免疫學(xué)抗體檢測操作流程###一、概述

免疫學(xué)抗體檢測是利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，通過檢測樣本中目標(biāo)抗體的存在或濃度，用于疾病診斷、疾病監(jiān)測、生物研發(fā)等領(lǐng)域的實驗技術(shù)。本流程規(guī)范了從樣本準(zhǔn)備到結(jié)果分析的全過程，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

###二、檢測準(zhǔn)備

####（一）試劑與耗材準(zhǔn)備

1.抗原抗體試劑盒（根據(jù)檢測目標(biāo)選擇）

-包含標(biāo)準(zhǔn)品、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品等

-檢查試劑盒有效期及儲存條件是否合格

2.儀器設(shè)備

-酶標(biāo)儀、化學(xué)發(fā)光檢測儀或熒光顯微鏡等

-離心機、恒溫箱、移液器等

3.耗材

-微孔板、吸頭、樣本管、洗滌液、封閉液等

####（二）樣本要求

1.樣本類型

-血清、血漿、組織液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等

2.樣本采集規(guī)范

-避免溶血、脂血干擾

-低溫保存（如4℃或-20℃）

3.樣本預(yù)處理

-離心去除雜質(zhì)

-檢查樣本無沉淀或渾濁

###三、操作步驟

####（一）樣本處理

1.樣本稀釋

-根據(jù)試劑盒說明進行樣本稀釋

-使用無菌水或緩沖液調(diào)節(jié)濃度

2.預(yù)處理

-加入蛋白酶K等試劑去除內(nèi)源性酶干擾

####（二）檢測流程

1.**包被**

-將抗原包被于微孔板表面

-4℃孵育過夜或37℃溫育2小時

2.**封閉**

-加入封閉液（如BSA）阻斷非特異性結(jié)合

-37℃孵育1小時

3.**孵育樣本**

-加入待測樣本或標(biāo)準(zhǔn)品

-37℃孵育1小時

4.**洗滌**

-使用洗滌液洗滌微孔板3-5次

-吸干殘留液體

5.**加酶標(biāo)抗體**

-加入辣根過氧化物酶（HRP）或熒光標(biāo)記抗體

-37℃孵育30分鐘

6.**底物顯色**

-加入TMB或ECL等底物

-避光反應(yīng)15-30分鐘（根據(jù)試劑盒說明調(diào)整）

####（三）結(jié)果測定

1.酶標(biāo)儀檢測

-設(shè)置波長（如450nm）

-記錄吸光度值或熒光強度

2.熒光檢測儀檢測

-設(shè)定激發(fā)和發(fā)射波長

-讀取熒光信號

###四、質(zhì)量控制

1.**質(zhì)控品檢測**

-每批實驗加入質(zhì)控品

-評估檢測線性范圍和靈敏度

2.**重復(fù)性測試**

-同一樣本重復(fù)測定3次

-CV（變異系數(shù)）應(yīng)低于5%

3.**空白對照**

-使用空白樣本排除背景干擾

###五、結(jié)果分析

1.**定量分析**

-通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算抗體濃度

-單位通常為ng/mL或μg/L

2.**定性分析**

-判斷樣本是否高于或低于閾值

3.**結(jié)果報告**

-記錄檢測值、質(zhì)控范圍及臨床意義

###六、注意事項

1.嚴(yán)格無菌操作，避免污染

2.使用一次性吸頭減少交叉反應(yīng)

3.試劑現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍融

4.實驗結(jié)束后徹底清洗儀器

###七、總結(jié)

免疫學(xué)抗體檢測操作流程需遵循標(biāo)準(zhǔn)化步驟，結(jié)合質(zhì)量控制措施，確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠。操作人員應(yīng)熟悉試劑盒原理并規(guī)范執(zhí)行每一步驟，以提升檢測效率與安全性。

