免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)辦法###一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)概述

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其與外界物質(zhì)相互作用的科學(xué)方法。通過實(shí)驗(yàn)，可以深入了解免疫應(yīng)答的機(jī)制、免疫細(xì)胞的分化和功能、免疫調(diào)節(jié)的過程等。本實(shí)驗(yàn)辦法旨在提供一個(gè)系統(tǒng)性的實(shí)驗(yàn)流程，包括實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、操作步驟、結(jié)果分析等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

####（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.**試劑**

-免疫細(xì)胞分離液（如Ficoll-Paque）

-RPMI-1640培養(yǎng)基

-胰蛋白酶

-PBS緩沖液

-封閉液（如5%BSA）

-一抗、二抗（如鼠抗人CD3抗體、羊抗鼠IgG抗體）

-FITC、PE等熒光標(biāo)記抗體

-DNA染料（如PI）

-透化劑（如0.1%TritonX-100）

2.**儀器**

-流式細(xì)胞儀

-離心機(jī)

-細(xì)胞計(jì)數(shù)板

-移液器

-冰箱

-CO2培養(yǎng)箱

3.**其他**

-細(xì)胞培養(yǎng)皿

-移液管架

-實(shí)驗(yàn)手套

-酒精燈

####（二）實(shí)驗(yàn)試劑配制

1.**RPMI-1640培養(yǎng)基**

-稱取RPMI-1640粉末（如1000g）溶于蒸餾水

-加入100mmol/L的L-谷氨酰胺

-補(bǔ)充電解質(zhì)和磷酸鹽緩沖液至終濃度

-過濾除菌，分裝后置于4℃保存

2.**PBS緩沖液**

-稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.4gNa2HPO4、0.2gKH2PO4溶于蒸餾水

-調(diào)節(jié)pH至7.4，分裝后置于4℃保存

3.**封閉液**

-將5%BSA溶于PBS緩沖液，過濾除菌

-分裝后置于4℃保存

###三、實(shí)驗(yàn)操作步驟

####（一）免疫細(xì)胞分離

1.**細(xì)胞培養(yǎng)**

-將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)

2.**胰蛋白酶消化**

-吸棄培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞

-在顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化

3.**細(xì)胞計(jì)數(shù)**

-使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^6/mL

4.**密度梯度離心**

-將細(xì)胞懸液加入等體積的Ficoll-Paque分層液

-離心（2000rpm，30分鐘），收集中間層細(xì)胞

####（二）流式細(xì)胞術(shù)檢測

1.**細(xì)胞透化**

-將細(xì)胞重懸于PBS緩沖液，加入0.1%TritonX-100透化30分鐘

-加入封閉液孵育30分鐘

2.**抗體染色**

-加入一抗（如CD3抗體）孵育30分鐘

-加入二抗（如羊抗鼠IgG抗體-FITC）孵育30分鐘

3.**PI染色**

-加入PI染料孵育10分鐘，用于細(xì)胞核計(jì)數(shù)

4.**流式細(xì)胞術(shù)檢測**

-將細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀樣品管，設(shè)置檢測參數(shù)

-收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析

###四、結(jié)果分析

####（一）細(xì)胞表面標(biāo)志物分析

1.**設(shè)門**

-根據(jù)細(xì)胞大小和前向散射（FSC）信號設(shè)門，排除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片

2.**分析細(xì)胞亞群**

-根據(jù)CD3表達(dá)情況，分析T細(xì)胞亞群比例

-計(jì)算CD4+和CD8+T細(xì)胞的百分比

####（二）細(xì)胞凋亡分析

1.**AnnexinV-FITC/PI雙染**

-加入AnnexinV-FITC和PI染料，孵育30分鐘

-流式細(xì)胞術(shù)檢測，分析細(xì)胞凋亡比例

2.**結(jié)果解讀**

-AnnexinV-FITC陽性、PI陰性細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞

-AnnexinV-FITC和PI均陽性細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞

###五、注意事項(xiàng)

1.**無菌操作**

-所有實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，避免污染

2.**溫度控制**

-細(xì)胞操作應(yīng)在4℃或37℃條件下進(jìn)行，確保細(xì)胞活性

3.**試劑新鮮度**

-使用新鮮配制的試劑，避免降解影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.**數(shù)據(jù)分析**

-使用合適的軟件（如FlowJo）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確保結(jié)果準(zhǔn)確

