ICS65.150

CCSB50/59

DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3638—2022

海蜇種質(zhì)鑒定技術(shù)規(guī)范

TechnicalRegulationforGermplasmidentificationofRhopilemaesculentum

2022-10-30發(fā)布2022-11-30實(shí)施

遼寧省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及某些專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。

本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

本文件起草單位：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院。

本文件主要起草人：李云峰、李玉龍、周遵春、鮑相渤、陳百靈、陳井童、田梅琳。

本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問(wèn)題和意見(jiàn)建議，均可以通過(guò)來(lái)電和來(lái)函等方式進(jìn)行反饋，

我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。

歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽(yáng)市和平區(qū)太原北街2號(hào)），聯(lián)系電話

文件起草單位通訊地址：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院（大連市沙河口區(qū)黑石礁街50號(hào)），聯(lián)系電話：

0411—84697003。

I

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海蜇種質(zhì)鑒定技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了海蜇（Rhopilemaesculentum）的學(xué)名與分類、鑒定方法和判定規(guī)則。

本文件適用于海蜇種質(zhì)檢測(cè)和鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T18654.2養(yǎng)殖魚(yú)類種質(zhì)檢驗(yàn)第2部分：抽樣方法

GB/T18654.12養(yǎng)殖魚(yú)類種質(zhì)檢驗(yàn)第12部分：染色體組型分析

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4學(xué)名與分類

4.1學(xué)名

海蜇Rhopilemaesculentum（Kishinouye,1891）。

4.2分類

刺胞動(dòng)物門（Cnidaria）、缽水母綱（Scyphomedusae）、根口水母目（Rhizostomeae）、根口水母

科（Rhizostomatidae）、海蜇屬（Rhopilema）。

5鑒定方法

5.1抽樣

按GB/T18654.2規(guī)定執(zhí)行。

5.2形態(tài)特征

在自然光下進(jìn)行觀察記錄，體形呈蘑菇狀，分為傘體部和口腕部，傘體部和口腕部之間，由胃柱、

胃膜、口柱連為一體。傘體部表面光滑，呈半球形，傘體部邊緣有8個(gè)感覺(jué)器，將傘緣平分成為8個(gè)區(qū)，

每個(gè)區(qū)有14個(gè)~22個(gè)緣瓣，呈舌狀。生殖下穴外側(cè)的內(nèi)傘部表面有4個(gè)生殖乳突，口柱基部具有8對(duì)肩板，

每個(gè)肩板左右扁平，為三翼形?？谕蟛烤哂?條口腕，呈三翼型，口腕上具有絲狀附屬器和棒狀附屬器。

海蜇外形及縱切面圖見(jiàn)圖1。

1

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圖1.海蜇外形及縱切面圖

1.中膠層；2.胃腔；3.生殖下穴；4.間輻管；5.肩板；6.口腕管；7.外傘；8.生殖乳突；9.生殖腺；10.

胃絲；11.內(nèi)傘；12.感覺(jué)器；13.緣瓣；14.口腕；15.絲狀附屬器；16.棒狀附屬器

5.3繁殖

5.3.1性成熟

海蜇雌雄異體，雄性和雌性性成熟年齡為1齡。

5.3.2懷卵量

懷卵量隨個(gè)體的增大而增加，每個(gè)雌性海蜇一生的懷卵量為2.0×106粒~8.0×107粒。在顯微鏡下觀察

性腺發(fā)育情況，當(dāng)卵子直徑在80μm~100μm可進(jìn)行繁殖，統(tǒng)計(jì)每個(gè)雌性海蜇的懷卵量。

5.3.3產(chǎn)卵類型

海蜇分批產(chǎn)卵，卵為沉性卵，卵徑80μm~100μm，產(chǎn)卵2批~3批，產(chǎn)卵時(shí)間在8月~10月。

5.3.4繁殖特性

世代交替生殖，水母型通過(guò)有性生殖產(chǎn)生無(wú)性世代水螅型，水螅型通過(guò)橫裂生殖產(chǎn)生有性世代水母

型。

5.4細(xì)胞遺傳學(xué)特性檢測(cè)

5.4.1染色體數(shù)