###一、概述（續(xù)）

免疫學(xué)抗體檢測是利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，通過檢測樣本中目標(biāo)抗體的存在或濃度，用于疾病診斷、疾病監(jiān)測、生物研發(fā)等領(lǐng)域的實驗技術(shù)。本流程規(guī)范了從樣本準(zhǔn)備到結(jié)果分析的全過程，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

本流程適用于多種技術(shù)平臺，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）、時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）、膠體金免疫層析法（如快速檢測試紙）等。不同技術(shù)平臺在具體操作細(xì)節(jié)上可能存在差異，但核心原理和流程管理要求一致。熟悉并嚴(yán)格執(zhí)行本流程有助于減少操作誤差，提高檢測批次間的一致性。

###二、檢測準(zhǔn)備（續(xù)）

####（一）試劑與耗材準(zhǔn)備（續(xù)）

1.抗原抗體試劑盒（根據(jù)檢測目標(biāo)選擇）（續(xù)）

-**試劑盒組成詳述**：

-標(biāo)準(zhǔn)品：通常包含多個濃度梯度，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。需檢查其效期、性狀（如溶液是否澄清透明、有無沉淀或變色）。

-校準(zhǔn)品：用于校準(zhǔn)儀器，確保檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。需了解其校準(zhǔn)方式和數(shù)值。

-質(zhì)控品：分高、中、低三個濃度水平，用于監(jiān)控檢測過程的穩(wěn)定性和精密度。質(zhì)控品應(yīng)與樣本一同進行檢測。

-試劑緩沖液：如洗滌液、稀釋液、封閉液等，需確認(rèn)儲存條件（如2-8℃或-20℃）并檢查有效期和開瓶次數(shù)限制。

-包被抗原：已固定在微孔板或其他固相載體上的捕獲抗原。

-酶標(biāo)抗體/熒光標(biāo)記抗體：與目標(biāo)抗體結(jié)合的檢測抗體，帶有酶（如HRP、堿性磷酸酶AP）或熒光基團。

-底物：如TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）用于ELISA，ECL（化學(xué)發(fā)光）液用于CLIA。需注意底物的光敏性，避免光照。