###三、實(shí)驗(yàn)操作步驟（續(xù)）

####（二）流式細(xì)胞術(shù)檢測（續(xù)）

4.**樣品加載與設(shè)置**

(1)**樣品制備**：確保細(xì)胞懸液濃度在1×10^6/mL至1×10^8/mL之間，過高的濃度可能導(dǎo)致樣品堵塞或分析偏差，過低則信號微弱。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板（如Countess）進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，必要時(shí)進(jìn)行系列稀釋。

(2)**預(yù)設(shè)檢測參數(shù)**：

-**參數(shù)通道設(shè)置**：根據(jù)所使用的抗體熒光標(biāo)記（如FITC在FL1，PE在FL2，PerCP-Cy5.5在FL3，PI在FL4），在流式細(xì)胞儀軟件（如FCSExpress,Kaluza）中正確設(shè)置對應(yīng)的熒光通道。

-**閾值設(shè)置**：設(shè)定FSC和SSC（側(cè)向散射）的閾值，以排除細(xì)胞碎片、顆粒和其他非細(xì)胞物質(zhì)。通常根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品（如熒光微球）調(diào)整。

-**補(bǔ)償設(shè)置**：如果實(shí)驗(yàn)中使用了多種熒光標(biāo)記，需要進(jìn)行熒光補(bǔ)償設(shè)置，以消除熒光串色干擾。大多數(shù)流式軟件提供自動或手動補(bǔ)償功能。

-**脈沖閾值**：設(shè)置合適的脈沖閾值，以減少噪聲信號和偽影。

(3)**樣品加載**：

-將細(xì)胞懸液與預(yù)混合好的染料（如PI染料，根據(jù)需要加入）充分混勻。

-使用自動樣品加載系統(tǒng)或手動將樣品加入樣品管，確保樣品管密封良好，避免氣泡進(jìn)入。

-設(shè)置合適的流速，通常為10^2-10^4cells/second，根據(jù)細(xì)胞濃度和儀器性能調(diào)整。

5.**數(shù)據(jù)采集**

(1)**采集模式選擇**：選擇合適的采集模式。對于分群分析，通常使用"列表模式(ListMode)"，可獲取每個(gè)細(xì)胞的所有參數(shù)信息。對于特定事件分析，可使用"閾值模式(ThresholdMode)"。

(2)**采集事件數(shù)**：根據(jù)細(xì)胞濃度和預(yù)期分析比例，設(shè)定足夠的事件數(shù)（如1×10^6至1×10^8events），以保證統(tǒng)計(jì)結(jié)果的可靠性?？赏ㄟ^預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳事件數(shù)。

(3)**運(yùn)行檢測**：確認(rèn)所有參數(shù)設(shè)置無誤后，開始數(shù)據(jù)采集。密切監(jiān)控儀器運(yùn)行狀態(tài)，確保數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定。

6.**數(shù)據(jù)初步分析（流式軟件內(nèi)）**

(1)**數(shù)據(jù)導(dǎo)入**：將采集到的原始數(shù)據(jù)文件（.fcs格式）導(dǎo)入流式細(xì)胞術(shù)分析軟件。

(2)**數(shù)據(jù)審查**：檢查FSC/SSC散點(diǎn)圖，確認(rèn)無異常顆粒（如高FSC無SSC的細(xì)胞碎片）。檢查熒光信號，確認(rèn)無明顯的熒光猝滅。

(3)**設(shè)門策略**：

-**初步設(shè)門**：在FSC/SSC散點(diǎn)圖上，根據(jù)細(xì)胞大小和復(fù)雜度，初步設(shè)門以排除雙細(xì)胞、死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。通常選擇FSC和SSC均呈高斯分布的群體。

-**細(xì)化設(shè)門**：在初步設(shè)門內(nèi)，根據(jù)感興趣的細(xì)胞亞群特征（如特定熒光強(qiáng)度），進(jìn)一步細(xì)化設(shè)門。

####（三）WesternBlotting實(shí)驗(yàn)（新增）

WesternBlotting是檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平和翻譯后修飾的重要技術(shù)。

1.**樣品制備**

(1)**細(xì)胞裂解**：

-收集目標(biāo)細(xì)胞，用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌去除培養(yǎng)基。

