如AAV）可長期維持表達(dá)且安全性數(shù)據(jù)較為充分，在臨床應(yīng)用中具有優(yōu)勢；④轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在某些細(xì)胞類型中可能較高且穩(wěn)定。解析思路：考察對不同遞送系統(tǒng)特點(diǎn)的比較分析能力。需要指出病毒載體相比非病毒載體（如脂質(zhì)體）在組織靶向、免疫原性和安全性數(shù)據(jù)方面的潛在優(yōu)勢。3.答案：脫靶效應(yīng)是指RNAi分子（siRNA或miRNA）錯(cuò)誤地識別并切割了與靶標(biāo)序列相似但非同源的mRNA分子，導(dǎo)致非預(yù)期的基因沉默。其潛在原因包括：①siRNA或miRNA與靶標(biāo)mRNA存在不完全互補(bǔ)但足以被RISC識別和切割的序列；②RNA二級結(jié)構(gòu)或miRNA種子序列與其他RNA分子（如轉(zhuǎn)錄本）的相互作用；③遞送系統(tǒng)將RNAi分子錯(cuò)誤地遞送到非目標(biāo)細(xì)胞或組織；④RISC復(fù)合體本身的功能異常。解析思路：考察對RNAi技術(shù)潛在風(fēng)險(xiǎn)因素的理解。需要準(zhǔn)確定義脫靶效應(yīng)，并列出導(dǎo)致脫靶的主要原因，包括序列特異性問題、RNA結(jié)構(gòu)影響、遞送層面和RISC功能層面。4.答案：鐮狀細(xì)胞貧血的致病原因是編碼β-珠蛋白鏈的基因（HBB）突變，導(dǎo)致合成的β-珠蛋白鏈異常。利用RNAi技術(shù)治療鐮狀細(xì)胞貧血的作用機(jī)制主要是：設(shè)計(jì)針對HBB基因突變轉(zhuǎn)錄本（或正常轉(zhuǎn)錄本，取決于設(shè)計(jì)策略）的siRNA分子；將siRNA遞送入紅細(xì)胞前體細(xì)胞或紅細(xì)胞中；siRNA通過RISC切割靶標(biāo)mRNA，降低β-珠蛋白鏈的合成水平；減少異常β-珠蛋白鏈的產(chǎn)生，從而減輕或阻止鐮狀細(xì)胞貧血相關(guān)的病理變化，如紅細(xì)胞鐮變和血管堵塞。解析思路：考察將RNAi技術(shù)應(yīng)用于特定遺傳疾病治療的能力。需要結(jié)合疾病病理機(jī)制，說明siRNA如何靶向致病基因的mRNA，并解釋其對疾病表型的潛在糾正作用。5.答案：RNAi技術(shù)在治療神經(jīng)退行性疾病方面面臨的主要挑戰(zhàn)包括：①血腦屏障（Blood-BrainBarrier,BBB）的有效突破和特異性遞送是巨大障礙，許多遞送系統(tǒng)難以進(jìn)入腦組織或會被優(yōu)先清除；②神經(jīng)細(xì)胞類型多樣，需要實(shí)現(xiàn)精確的細(xì)胞類型特異性靶向；③神經(jīng)系統(tǒng)中的遞送效率可能不高；④神經(jīng)細(xì)胞代謝活躍，RNAi分子可能被快速降解；⑤神經(jīng)退行性疾病的病理復(fù)雜，可能涉及多個(gè)基因或通路，單一RNAi分子的治療效果有限，可能需要多靶點(diǎn)干預(yù)；⑥長期遞送的安全性和潛在的免疫反應(yīng)需要評估。解析思路：考察對RNAi技術(shù)在特定復(fù)雜疾病領(lǐng)域應(yīng)用限制的理解。需要結(jié)合神經(jīng)系統(tǒng)的生理（BBB）和病理特點(diǎn)，分析遞送、靶向、效率、代謝、治療復(fù)雜性及安全性等方面的挑戰(zhàn)。二、論述題6.