演講人：日期:步步高單克隆抗體的流程目錄CATALOGUE01免疫原準備02動物免疫03細胞融合04雜交瘤篩選05克隆與生產(chǎn)06純化與鑒定PART01免疫原準備抗原選擇標準免疫原性與特異性抗原需具備強免疫原性以刺激B細胞活化，同時需確保其表位特異性，避免與其他蛋白發(fā)生交叉反應。優(yōu)先選擇天然構(gòu)象完整的蛋白或合成多肽。純度與穩(wěn)定性抗原純度應達到電泳級（>90%），避免宿主蛋白污染；需通過HPLC或質(zhì)譜驗證穩(wěn)定性，確保在免疫周期內(nèi)不發(fā)生降解或構(gòu)象改變。分子量適宜性推薦使用10-150kDa范圍內(nèi)的抗原，過小需載體蛋白偶聯(lián)（如KLH），過大可能影響淋巴結(jié)攝取效率。弗氏佐劑體系可選用TLR激動劑（如CpGODN）或納米顆粒佐劑，通過激活樹突細胞增強Th1/Th2雙向免疫應答，但需進行預實驗優(yōu)化配比。新型佐劑應用生物安全性評估所有佐劑需通過內(nèi)毒素檢測（<0.1EU/mg），避免使用可引起自身免疫反應的成分如百日咳毒素。初次免疫采用完全弗氏佐劑（CFA）形成油包水乳劑，加強免疫改用不完全弗氏佐劑（IFA），需嚴格控制注射劑量避免肉芽腫形成。佐劑使用原則免疫原制備方法蛋白抗原處理重組蛋白需經(jīng)復性緩沖液處理恢復天然構(gòu)象，膜蛋白需添加CHAPS等溫和去垢劑維持溶解性，凍干品需用PBS緩慢復溶避免聚集。多肽偶聯(lián)技術通過Sulfo-SMCC等異雙功能交聯(lián)劑將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，需控制摩爾比（20:1-30:1）并通過MALDI-TOF驗證偶聯(lián)效率。滅活病原體制備采用β-丙內(nèi)酯或甲醛滅活后超速離心純化，需通過空斑試驗驗證無活性殘留，并添加鋁佐劑增強呈遞效果。PART02動物免疫免疫方案設計免疫周期規(guī)劃設計包含基礎免疫、加強免疫的階梯式程序，基礎免疫間隔周期需覆蓋淋巴細胞活化期，加強免疫時機依據(jù)血清抗體動態(tài)調(diào)整。03優(yōu)先采用皮下、腹腔或淋巴結(jié)注射等多點免疫策略，確保抗原充分接觸免疫系統(tǒng)。佐劑選擇需匹配抗原性質(zhì)，如弗氏佐劑適用于水溶性抗原。02免疫途徑確定抗原選擇與優(yōu)化根據(jù)目標蛋白特性篩選高純度抗原，必要時進行抗原表位修飾或偶聯(lián)載體蛋白以增強免疫原性。需綜合考慮分子量、穩(wěn)定性及宿主兼容性。01梯度劑量測試基礎免疫階段每間隔一定周期進行免疫，加強免疫頻率需結(jié)合ELISA效價監(jiān)測結(jié)果，通常效價平臺期后實施最終加強。動態(tài)頻率調(diào)整生理狀態(tài)監(jiān)控定期監(jiān)測動物體溫、體重及局部反應，異常情況下需暫停免疫并優(yōu)化方案，確保動物福利與免疫效果平衡。通過預實驗確定最佳抗原劑量，避免免疫耐受或過度炎癥反應。初始劑量通常為50-100μg/次，后續(xù)根據(jù)動物體重和反應調(diào)整。劑量與頻率控制在末次免疫后定期采血檢測，繪制抗體效價變化曲線。效價達到1:10^5以上方可進行細胞融合，過低時需追加免疫。動態(tài)監(jiān)測策略檢測血清對相關蛋白的交叉結(jié)合能力，必要時通過親和層析純化目標抗體，減少后續(xù)篩選假陽性。交叉反應評估包被純化抗原建立檢測標準曲線，設置陽性/陰性對照，確保效價檢測特異性。臨界值設定需通過統(tǒng)計學分析確定。標準化ELISA體系建立血清效價檢測PART03細胞融合骨髓瘤細胞培養(yǎng)采用高糖DMEM培養(yǎng)基，補充10%-15%胎牛血清、1%非必需氨基酸及2mML-谷氨酰胺，確保細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)充足。細胞培養(yǎng)基配制培養(yǎng)環(huán)境控制傳代與凍存維持恒溫培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2飽和濕度，定期觀察細胞形態(tài)和密度，避免污染或過度生長導致細胞老化。當細胞融合度達80%-90%時，用0.25%胰酶消化傳代，凍存時采用含10%DMSO的凍存液，梯度降溫保存于液氮中。脾細胞分離技術脾臟組織處理無菌條件下取出脾臟，置于預冷的PBS緩沖液中，用注射器內(nèi)芯輕柔研磨并通過200目細胞篩網(wǎng)獲得單細胞懸液。紅細胞裂解采用臺盼藍染色法計數(shù)，要求活細胞比例超過95%，并通過流式細胞術檢測B淋巴細胞表面標志物CD19的表達水平。使用ACK裂解液處理細胞懸液5分鐘，離心去除紅細胞殘留，保留淋巴細胞群體用于后續(xù)融合實驗。細胞活性檢測融合試劑與條件PEG融合法選用分子量1500-4000的聚乙二醇作為融合劑，濃度控制在50%，融合時嚴格保持37℃水浴并精確控制作用時間在1-2分鐘。