ICS65.020.20

CCSB05

DB23

黑龍江省地方標準

DB23/T3169—2022

大豆根瘤菌競爭結瘤能力與固氮效果評價

技術規(guī)程

2022-05-09發(fā)布2022-06-08實施

黑龍江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB23/T3169—2022

前言

本文件依據GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由黑龍江省農業(yè)農村廳提出。

本文件起草單位：黑龍江省農業(yè)科學院土壤肥料與環(huán)境資源研究所。

本標準主要起草人：王爽、孫磊、金品嬌、李偉群、陳雪麗、萬書明、劉凱、李一丹、孫秀君。

I

DB23/T3169—2022

大豆根瘤菌競爭結瘤能力與固氮效果評價技術規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了大豆根瘤菌競爭結瘤能力與固氮效果評價技術的術語和定義、結瘤能力評價與固氮效

果評價的方法。

本文件適用于外源接種大豆根瘤菌的效果評價。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T19495.2轉基因產品檢測實驗室技術要求

GB/T19495.3-2004轉基因產品檢測核酸提取純化方法

NY/T2066-2011微生物肥料生產菌株的鑒別聚合酶鏈式反應（PCR）法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

占瘤率

應用特定根瘤菌株接種豆科植物與土著根瘤菌競爭結瘤,在競爭中特定根瘤菌結瘤數(shù)占總瘤數(shù)的百

分數(shù)稱為占瘤率。占瘤率是評估接種根瘤菌相對土著根瘤菌的競爭結瘤能力的重要參數(shù)。

3.2

競爭結瘤能力

根瘤菌能夠在宿主豆科植物上形成根瘤，而且它在其他根瘤菌存在的情況下，也能與相同的豆科植

物結瘤的能力，叫做競爭結瘤能力。

3.3

固氮能力

固氮能力是根瘤菌將分子態(tài)氮還原成氨和其他含氮化合物的能力，通過對比接種待測菌株與未接種

處理的根瘤固氮酶活性和植株全氮含量來評價。

4結瘤能力評價

4.1一般要求

實驗室操作人員應具備良好的分子生物學專業(yè)技能，操作熟練。有毒、有害、廢棄物的處理及安全

防護應符合GB/T19495.2的要求。

1

DB23/T3169—2022

4.2原理

利用BOX-PCR指紋圖譜比較，檢測接種根瘤菌菌株的占瘤率，以此評價供試菌株相對于土著根瘤菌

的競爭結瘤能力；根據根瘤固氮酶活性和大豆植株全氮含量，協(xié)同評價根瘤菌的固氮能力。

4.3主要材料與用具

鐵鍬、小鏟、鑷子、記號筆、塑料袋、剪刀、冰盒、小型離心機、微量可調移液器及對應的無菌

Tip頭、1.5mL無菌離心管、振蕩培養(yǎng)箱（搖床）、靜置培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、分光光度計、細菌

基因組DNA提取試劑盒、超凈工作臺、PCR儀、電泳儀及電泳槽、凝膠成像分析儀等。

4.4占瘤率測定方法

4.4.1蛭石盆栽實驗中根瘤菌占瘤率的測定

根瘤菌占瘤率的測定按照如下程序進行：

a）大豆種子的處理

精選無病、飽滿、大小一致的大豆種子，經過75%酒精處理2min、20%次氯酸鈉處理5min、無菌水

水洗3次后置于1%水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待其萌芽后種植于滅菌的蛭石中，進行蛭石盆栽培養(yǎng)，每盆3

?！?粒大豆種子。

b）根瘤菌接種

將根瘤菌接種于YMA培養(yǎng)基（配方見附錄A）上，5d后用生理鹽水將菌體洗下來。待大豆對生真葉

展開時，將上述菌懸液接種于根部，每盆約5mL菌液（OD600=1.0），每個菌株接種3棵～4棵植株。以不

接種無菌生理鹽水的大豆為陰性對照。

c）根瘤中收獲類菌體

蛭石盆栽培養(yǎng)45d后收獲根瘤，每個盆中隨機挑取3個～5個根瘤，分別用75%乙醇消毒1min、15%

次氯酸鈉消毒3min、無菌水水洗3次后置于滅菌的EP管中，用滅菌的鑷子將根瘤搗碎后，使根瘤內汁液

流出，去除植物根瘤組織后，加入10μL的無菌水，13000rpm離心3min，保留沉淀，即為收獲的類菌

體。

d）類菌體DNA的制備

在上述收獲的類菌體中加入10μL無菌水充分懸浮類菌體，混勻后于沸水中煮沸5min，然后迅速

移入冰上冰浴5min，隨后進行13000rpm離心3min，取上清液，參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書