-終止液：用于終止酶促反應(yīng)或熒光反應(yīng)，如ELISA的H?SO?或HCl溶液，CLIA的酸停止液。

-**試劑檢查**：

-開封后檢查是否有霉變、變色或異物。

-檢查試劑瓶標(biāo)簽是否清晰，信息是否完整。

-檢查試劑在運輸和儲存過程中是否處于適宜的溫度范圍。

2.儀器設(shè)備（續(xù)）

-**酶標(biāo)儀/化學(xué)發(fā)光檢測儀**：

-預(yù)熱儀器至少30分鐘。

-使用校準(zhǔn)品進行波長校準(zhǔn)和吸光度/熒光強度零點校準(zhǔn)。

-定期使用標(biāo)準(zhǔn)板進行儀器性能驗證（如空白讀數(shù)、線性范圍、重復(fù)性）。

-**離心機**：

-確認(rèn)轉(zhuǎn)速或相對離心力（RCF）設(shè)置符合要求（如樣本預(yù)處理需3000-5000RPM，離心5-10分鐘）。

-檢查轉(zhuǎn)子是否完好，離心管是否合規(guī)。

-**恒溫箱/水浴鍋**：

-設(shè)置并驗證目標(biāo)溫度（如37℃±0.5℃）。

-檢查內(nèi)部是否清潔，避免交叉污染。

-**移液器**：

-選擇合適的量程和吸頭。

-檢查移液器是否在校準(zhǔn)有效期內(nèi)，定期進行功能檢查（如全量、空吸、連續(xù)吸放）。

-使用前輕彈吸頭混勻液體，避免產(chǎn)生氣泡。

3.耗材（續(xù)）

-**微孔板**：

-檢查板面是否清潔、透明，無劃痕或污漬。

-使用后及時清洗并按規(guī)程處理。

-**吸頭**：

-根據(jù)不同試劑（如buffers、concentratedreagents）選擇不同材質(zhì)（如聚丙烯、聚乙烯）和孔徑的吸頭。

-建議使用一次性無菌吸頭，減少交叉污染風(fēng)險。

-**樣本管/離心管**：

-確保管蓋密封良好。

-根據(jù)樣本量和實驗需求選擇合適規(guī)格。

-**其他**：

-洗滌液：確保濃縮洗滌液在稀釋后無沉淀。

-封閉液：如牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉等，需確保無支原體污染。

-無菌吸水紙/濾紙：用于吸除微孔板中的液體。

####（二）樣本要求（續(xù)）

1.樣本類型（續(xù)）

-**血清**：需使用血清分離管，避免EDTA等抗凝劑干擾。室溫靜置或4000-5000RPM離心10分鐘分離。

-**血漿**：根據(jù)是否抗凝（如肝素、EDTA、檸檬酸鈉）選擇不同處理方法。肝素抗凝血漿需注意避免高脂干擾。EDTA抗凝血漿需進行蛋白沉淀（如用三氯乙酸）或直接使用配套試劑盒。

-**組織液/細(xì)胞培養(yǎng)上清**：收集后需高速離心（如10000RPM,10分鐘）去除細(xì)胞碎片。

-**尿液**：需離心后取上清，避免結(jié)晶或細(xì)胞團塊。

-**唾液/腦脊液等特殊樣本**：需根據(jù)試劑盒說明進行預(yù)處理，如過濾除菌、蛋白沉淀等。

2.樣本采集規(guī)范（續(xù)）

-**采集容器**：使用清潔、干燥、無添加劑的采血管。塑料管比玻璃管更常用，以減少溶血風(fēng)險。

-**抗凝劑選擇**：根據(jù)檢測目的和樣本類型選擇合適的抗凝劑，并記錄在樣本標(biāo)簽上。

-**采集時間與方式**：避免空腹、劇烈運動、飲酒等影響樣本結(jié)果的因素。靜脈血采集通常為采血后立即置于室溫（或按說明書要求）靜置，避免劇烈搖晃。

-**標(biāo)識與記錄**：樣本管需清晰標(biāo)注姓名/編號、采集日期、時間、樣本類型、抗凝劑等信息。建立樣本信息與檢測信息一一對應(yīng)的系統(tǒng)。

3.樣本預(yù)處理（續(xù)）

-**離心**：所有液體樣本在加入試劑前均需離心，轉(zhuǎn)速和時間依據(jù)樣本類型和后續(xù)步驟要求（如血清3000RPM離心10分鐘）。

-**分裝**：對于大量樣本，可將處理后的樣本分裝至小離心管中，減少交叉污染風(fēng)險，并便于儲存。

-**稀釋**：

-嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行樣本稀釋。若樣本濃度過高，需用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液（如PBS、生理鹽水）進行適當(dāng)稀釋。

-稀釋后需充分混勻，確保濃度均勻。

-記錄稀釋倍數(shù)，在結(jié)果計算中予以考慮。

-**過濾**：對于某些方法（如CLIA），可能需要用0.22μm濾膜過濾樣本，去除大分子物質(zhì)或細(xì)胞碎片。

###三、操作步驟（續(xù)）

####（一）樣本處理（續(xù)）

1.樣本稀釋（續(xù)）

-**ELISA示例**：若要求樣本1:10稀釋，則取100μL樣本加入900μL稀釋液中，混勻。

-**CLIA示例**：若要求樣本1:100稀釋，則取10μL樣本加入990μL稀釋液中，混勻。

-**注意**：使用移液器精確吸取和轉(zhuǎn)移液體，混勻時避免產(chǎn)生氣泡。記錄所有樣本的最終稀釋倍數(shù)。

2.預(yù)處理（續(xù)）

-**蛋白酶K處理**：對于某些含有內(nèi)源性酶（如堿性磷酸酶）的樣本或方法，可在稀釋后加入蛋白酶K工作液（按說明書比例混合蛋白酶K和蛋白酶K緩沖液），37℃水浴消化30-60分鐘，并用酸終止反應(yīng)（如加入HCl）。此步驟需在無菌條件下操作。