體細(xì)胞染色體數(shù)：2n=42。

5.4.2核型

染色體組核型公式：10m+14sm+12st+6t，NF=78。

染色體核型見(jiàn)圖2。

2

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圖2.染色體核型

5.4.3染色體標(biāo)本的制備

按照附錄A的規(guī)定執(zhí)行。

5.4.4染色體數(shù)目及核型分析

按照GB/T18654.12執(zhí)行。

5.5分子遺傳學(xué)特征

5.5.1DNA提取

取海蜇口腕部200mg，用DNA提取試劑盒或CTAB法進(jìn)行提取。

5.5.2COI基因的引物序列

正向引物(F)：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；反向引物(R)：TAAACTTCAGGGTGACCAAAA

AATCA。

5.5.3反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)液見(jiàn)附錄B表B.1。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；進(jìn)入30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃變性30

s，53℃~56℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。

5.5.4COI基因序列測(cè)序

PCR產(chǎn)物純化后克隆進(jìn)行測(cè)序。

COI基因片段序列如下：

長(zhǎng)度為620bp

ACTGATACACTGATTGACGTACTGACAATCTGATTGTCTGTCGTCTGTCGCTTGCTTGTGCAGCAGCTTATGCAGCAGCTGACAC

AACACGACCACTGTGAACTTGTACCATCCGTGTGAGGTGGACAGAGCTGCGTGTGTCTGTCCTTGCATGAAGAGCACCTCCCTCGTGTG

TCTATCTCTTCGGCCTCACATTGGAGCTATTTTGTTGGTTGTTTTTGCTGCCATTTTTAACACGTTATTATATTATACAAATTGTTGCT

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GCACACGCACCAGAAGAGACGTTCGCTCGTTCGCTCGTTCGTTTGTCTCTTGCTGTATACGTGTGGCTAGCGATAAAACAAAACAAACC

AAGAAACAACTTCCAACGGTGGATCTCTTGGCTCGTGCATCGATGAAGAACGCAGCCAGCTGCGATATGTAGTGTGAATTGCAGAACCC

AGCGAATCATCGAATCTTTGAACGCAAATGGCGCTCCTTGGTTCTCCATGGAGCACGTCTGTCTGAGCGTCATGGCCAATCAATCCCAA

TAGCACACGCTCTTCTGCAAAGAGAGGAGCATGTGGCGTTGAGGCAACACGGCGTTGATGACGGACATCAGCCATCAACTGATGTCTGT

C

6判斷規(guī)則

符合第5章要求，且COI基因序列測(cè)序結(jié)果與5.5.4節(jié)比對(duì)結(jié)果相似度在98%以上，判定為該種。

4

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附錄A

(規(guī)范性）

染色體標(biāo)本的制備方法

A.1秋水仙素處理：將發(fā)育至囊胚期的胚胎細(xì)胞收集于10ml管內(nèi)，加入終濃度為0.4g/L的秋水仙素（無(wú)

菌海水配置）于24℃處理45min。

A.2低滲：將細(xì)胞懸液于1000rpm/min離心10min，去除上清后加入0.075mol/L的KCl溶液，27℃低滲

45min。

A.3固定：去上清后，加入-20℃冰箱中預(yù)冷的現(xiàn)配置的卡諾固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）固定3次，

每次15min，后置于-20℃中過(guò)夜處理。

A.4解離：-20℃中取出已經(jīng)固定好的細(xì)胞懸液，離心去上清，加入預(yù)冷的50%冰醋酸1-2滴進(jìn)行解離

后，加入-20℃預(yù)冷的新配置的卡諾固定液。

A.5滴片：將細(xì)胞懸液在距冰凍載玻片上1m左右的高度滴下，酒精燈火焰干燥。

A.6染色：將載玻片置于現(xiàn)配置的10%Giemsa（pH=6.8）染缸內(nèi)染色30min，用蒸餾水沖洗干凈，或?qū)?/p>

載玻片用DAPI染色，封片，染色24h，-20℃保存。

A.7觀察：將染色體標(biāo)本在100倍油鏡下檢測(cè)觀察。

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附錄B

(規(guī)范性）

PCR擴(kuò)增反應(yīng)液

PCR擴(kuò)增反應(yīng)液配方見(jiàn)表B.1。

表B.1PCR擴(kuò)增反應(yīng)液配方

反應(yīng)體系含量