-加入預(yù)冷的裂解緩沖液（如RIPA緩沖液，含PMSF、蛋白酶抑制劑混合物），冰上裂解30-60分鐘。

-使用細(xì)胞刮刀或吸管充分懸浮細(xì)胞，部分樣品可加入尿素或SDS進(jìn)行蛋白質(zhì)變性。

-離心（12000rpm，4℃，15分鐘），收集上清液。

(2)**蛋白質(zhì)定量**：

-使用BCA或Bradford法測定上清液中總蛋白濃度。根據(jù)定量結(jié)果，將蛋白濃度調(diào)整至合適范圍（如20-50μg/泳道）。

2.**SDS電泳**

(1)**凝膠制備**：

-稱取丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺，溶解于去離子水中，配制成預(yù)定濃度的分離膠和濃縮膠。

-加入TEMED和氨水，迅速混勻，制膠。

-在制膠模具中加入分離膠，插入梳子（用于點(diǎn)樣），加入濃縮膠覆蓋。

(2)**樣品加載與電泳**：

-將調(diào)整好濃度的蛋白樣品與上樣緩沖液（含SDS、β-巰基乙醇）混合。

-將混合好的樣品加入樣品孔。

-連接電泳裝置，設(shè)置電壓（如濃縮膠80V，分離膠120V）和電流，進(jìn)行電泳。

-電泳至溴酚藍(lán)指示劑跑至凝膠底部。

3.**轉(zhuǎn)膜**

(1)**轉(zhuǎn)膜條件設(shè)置**：

-準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜裝置，加入冰冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液（如Tris-Glycine緩沖液，含20%甲醇）。

-將PVDF或NC膜裁剪至合適大小，用甲醇預(yù)處理10分鐘，再用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡。

(2)**轉(zhuǎn)膜操作**：

-將凝膠、濾紙（預(yù)浸濕）、膜依次放置于轉(zhuǎn)膜裝置中，確保膜與凝膠接觸良好，無氣泡。

-連接電源，設(shè)置合適的電壓（如12V）和時(shí)間（如1-2小時(shí)），進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

-轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出膜，用轉(zhuǎn)膜緩沖液漂洗。

4.**封閉**

(1)**封閉液配制**：將封閉液（如5%BSA或脫脂奶粉）溶于TBST緩沖液。

(2)**封閉操作**：

-將膜置于封閉液中，室溫孵育1-2小時(shí)，或4℃過夜。

-期間可輕搖，確保封閉均勻。

5.**一抗孵育**

(1)**一抗配制**：將稀釋好的特異性一抗（如兔抗人β-actin抗體）溶于封閉液。

(2)**孵育操作**：

-吸棄封閉液，用TBST緩沖液漂洗膜（如3次，每次10分鐘）。

-將膜置于含一抗的溶液中，4℃孵育過夜，或室溫孵育1-2小時(shí)。

6.**二抗孵育**

(1)**二抗配制**：將稀釋好的特異性二抗（如辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體）溶于TBST緩沖液。

(2)**孵育操作**：

-吸棄一抗溶液，用TBST緩沖液漂洗膜（如3次，每次10分鐘）。

-將膜置于含二抗的溶液中，室溫孵育1小時(shí)。

7.**化學(xué)發(fā)光檢測**

(1)**底物處理**：吸棄二抗溶液，用TBST緩沖液漂洗膜（如3次，每次5分鐘）。

-將膜置于化學(xué)發(fā)光底物溶液（如ECL試劑盒）中，避光反應(yīng)1-5分鐘。

(2)**成像**：使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（如ChemiDoc）采集膜圖像。調(diào)整曝光時(shí)間，確保信號清晰可見，避免過曝。

8.**結(jié)果分析**

(1)**條帶識別**：在成像結(jié)果中，找到目標(biāo)蛋白條帶和內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶。

(2)**定量分析**：使用圖像分析軟件（如ImageJ）對條帶進(jìn)行灰度值定量。將目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值進(jìn)行比較，計(jì)算相對表達(dá)量。

###五、注意事項(xiàng)（續(xù)）

1.**無菌操作（續(xù)）**：

-流式細(xì)胞術(shù)樣品制備和WesternBlotting樣品制備過程中，所有接觸細(xì)胞的器具（如移液管、培養(yǎng)皿）必須高壓滅菌。

-操作環(huán)境（超凈工作臺）應(yīng)保持潔凈，減少微生物污染。

2.**溫度控制（續(xù)）**：

-流式細(xì)胞術(shù)樣品和試劑應(yīng)預(yù)冷至4℃，特別是透化劑、染料和緩沖液。

-WesternBlotting中，裂解緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液等應(yīng)預(yù)冷至4℃或冰浴。