-**酸化處理**：對于需要去除某些干擾物質(zhì)（如脂蛋白）或改變pH值的方法，可在樣本稀釋前或稀釋后加入酸性溶液（如0.1MHCl），作用一定時間后用堿中和（如NaOH）至中性再進行檢測。

####（二）檢測流程（續(xù)）

1.**包被**（以ELISA為例，其他方法原理類似）

-**微孔板準(zhǔn)備**：從包裝中取出微孔板，短時室溫晾干或用吸水紙輕輕吸干表面水分。如有必要，可用70%乙醇潤洗板面3次，吸干。

-**加入包被液**：根據(jù)說明書，用移液器將含捕獲抗原的包被液加入各微孔（通常100-200μL/孔），設(shè)置空白孔（空白對照）、標(biāo)準(zhǔn)品孔、質(zhì)控品孔和樣本孔。

-**包被條件**：

-溫度：常用4℃過夜孵育（增強結(jié)合親和力），或37℃溫育1-2小時（適用于細(xì)胞培養(yǎng)上清等生物樣本）。

-濕度：建議使用濕盒或密封膜，保持微孔板濕潤。

-**保存**：包被后可置于4℃冰箱保存，通常可穩(wěn)定存放數(shù)周（依據(jù)試劑盒說明）。

2.**封閉**

-**洗滌**：棄去包被液，用洗滌液（如PBST或Tris-T緩沖液）洗滌微孔板3-5次，每次洗滌后用吸水紙在板邊吸除液體，或使用洗板機自動化操作。吸干殘留液體。

-**加入封閉液**：向各孔加入適量封閉液（如5%BSA或1-5%脫脂奶粉溶液），完全覆蓋孔表面。設(shè)置空白孔加入封閉液作為陰性對照。

-**封閉條件**：37℃，避光孵育1小時。此步驟需在封閉液液面下進行，避免蒸發(fā)。

3.**孵育樣本**

-**洗滌**：棄去封閉液，同上洗滌步驟3-5次。

-**加入樣本/標(biāo)準(zhǔn)品**：向各孔加入已預(yù)處理的樣本或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（通常100-200μL/孔）。設(shè)置空白孔加入等量稀釋液或封閉液作為調(diào)零對照。

-**孵育條件**：37℃，避光孵育1小時。確保樣本與包被抗原充分反應(yīng)。

4.**洗滌**

-**重復(fù)洗滌**：棄去液體，用洗滌液洗滌微孔板3-5次。這是去除未結(jié)合抗體和游離試劑的關(guān)鍵步驟，直接影響結(jié)果準(zhǔn)確性。建議使用洗板機確保洗滌徹底。

-**吸干**：最后一次洗滌后，可在吸水紙上拍干，或靜置片刻后吸干，確保孔內(nèi)無游離液體殘留。

5.**加酶標(biāo)抗體/熒光標(biāo)記抗體**

-**加入檢測抗體**：向各孔加入已用稀釋液（如封閉液或說明書推薦的稀釋液）稀釋好的酶標(biāo)抗體或熒光標(biāo)記抗體（按說明書比例稀釋）。設(shè)置空白孔加入等量稀釋液作為調(diào)零對照。

-**孵育條件**：37℃，避光孵育30-60分鐘。此步驟需確?？贵w與樣本中目標(biāo)抗原結(jié)合。

6.**底物顯色/熒光激發(fā)**

-**酶標(biāo)儀（TMB法）**：

-**洗滌**：同上洗滌步驟3-5次。

-**加入底物**：向各孔加入新鮮配制的TMB底物溶液（按說明書比例混合底物液A和液B，現(xiàn)配現(xiàn)用）。設(shè)置空白孔加入等量終止液。

-**孵育與終止**：室溫避光孵育15-30分鐘，期間溶液顏色由藍(lán)變黃。加入終止液（如2MH?SO?），溶液顏色迅速變橙黃色。計時從加入終止液開始。

-**化學(xué)發(fā)光檢測儀（ECL法）**：

-**洗滌**：同上洗滌步驟3-5次。

-**加入ECL液**：向各孔加入新鮮配制的ECL發(fā)光液。設(shè)置空白孔加入等量暗反應(yīng)液（或直接讀數(shù)，依據(jù)儀器和說明書）。