答案：設(shè)計(jì)有效治療性siRNA分子時(shí)需要考慮的關(guān)鍵因素包括：①序列特異性與親和力：siRNA序列必須與靶標(biāo)mRNA具有高度特異性（減少脫靶）和強(qiáng)親和力（確保有效切割）。通常要求靶位點(diǎn)具有完美的或接近完美的堿基配對，并遵循“種子序列”（通常前8-9個(gè)核苷酸）原則。②化學(xué)修飾：對siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾（如2'-O-甲基化、磷?；⒘虼揎椀龋┛梢蕴岣咂浞€(wěn)定性（抵抗核酸酶降解）、增強(qiáng)細(xì)胞攝取效率、降低免疫原性并可能提高靶標(biāo)識別能力。③化學(xué)計(jì)量學(xué)：siRNA的有效性可能受其濃度影響，需要確定最佳給藥濃度。通常雙鏈siRNA（siRNAduplex）比單鏈siRNA（senseorantisensestrand）更有效。④靶向非編碼RNA：對于調(diào)控蛋白表達(dá)的lncRNA或circRNA等非編碼RNA，需要選擇合適的靶點(diǎn)和評估其功能性。⑤靶向內(nèi)含子：靶向內(nèi)含子可能同時(shí)沉默多個(gè)外顯子，效果更穩(wěn)定，不易受剪接位點(diǎn)變化影響。⑥靶向基因的位置：靶向基因啟動子區(qū)域可能影響轉(zhuǎn)錄水平，而靶向編碼區(qū)主要影響翻譯水平。⑦脫靶效應(yīng)評估：設(shè)計(jì)時(shí)需預(yù)測潛在的脫靶位點(diǎn)，并考慮后續(xù)進(jìn)行脫靶效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。解析思路：考察對siRNA設(shè)計(jì)原則和優(yōu)化策略的綜合理解和應(yīng)用能力。需要全面列出影響siRNA有效性的關(guān)鍵因素，并闡述每個(gè)因素的具體含義和重要性，體現(xiàn)對分子細(xì)節(jié)和技術(shù)策略的掌握。7.答案：影響RNAi基因治療臨床轉(zhuǎn)化的主要障礙包括：①遞送系統(tǒng)效率與安全性：目前缺乏高效、安全、廉價(jià)且能實(shí)現(xiàn)特定組織或細(xì)胞類型靶向的遞送系統(tǒng)，尤其是在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)全身或特定病灶部位的有效遞送仍面臨巨大挑戰(zhàn)。②脫靶效應(yīng)：序列非特異性切割或其他原因?qū)е碌拿摪行?yīng)可能引發(fā)副作用，限制臨床應(yīng)用。③免疫原性：RNA或其載體可能被免疫系統(tǒng)識別，引發(fā)免疫反應(yīng)，影響療效或?qū)е虏涣挤磻?yīng)。④RNAi分子的穩(wěn)定性與半衰期：在體內(nèi)的降解速度快，可能需要頻繁給藥。⑤治療性RNA的規(guī)模化生產(chǎn)與成本：高質(zhì)量、大規(guī)模、低成本的siRNA生產(chǎn)是臨床應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)障礙。⑥長期療效與安全性：RNAi治療后的長期效果和潛在的遲發(fā)性副作用需要充分評估。⑦倫理法規(guī)問題：基因治療相關(guān)的倫理和監(jiān)管要求嚴(yán)格。