-蛋白質(zhì)樣品在冰上裂解和保存。

3.**試劑新鮮度（續(xù)）**：

-購買高質(zhì)量的商業(yè)試劑盒（如抗體、染料、緩沖液），并檢查生產(chǎn)日期和有效期。

-自配試劑（如培養(yǎng)基、緩沖液）應(yīng)新鮮配制或按要求儲存。

-熒光染料（如FITC、PE）對光敏感，應(yīng)避光保存和使用。

4.**數(shù)據(jù)分析（續(xù)）**：

-流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析時(shí)，注意區(qū)分細(xì)胞群體，避免將凋亡細(xì)胞、雙細(xì)胞等誤判為目標(biāo)細(xì)胞。

-WesternBlotting數(shù)據(jù)分析時(shí)，確保內(nèi)參蛋白表達(dá)穩(wěn)定，否則結(jié)果可能不可靠。

-使用標(biāo)準(zhǔn)化方法（如設(shè)置陰性對照、使用內(nèi)參）提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性。

5.**生物安全（新增）**：

-處理細(xì)胞和試劑時(shí)，佩戴實(shí)驗(yàn)手套，必要時(shí)佩戴護(hù)目鏡。

-使用移液器吸頭防止交叉污染。

-實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按規(guī)范處理廢棄物（如細(xì)胞培養(yǎng)廢液、化學(xué)試劑）。

6.**設(shè)備維護(hù)（新增）**：

-定期清潔流式細(xì)胞儀的流路系統(tǒng)和檢測窗口。

-檢查流式細(xì)胞儀的激光功率和熒光通道性能，確保儀器處于最佳狀態(tài)。

-定期校準(zhǔn)WesternBlotting電泳儀和轉(zhuǎn)膜裝置。

###一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)概述

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其與外界物質(zhì)相互作用的科學(xué)方法。通過實(shí)驗(yàn)，可以深入了解免疫應(yīng)答的機(jī)制、免疫細(xì)胞的分化和功能、免疫調(diào)節(jié)的過程等。本實(shí)驗(yàn)辦法旨在提供一個(gè)系統(tǒng)性的實(shí)驗(yàn)流程，包括實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、操作步驟、結(jié)果分析等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

####（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.**試劑**

-免疫細(xì)胞分離液（如Ficoll-Paque）

-RPMI-1640培養(yǎng)基

-胰蛋白酶

-PBS緩沖液

-封閉液（如5%BSA）

-一抗、二抗（如鼠抗人CD3抗體、羊抗鼠IgG抗體）

-FITC、PE等熒光標(biāo)記抗體

-DNA染料（如PI）

-透化劑（如0.1%TritonX-100）

2.**儀器**

-流式細(xì)胞儀

-離心機(jī)

-細(xì)胞計(jì)數(shù)板

-移液器

-冰箱

-CO2培養(yǎng)箱

3.**其他**

-細(xì)胞培養(yǎng)皿

-移液管架

-實(shí)驗(yàn)手套

-酒精燈

####（二）實(shí)驗(yàn)試劑配制

1.**RPMI-1640培養(yǎng)基**

-稱取RPMI-1640粉末（如1000g）溶于蒸餾水

-加入100mmol/L的L-谷氨酰胺

-補(bǔ)充電解質(zhì)和磷酸鹽緩沖液至終濃度

-過濾除菌，分裝后置于4℃保存

2.**PBS緩沖液**

-稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.4gNa2HPO4、0.2gKH2PO4溶于蒸餾水

-調(diào)節(jié)pH至7.4，分裝后置于4℃保存

3.**封閉液**

-將5%BSA溶于PBS緩沖液，過濾除菌

-分裝后置于4℃保存

###三、實(shí)驗(yàn)操作步驟

####（一）免疫細(xì)胞分離

1.**細(xì)胞培養(yǎng)**

-將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)

2.**胰蛋白酶消化**

-吸棄培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞

-在顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化

3.**細(xì)胞計(jì)數(shù)**

-使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^6/mL

4.**密度梯度離心**

-將細(xì)胞懸液加入等體積的Ficoll-Paque分層液

-離心（2000rpm，30分鐘），收集中間層細(xì)胞

####（二）流式細(xì)胞術(shù)檢測

1.**細(xì)胞透化**

-將細(xì)胞重懸于PBS緩沖液，加入0.1%TritonX-100透化30分鐘

-加入封閉液孵育30分鐘

2.**抗體染色**

-加入一抗（如CD3抗體）孵育30分鐘

-加入二抗（如羊抗鼠IgG抗體-FITC）孵育30分鐘

3.**PI染色**

-加入PI染料孵育10分鐘，用于細(xì)胞核計(jì)數(shù)