-**反應(yīng)與讀數(shù)**：立即在化學(xué)發(fā)光檢測儀上讀取信號強度。ECL信號不穩(wěn)定，讀數(shù)需在反應(yīng)高峰期完成。通常讀數(shù)窗口為2-10分鐘。

####（三）結(jié)果測定（續(xù)）

1.酶標(biāo)儀檢測（續(xù)）

-**參數(shù)設(shè)置**：根據(jù)試劑盒說明書設(shè)置檢測波長（如TMB法設(shè)450nm，參考波長設(shè)650nm減去空白孔讀數(shù)）。

-**讀數(shù)**：確保酶標(biāo)儀預(yù)熱充分，使用校準(zhǔn)過的吸頭讀取各孔的吸光度值（OD值）。記錄標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本的OD值。

2.熒光檢測儀檢測（續(xù)）

-**參數(shù)設(shè)置**：設(shè)置激發(fā)波長和發(fā)射波長。例如，HRP標(biāo)記物常用激發(fā)485nm/發(fā)射535nm，堿性磷酸酶常用激發(fā)630nm/發(fā)射650nm（具體依試劑而定）。

-**讀數(shù)**：校準(zhǔn)儀器后，依次讀取各孔的熒光強度值。確保在信號衰減前完成讀數(shù)。

###四、質(zhì)量控制（續(xù)）

1.**質(zhì)控品檢測（續(xù)）**

-**頻率**：每批樣本檢測必須包含高、中、低三個濃度水平的質(zhì)控品。

-**評估內(nèi)容**：

-**線性范圍**：質(zhì)控品結(jié)果應(yīng)在試劑盒標(biāo)定的線性范圍內(nèi)。計算質(zhì)控品結(jié)果與預(yù)期值的百分比誤差，各水平通常要求在±20%（低濃度）、±15%（中濃度）、±10%（高濃度）范圍內(nèi)。

-**精密度**：同一樣本重復(fù)測定（如3次）的變異系數(shù)（CV）應(yīng)低于5%。質(zhì)控品的批內(nèi)和批間CV也應(yīng)符合要求。

-**結(jié)果趨勢**：連續(xù)多批質(zhì)控品結(jié)果應(yīng)呈合理趨勢，無突然跳變。

-**異常處理**：若質(zhì)控品結(jié)果超出可接受范圍，應(yīng)立即停止檢測當(dāng)前批次樣本，查找原因（如試劑、儀器、操作問題），待問題解決并重新驗證質(zhì)控品合格后方可繼續(xù)檢測。

2.**重復(fù)性測試（續(xù)）**

-**操作**：選取3-5個樣本（包括高、中、低濃度），每個樣本重復(fù)測定3次。

-**計算**：計算每個樣本的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，進而計算變異系數(shù)（CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均值×100%）。

-**判斷**：CV應(yīng)低于5%，表明檢測過程具有良好的重復(fù)性。若CV偏高，需檢查移液精度、孵育條件一致性、讀數(shù)準(zhǔn)確性等環(huán)節(jié)。

3.**空白對照（續(xù)）**

-**設(shè)置**：設(shè)置不加樣本或加入樣本稀釋液/封閉液的空白對照孔（調(diào)零孔）。

-**目的**：用于扣除背景吸收或熒光信號，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。每次檢測或更換試劑批次時，應(yīng)檢查空白對照值是否在允許范圍內(nèi)（通常OD值<0.1，熒光值<特定閾值）。