提取根瘤菌基因組DNA，即為類菌體DNA模板。

e）BOX-PCR擴增

以接種菌株的基因組DNA為對照進行BOX-PCR，接種菌株的DNA提取方法按照GB/T19495.3-2004附錄

A.4中的規(guī)定執(zhí)行，BOX-PCR擴增體系及擴增反應程序見附錄B。

f）BOX-PCR產物的檢測：電泳結束后在凝膠成像分析儀中掃描凝膠，將指紋圖譜用TIFF文件保存，

PCR產物電泳圖譜帶型按照NY/T2066-2011中5.6和6.2規(guī)定的方法進行檢測與判定。

4.4.2土壤盆栽試驗中根瘤菌占瘤率的測定

以土壤作為大豆生產的基質，按照上述方法進行土壤盆栽試驗，從根際隨機挑取20個根瘤并進行根

瘤表面消毒，無菌水清洗后，按照上述方法進行BOX-PCR擴增及圖譜分析。

4.4.3結果分析

對比分離根瘤菌與接種菌種的BOX-PCR指紋圖譜，達到100%相似水平時即可定位同一類BOX圖譜類

型，統(tǒng)計各類型的菌株數(shù)量，占空白對照所分離的根瘤菌菌株的比例即為屬于該類型的根瘤菌的占瘤率。

2

DB23/T3169—2022

5固氮效果評價

5.1材料與工具

大豆盛花期植株根瘤樣品，102G型氣相色譜儀，標準乙烯（靈敏度為103，衰減1/128），待測樣品

中乙烯（靈敏度為104，衰減1/1），乙炔（C2H2）氣體，100mL帶有異丁基膠塞的血清瓶，注射器（1mL、

10mL密封性能好的），100μL微量注射器。

5.2固氮酶活性測定

采用乙炔還原法測定大豆根瘤菌固氮酶活性：取樣計數(shù)后將鮮根瘤稱重，收集到100mL血清瓶中，

立即用異丁基膠塞密封，然后按瓶子中氣相體積用注射器從瓶中抽空5%～10%的空氣，再用注射器注入

等體積的C2H2，28oC保溫2h。取出瓶子，用注射器吸出100mL的混合氣體，用氣相色譜儀以外標法測

定其固氮酶活性。計算公式如下：

n

U

mt

式中：

U——根瘤固氮酶活性nmol/mg/h；

n——乙烯含量nmol；

m——根瘤鮮重mg；

t——反應時間h。

5.3全氮含量測定

植物全氮含量計算公式如下：

cV2V10.014

W

mV3V1000

式中：

W——植株全氮含量g/kg；

c——硫酸標準溶液的濃度0.01moL/L；

V1——空白滴定消耗標準液量mL；

V2——試劑滴定消耗標準液量mL；

V3——上機測試液量10mL；

m——樣品質量g；

V——消煮后定容液量100mL；

0.014——氮的毫摩爾質量g/mmoL。

3

DB23/T3169—2022

附錄A

（規(guī)范性）

培養(yǎng)基配方

A.1YMA培養(yǎng)基配方

甘露醇，10.0g；酵母粉，0.8g；K2HPO4，0.25g；KH2PO4，0.25g；MgSO4·7H2O，0.2g；NaCl，

0.1g；0.25%溴麝香草酚藍（僅在從根瘤中分離根瘤菌時選擇性的加入），1mL；瓊脂，15g～18g；

蒸餾水，1000mL；pH值，6.8～7.0。

4

DB23/T3169—2022

附錄B

（規(guī)范性）

BOX-PCR擴增體系及擴增反應程序

B.1BOX-PCR引物

BOX-A1R：