重組蛋白包涵體形成原因及解決方案重組蛋白的生產(chǎn)過程在生物制藥和生物科研領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用。盡管基因工程技術(shù)的進(jìn)步大大提高了重組蛋白的生產(chǎn)效率，但在某些情況下，重組蛋白在表達(dá)過程中會形成包涵體，影響其純度、活性和后續(xù)的應(yīng)用。這篇文章將從技術(shù)角度探討重組蛋白包涵體的形成原因及常見的解決方案，為研究人員和相關(guān)行業(yè)從業(yè)者提供有價值的參考。一、重組蛋白包涵體的定義與形成機(jī)制重組蛋白包涵體是指在細(xì)胞內(nèi)，尤其是大腸桿菌（E.coli）等宿主細(xì)胞中，重組蛋白在過表達(dá)過程中形成的非溶解性顆粒。這些包涵體通常含有大量的蛋白質(zhì)分子，但其大部分處于錯誤的折疊狀態(tài)，無法正常發(fā)揮生物學(xué)功能。1.重組蛋白表達(dá)量過高重組蛋白包涵體的主要形成原因之一是表達(dá)量過高。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的重組蛋白超出宿主細(xì)胞的表達(dá)和折疊能力時，蛋白質(zhì)就無法及時正確折疊，進(jìn)而形成包涵體。過度表達(dá)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中的積累，形成不溶性聚集物。尤其在大腸桿菌等原核宿主中，這一問題尤為突出，因為這些宿主缺乏復(fù)雜的分子伴侶系統(tǒng)，難以處理大量的重組蛋白。2.重組蛋白的折疊問題蛋白質(zhì)的折疊是一個復(fù)雜的過程，涉及到多種分子伴侶（如DnaK、GroEL等）以及正確的環(huán)境條件。在重組蛋白的合成過程中，如果沒有合適的分子伴侶和折疊環(huán)境，重組蛋白容易形成錯誤折疊的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致包涵體的形成。此外，某些蛋白質(zhì)本身具有較為復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)或特定的翻譯后修飾需求，這些蛋白質(zhì)在過量表達(dá)時更容易積聚成包涵體。3.培養(yǎng)條件的影響培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基成分、通氣條件等也會影響重組蛋白的折疊與聚集。例如，在高溫下表達(dá)時，蛋白質(zhì)折疊速率可能超過分子伴侶的反應(yīng)能力，導(dǎo)致折疊不完全并聚集成包涵體。此外，不適宜的培養(yǎng)基成分，尤其是缺乏必需的氨基酸或輔因子，也會影響蛋白質(zhì)的正常折疊，從而促進(jìn)包涵體的形成。二、重組蛋白包涵體的解決方案雖然包涵體的形成會給重組蛋白的生產(chǎn)帶來挑戰(zhàn)，但通過一定的技術(shù)手段和優(yōu)化策略，研究人員可以有效地解決這一問題。以下是幾種常見的解決方案。1.降低表達(dá)溫度降低重組蛋白的表達(dá)溫度是防止包涵體形成的一種常見方法。在較低的溫度下，蛋白質(zhì)合成速率會減緩，分子伴侶有更多的時間幫助蛋白質(zhì)正確折疊，從而減少錯誤折疊的風(fēng)險。對于許多重組蛋白而言，降低表達(dá)溫度（如16-25°C）通常能夠顯著降低包涵體的形成。2.優(yōu)化宿主細(xì)胞的選擇選擇適合的宿主細(xì)胞也是減少包涵體形成的有效方法。大腸桿菌是最常用的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，但對于某些蛋白，尤其是那些需要復(fù)雜折疊的蛋白，大腸桿菌的分子伴侶系統(tǒng)可能不足以支持其正確折疊。在這種情況下，可以考慮使用其他宿主細(xì)胞，如酵母（Saccharomycescerevisiae）、昆蟲細(xì)胞（如Sf9細(xì)胞）或哺乳動物細(xì)胞。這些宿主通常具備更復(fù)雜的折疊和后期修飾能力，有助于減少包涵體的形成。3.添加分子伴侶或輔助因子在表達(dá)過程中添加分子伴侶或輔助因子可以提高蛋白質(zhì)的折疊效率，減少包涵體的形成。例如，GroEL/GroES復(fù)合物和DnaK分子伴侶系統(tǒng)可以幫助蛋白質(zhì)在合成過程中正確折疊，減少誤折疊和聚集。此外，一些化學(xué)試劑，如精氨酸或甘油等，也能夠提高折疊效率，抑制包涵體的形成。4.調(diào)控誘導(dǎo)劑的濃度許多重組蛋白的表達(dá)是通過使用誘導(dǎo)劑（如IPTG）來控制的。如果誘導(dǎo)劑濃度過高，可能會導(dǎo)致過量表達(dá)，進(jìn)而形成包涵體。