電融合技術采用方波電脈沖參數(shù)為場強1-2kV/cm、脈沖寬度30-50μs，優(yōu)化膜穿孔效率的同時保證細胞存活率。后處理步驟融合后立即用無血清培養(yǎng)基稀釋終止反應，低速離心去除殘留PEG，重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中進行雜交瘤篩選。PART04雜交瘤篩選HAT培養(yǎng)基應用選擇性抑制非融合細胞HAT培養(yǎng)基中的氨基蝶呤能阻斷核苷酸合成途徑，抑制骨髓瘤細胞增殖，而雜交瘤細胞可利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶通過補救途徑存活，從而實現(xiàn)選擇性培養(yǎng)。優(yōu)化細胞融合效率通過調(diào)整HAT培養(yǎng)基中次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的濃度比例，可顯著提高雜交瘤細胞的形成率，同時減少未融合親本細胞的干擾。長期穩(wěn)定性驗證需定期檢測HAT培養(yǎng)基的pH值、滲透壓及營養(yǎng)成分穩(wěn)定性，確保其能持續(xù)維持雜交瘤細胞的生長和抗體分泌功能。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）采用高特異性抗原包被微孔板，通過酶標二抗與雜交瘤上清液中的抗體結(jié)合，顯色反應定量檢測抗體分泌水平，靈敏度可達pg級?？贵w分泌檢測方法免疫熒光細胞染色利用熒光標記的抗原與細胞表面或胞內(nèi)抗體結(jié)合，通過流式細胞術或共聚焦顯微鏡直接觀察抗體分泌細胞的分布及強度。免疫印跡法（WesternBlot）將雜交瘤上清液中的抗體與目標抗原進行電泳分離后轉(zhuǎn)膜，通過化學發(fā)光法檢測抗體與抗原的特異性結(jié)合能力。陽性克隆初篩有限稀釋法克隆化將初篩陽性孔細胞進行梯度稀釋至0.5-1個細胞/孔，通過統(tǒng)計學方法確保單克隆性，避免多克隆競爭導致的抗體特性丟失。交叉反應性測試采用相關抗原家族蛋白或組織切片進行抗體特異性驗證，排除與非目標抗原結(jié)合的假陽性克隆。亞克隆穩(wěn)定性評估對候選克隆進行至少三輪亞克隆培養(yǎng)，檢測各代次細胞抗體分泌的一致性，排除遺傳不穩(wěn)定的克隆株。PART05克隆與生產(chǎn)有限稀釋克隆化通過有限稀釋法將雜交瘤細胞稀釋至每孔0.5-1個細胞，確保單克隆性，避免多克隆競爭干擾抗體特異性。單細胞分離技術采用條件培養(yǎng)基或飼養(yǎng)層細胞提供生長因子支持，提高低密度細胞的存活率與增殖能力?？寺⌒蕛?yōu)化通過ELISA或流式細胞術檢測上清液抗體滴度，篩選高表達克隆并逐步擴大培養(yǎng)規(guī)模。克隆篩選與擴增細胞株穩(wěn)定性驗證遺傳標志物監(jiān)測通過STR分析或核型檢測確認細胞株無交叉污染或遺傳漂變，維持單克隆源性。凍存復蘇性能評估驗證細胞株在液氮凍存后復蘇的存活率、生長曲線及抗體分泌能力，排除凍存損傷影響。長期傳代穩(wěn)定性測試連續(xù)傳代30代以上，定期檢測抗體產(chǎn)量、親和力及遺傳穩(wěn)定性，確保生產(chǎn)一致性。體外培養(yǎng)流程01采用基礎培養(yǎng)基配合葡萄糖/谷氨酰胺動態(tài)補料，平衡細胞生長與抗體表達效率。優(yōu)化pH（7.0-7.4）、溶氧（30%-60%）、溫度（36.5-37.5℃）等參數(shù)，最大化細胞密度和抗體產(chǎn)量。使用化學成分明確的無血清培養(yǎng)基降低批次差異，避免動物源性成分引入外源風險。0203分批補料培養(yǎng)策略生物反應器參數(shù)控制無血清培養(yǎng)基應用PART06純化與鑒定抗體分離技術疏水相互作用層析基于抗體疏水性的差異，在高鹽條件下吸附至疏水介質(zhì)，低鹽洗脫，常用于分離結(jié)構(gòu)相似但疏水性不同的抗體變體。離子交換層析根據(jù)抗體表面電荷差異，通過調(diào)整pH和鹽濃度梯度分離不同電荷特性的抗體組分，適用于去除宿主細胞蛋白和DNA殘留。親和層析法利用抗原-抗體特異性結(jié)合原理，通過固定化抗原或ProteinA/G層析柱選擇性捕獲目標抗體，實現(xiàn)高效分離。洗脫后需進行緩沖液置換以去除雜質(zhì)。01SDS電泳通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳評估抗體純度，觀察單一條帶（約150kDa非還原條件或50kDa還原條件）確認無降解或聚合。高效液相色譜（HPLC）采用尺寸排阻色譜（SEC-HPLC）檢測聚集體和片段，反相色譜（RP-HPLC）分析疏水性雜質(zhì)，純度需達95%以上。紫外分光光度法通過280nm吸光度測定抗體濃度，需校正核酸和蛋白污染的影響，計算公式為濃度（mg/mL）=（A280×稀釋倍數(shù)）/消光系數(shù)。純度與濃度分析0203功能驗證測試0