4.**流式細(xì)胞術(shù)檢測**

-將細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀樣品管，設(shè)置檢測參數(shù)

-收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析

###四、結(jié)果分析

####（一）細(xì)胞表面標(biāo)志物分析

1.**設(shè)門**

-根據(jù)細(xì)胞大小和前向散射（FSC）信號設(shè)門，排除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片

2.**分析細(xì)胞亞群**

-根據(jù)CD3表達(dá)情況，分析T細(xì)胞亞群比例

-計(jì)算CD4+和CD8+T細(xì)胞的百分比

####（二）細(xì)胞凋亡分析

1.**AnnexinV-FITC/PI雙染**

-加入AnnexinV-FITC和PI染料，孵育30分鐘

-流式細(xì)胞術(shù)檢測，分析細(xì)胞凋亡比例

2.**結(jié)果解讀**

-AnnexinV-FITC陽性、PI陰性細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞

-AnnexinV-FITC和PI均陽性細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞

###五、注意事項(xiàng)

1.**無菌操作**

-所有實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，避免污染

2.**溫度控制**

-細(xì)胞操作應(yīng)在4℃或37℃條件下進(jìn)行，確保細(xì)胞活性

3.**試劑新鮮度**

-使用新鮮配制的試劑，避免降解影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.**數(shù)據(jù)分析**

-使用合適的軟件（如FlowJo）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確保結(jié)果準(zhǔn)確

###三、實(shí)驗(yàn)操作步驟（續(xù)）

####（二）流式細(xì)胞術(shù)檢測（續(xù)）

4.**樣品加載與設(shè)置**

(1)**樣品制備**：確保細(xì)胞懸液濃度在1×10^6/mL至1×10^8/mL之間，過高的濃度可能導(dǎo)致樣品堵塞或分析偏差，過低則信號微弱。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板（如Countess）進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，必要時(shí)進(jìn)行系列稀釋。

(2)**預(yù)設(shè)檢測參數(shù)**：

-**參數(shù)通道設(shè)置**：根據(jù)所使用的抗體熒光標(biāo)記（如FITC在FL1，PE在FL2，PerCP-Cy5.5在FL3，PI在FL4），在流式細(xì)胞儀軟件（如FCSExpress,Kaluza）中正確設(shè)置對應(yīng)的熒光通道。

-**閾值設(shè)置**：設(shè)定FSC和SSC（側(cè)向散射）的閾值，以排除細(xì)胞碎片、顆粒和其他非細(xì)胞物質(zhì)。通常根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品（如熒光微球）調(diào)整。

-**補(bǔ)償設(shè)置**：如果實(shí)驗(yàn)中使用了多種熒光標(biāo)記，需要進(jìn)行熒光補(bǔ)償設(shè)置，以消除熒光串色干擾。大多數(shù)流式軟件提供自動或手動補(bǔ)償功能。

-**脈沖閾值**：設(shè)置合適的脈沖閾值，以減少噪聲信號和偽影。

(3)**樣品加載**：

-將細(xì)胞懸液與預(yù)混合好的染料（如PI染料，根據(jù)需要加入）充分混勻。

-使用自動樣品加載系統(tǒng)或手動將樣品加入樣品管，確保樣品管密封良好，避免氣泡進(jìn)入。

-設(shè)置合適的流速，通常為10^2-10^4cells/second，根據(jù)細(xì)胞濃度和儀器性能調(diào)整。

5.**數(shù)據(jù)采集**

(1)**采集模式選擇**：選擇合適的采集模式。對于分群分析，通常使用"列表模式(ListMode)"，可獲取每個(gè)細(xì)胞的所有參數(shù)信息。對于特定事件分析，可使用"閾值模式(ThresholdMode)"。

(2)**采集事件數(shù)**：根據(jù)細(xì)胞濃度和預(yù)期分析比例，設(shè)定足夠的事件數(shù)（如1×10^6至1×10^8events），以保證統(tǒng)計(jì)結(jié)果的可靠性?？赏ㄟ^預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳事件數(shù)。

(3)**運(yùn)行檢測**：確認(rèn)所有參數(shù)設(shè)置無誤后，開始數(shù)據(jù)采集。密切監(jiān)控儀器運(yùn)行狀態(tài)，確保數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定。