克服策略可能包括：開發(fā)新型納米遞送載體（如脂質(zhì)納米顆粒、外泌體）、設(shè)計(jì)更嚴(yán)格的siRNA序列以降低脫靶、采用免疫佐劑策略提高遞送效率或降低免疫原性、開發(fā)化學(xué)修飾提高RNA穩(wěn)定性、優(yōu)化生產(chǎn)流程降低成本、進(jìn)行長期臨床前和臨床研究以評估安全性和有效性、完善倫理規(guī)范和審批流程。解析思路：考察對RNAi基因治療從實(shí)驗(yàn)室走向臨床所面臨的核心挑戰(zhàn)及其解決方案的宏觀分析和評價(jià)能力。需要識別主要障礙，并進(jìn)行分類闡述，并能提出具有前瞻性的克服策略。8.答案：設(shè)計(jì)針對病毒感染的RNAi治療策略：首先，靶點(diǎn)選擇：確定病毒生命周期中關(guān)鍵且保守的基因作為靶點(diǎn)。例如，可以選擇病毒復(fù)制必需的基因（如編碼衣殼蛋白、聚合酶、轉(zhuǎn)錄激活因子的基因）、病毒進(jìn)入細(xì)胞的受體相關(guān)基因或病毒逃避免疫系統(tǒng)的基因。選擇靶點(diǎn)時(shí)要進(jìn)行序列比對，確保靶點(diǎn)在目標(biāo)病毒株及不同病毒株間具有特異性，避免脫靶。其次，遞送方式選擇：根據(jù)病毒感染的部位（如血液、組織、細(xì)胞）選擇合適的遞送系統(tǒng)。若病毒在全身擴(kuò)散，可能需要考慮全身遞送系統(tǒng)（如基于AAV或脂質(zhì)體的長循環(huán)納米顆粒）。若病毒主要感染特定組織（如肝臟、腦部），則需選擇能靶向該組織的遞送載體。遞送系統(tǒng)的選擇還需考慮生物相容性、遞送效率和成本。最后，預(yù)期效果：通過有效遞送siRNA，靶向切割病毒關(guān)鍵基因的mRNA，可以抑制病毒蛋白的合成，阻斷病毒復(fù)制周期，降低病毒載量，減輕病毒感染引起的病理損傷。理想的預(yù)期效果是清除感染，恢復(fù)宿主健康。同時(shí)，需要監(jiān)測潛在的脫靶效應(yīng)和免疫反應(yīng)。解析思路：考察將RNAi技術(shù)應(yīng)用于具體疾?。ú《靖腥荆┲委煹脑O(shè)計(jì)能力。需要按照科學(xué)邏輯步驟（靶點(diǎn)選擇依據(jù)、遞送策略考量、預(yù)期治療效果）進(jìn)行闡述，體現(xiàn)問題解決能力和對技術(shù)細(xì)節(jié)的理解。9.答案：RNAi技術(shù)與其他基因治療技術(shù)結(jié)合應(yīng)用的潛力巨大。例如，RNAi與CRISPR/Cas9結(jié)合：CRISPR/Cas9技術(shù)具有強(qiáng)大的基因編輯能力，可以直接在基因組水平上敲除致病基因或進(jìn)行基因修正。結(jié)合RNAi，可以利用RNAi快速、暫時(shí)性地抑制高表達(dá)致病蛋白或病毒復(fù)制，緩解病情，為CRISPR/Cas9的修復(fù)或編輯過程爭取時(shí)間，或者用于治療那些不適合直接編輯的基因（如調(diào)控基因）。另外，也可以利用RNAi篩選CRISPR/Cas9編輯產(chǎn)生的克隆，找到功能性的編輯事件。RNAi與基因增補(bǔ)（GeneTherapyviaGeneAddition）：對于某些遺傳病是基因缺失或功能不足引起的，可以先利用基因增補(bǔ)技術(shù)（如AAV載體遞送正?；蚋北荆┗謴?fù)功能，但對于同時(shí)存在致病性基因突變或病毒感染的病例，可聯(lián)合使用RNAi技術(shù)沉默致病突變或病毒基因。RNAi與蛋白質(zhì)降解技術(shù)（如PROTAC）：針對那些RNAi難以有效抑制的“不可成藥”靶點(diǎn)（如成熟蛋白），可以先利用RNAi降