因此，適當(dāng)控制誘導(dǎo)劑的濃度，確保蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)以適當(dāng)?shù)乃俣群铣?，是避免包涵體形成的關(guān)鍵措施。一般來說，誘導(dǎo)劑濃度應(yīng)在最低能夠促進(jìn)重組蛋白表達(dá)的范圍內(nèi)，避免過高的表達(dá)量。5.適當(dāng)?shù)娜芙鈼l件如果包涵體已經(jīng)形成，在提取過程中需要采取適當(dāng)?shù)娜芙鈼l件。通過優(yōu)化溶解緩沖液的成分、pH和溫度等，可以有效地溶解包涵體，恢復(fù)蛋白質(zhì)的可溶性。常用的溶解劑包括尿素或硫脲等，能夠有效破壞蛋白質(zhì)聚集體并重新獲得可溶性蛋白。之后，通過透析或其他純化步驟去除溶解劑，恢復(fù)蛋白質(zhì)的活性。三、重組蛋白的相關(guān)產(chǎn)品及應(yīng)用在重組蛋白的生產(chǎn)過程中，解決包涵體問題不僅僅是提升蛋白質(zhì)表達(dá)的效率，更能為后續(xù)的應(yīng)用提供高質(zhì)量的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)廣泛應(yīng)用于生物制藥、疫苗開發(fā)、抗體生產(chǎn)以及其他生命科學(xué)領(lǐng)域。以下是幾種在重組蛋白生產(chǎn)中常用的產(chǎn)品類別：重組酶：如重組DNA酶、重組RNA酶、重組胰蛋白酶等，廣泛應(yīng)用于基因工程、克隆實驗等領(lǐng)域。重組抗體：通過重組技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究、診斷試劑開發(fā)等。重組疫苗：通過重組技術(shù)生產(chǎn)的抗原蛋白，用于疫苗的研發(fā)。重組酶標(biāo)試劑：用于各種生化分析、蛋白質(zhì)檢測等實驗室操作。重組激素：如人胰島素、生長激素等，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)治療和生物制劑領(lǐng)域。四、結(jié)論重組蛋白包涵體的形成是重組蛋白生產(chǎn)過程中的一個常見問題，但通過優(yōu)化表達(dá)條件、選擇合適的宿主系統(tǒng)以及添加分子伴侶等技術(shù)手段，可以有效減少包涵體的形成，確保重組蛋白的高質(zhì)量表達(dá)。對于生物公司而言，掌握這些技術(shù)細(xì)節(jié)，不僅能提升重組蛋白生產(chǎn)的效率，還能確保其在科研和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中的可靠性。參考文獻(xiàn)1.Walsh,G.(2018).Post-translationalmodificationsofproteinbiopharmaceuticals.NatureBiotechnology,36(10),1069-1077.2.Sharma,S.&Verma,S.(2017).ImpactoftemperatureandpHontheformationofinclusionbodiesinrecombinantproteinproduction.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,101(5),1895-1904.3.Jang,H.,etal.(2019).ImprovingthesolubilityofrecombinantproteinsinE.coliviaoptimizedexpressionconditions.BiotechnologyAdvances,37(1),18-24.4.Xu,X.,etal.(2020).StrategiestoenhancetheyieldofsolublerecombinantproteinsexpressedinE.coli.FEMSMicrobiologyLetters,367(3),fnaa052.5.Banas,A.,etal.(2015).InclusionbodyformationinEscherichiacoli:Strategiesforpreventionandsolubilization.JournalofBiotechnology,207,22-31.6.Garg,D.,etal.(2019).Molecularchaperonesinproteinfoldingandinclusionbodyformation.BiochemicalSocietyTransactions,47(5),1513-1523.7.Hong,P.,etal