6.**數(shù)據(jù)初步分析（流式軟件內(nèi)）**

(1)**數(shù)據(jù)導(dǎo)入**：將采集到的原始數(shù)據(jù)文件（.fcs格式）導(dǎo)入流式細(xì)胞術(shù)分析軟件。

(2)**數(shù)據(jù)審查**：檢查FSC/SSC散點(diǎn)圖，確認(rèn)無異常顆粒（如高FSC無SSC的細(xì)胞碎片）。檢查熒光信號，確認(rèn)無明顯的熒光猝滅。

(3)**設(shè)門策略**：

-**初步設(shè)門**：在FSC/SSC散點(diǎn)圖上，根據(jù)細(xì)胞大小和復(fù)雜度，初步設(shè)門以排除雙細(xì)胞、死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。通常選擇FSC和SSC均呈高斯分布的群體。

-**細(xì)化設(shè)門**：在初步設(shè)門內(nèi)，根據(jù)感興趣的細(xì)胞亞群特征（如特定熒光強(qiáng)度），進(jìn)一步細(xì)化設(shè)門。

####（三）WesternBlotting實(shí)驗(yàn)（新增）

WesternBlotting是檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平和翻譯后修飾的重要技術(shù)。

1.**樣品制備**

(1)**細(xì)胞裂解**：

-收集目標(biāo)細(xì)胞，用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌去除培養(yǎng)基。

-加入預(yù)冷的裂解緩沖液（如RIPA緩沖液，含PMSF、蛋白酶抑制劑混合物），冰上裂解30-60分鐘。

-使用細(xì)胞刮刀或吸管充分懸浮細(xì)胞，部分樣品可加入尿素或SDS進(jìn)行蛋白質(zhì)變性。

-離心（12000rpm，4℃，15分鐘），收集上清液。

(2)**蛋白質(zhì)定量**：

-使用BCA或Bradford法測定上清液中總蛋白濃度。根據(jù)定量結(jié)果，將蛋白濃度調(diào)整至合適范圍（如20-50μg/泳道）。

2.**SDS電泳**

(1)**凝膠制備**：

-稱取丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺，溶解于去離子水中，配制成預(yù)定濃度的分離膠和濃縮膠。

-加入TEMED和氨水，迅速混勻，制膠。

-在制膠模具中加入分離膠，插入梳子（用于點(diǎn)樣），加入濃縮膠覆蓋。

(2)**樣品加載與電泳**：

-將調(diào)整好濃度的蛋白樣品與上樣緩沖液（含SDS、β-巰基乙醇）混合。

-將混合好的樣品加入樣品孔。

-連接電泳裝置，設(shè)置電壓（如濃縮膠80V，分離膠120V）和電流，進(jìn)行電泳。

-電泳至溴酚藍(lán)指示劑跑至凝膠底部。

3.**轉(zhuǎn)膜**

(1)**轉(zhuǎn)膜條件設(shè)置**：

-準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜裝置，加入冰冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液（如Tris-Glycine緩沖液，含20%甲醇）。

-將PVDF或NC膜裁剪至合適大小，用甲醇預(yù)處理10分鐘，再用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡。

(2)**轉(zhuǎn)膜操作**：

-將凝膠、濾紙（預(yù)浸濕）、膜依次放置于轉(zhuǎn)膜裝置中，確保膜與凝膠接觸良好，無氣泡。

-連接電源，設(shè)置合適的電壓（如12V）和時(shí)間（如1-2小時(shí)），進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

-轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出膜，用轉(zhuǎn)膜緩沖液漂洗。

4.**封閉**

(1)**封閉液配制**：將封閉液（如5%BSA或脫脂奶粉）溶于TBST緩沖液。

(2)**封閉操作**：

-將膜置于封閉液中，室溫孵育1-2小時(shí)，或4℃過夜。

-期間可輕搖，確保封閉均勻。

5.**一抗孵育**

(1)**一抗配制**：將稀釋好的特異性一抗（如兔抗人β-actin抗體）溶于封閉液。

(2)**孵育操作**：

-吸棄封閉液，用TBST緩沖液漂洗膜（如3次，每次10分鐘）。

-將膜置于含一抗的溶液中，4℃孵育過夜，或室溫孵育1-2小時(shí)。

6.**二抗孵育**

(1)**二抗配制**：將稀釋好的特異性二抗（如辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體）溶于TBST緩沖液。

(2)**孵育操作**：

-吸棄一抗溶液，用TBST緩沖液漂洗膜（如3次，每次10分鐘）。

-將膜置于含二抗的溶液中，