###五、結(jié)果分析（續(xù)）

1.**定量分析（續(xù)）**

-**標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制**：以標(biāo)準(zhǔn)品各濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的OD值或熒光強度對數(shù)為縱坐標(biāo)，使用線性回歸方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。要求R2（相關(guān)系數(shù)）>0.99（或依據(jù)試劑盒要求）。

-**樣本值計算**：根據(jù)樣本的OD值或熒光強度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出或通過回歸方程計算出對應(yīng)的樣本濃度。

-**單位與范圍**：結(jié)果通常以ng/mL、μg/mL或AU（ArbitraryUnits）表示。需結(jié)合試劑盒說明書提供的參考范圍進行臨床或科研解讀。

-**稀釋校正**：若樣本進行了稀釋，需將計算出的濃度乘以稀釋倍數(shù)得到最終濃度。

2.**定性分析（續(xù)）**

-**閾值設(shè)定**：根據(jù)說明書或?qū)嶒炇医⒌馁|(zhì)控數(shù)據(jù)，設(shè)定樣本結(jié)果判定的閾值（Cut-off值）。常用方法包括：

-**標(biāo)準(zhǔn)差法**：以均值加減2-3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為閾值。

-**百分位法**：選取質(zhì)控品或大量樣本結(jié)果的特定百分位數(shù)（如97.5%）作為閾值。

-**四分位數(shù)法**：以第75百分位數(shù)（P75）作為閾值。

-**判斷**：樣本結(jié)果高于閾值判為陽性，低于或等于閾值判為陰性。需明確告知閾值的具體數(shù)值或計算方法。

3.**結(jié)果報告（續(xù)）**

-**內(nèi)容**：報告應(yīng)包含樣本標(biāo)識、檢測項目名稱、樣本濃度單位、測定值、標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值、質(zhì)控品結(jié)果及狀態(tài)（合格/不合格）、閾值及樣本結(jié)果（陽性/陰性）、稀釋倍數(shù)（如適用）、檢測日期和操作人員等信息。

-**審核**：報告在發(fā)出前應(yīng)由指定人員審核，確保信息完整、準(zhǔn)確無誤。

-**保存**：電子報告和紙質(zhì)報告均需妥善保存，以備追溯。

###六、注意事項（續(xù)）

1.**無菌操作**：所有涉及樣本和試劑的操作應(yīng)在潔凈臺或生物安全柜中進行，減少微生物污染風(fēng)險。使用無菌吸頭和一次性耗材。

2.**精確移液**：移液器的使用需規(guī)范，避免人為誤差。對于關(guān)鍵步驟（如加入包被液、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本），建議使用高精度移液器。

3.**試劑新鮮度**：底物等需現(xiàn)配現(xiàn)用，嚴(yán)格按照說明書比例和步驟混合。避免反復(fù)凍融，影響試劑活性。

4.**環(huán)境條件**：檢測過程中應(yīng)保持實驗室溫度、濕度和光照穩(wěn)定。溫度波動會影響孵育效果和酶促反應(yīng)速率。

5.**交叉污染**：使用不同樣本需更換吸頭，不同試劑需使用不同移液器或吸頭。微孔板讀數(shù)后應(yīng)徹底清洗或更換讀數(shù)頭。

6.**安全防護**：佩戴合適的個人防護裝備（如手套、實驗服），處理酸堿等試劑時需佩戴護目鏡。廢棄試劑和樣本需按規(guī)范處理。

7.**記錄完整**：詳細(xì)記錄實驗條件、操作過程、儀器參數(shù)、異常情況及處理措施。實驗記錄本或電子記錄系統(tǒng)應(yīng)清晰、連續(xù)、不可篡改。

###七、總結(jié)（續(xù)）

免疫學(xué)抗體檢測操作流程是一個精密且系統(tǒng)化的過程，涉及樣本、試劑、儀器和操作的多個環(huán)節(jié)。嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化流程，加強質(zhì)量控制，是獲得準(zhǔn)確可靠檢測結(jié)果的基礎(chǔ)。操作人員應(yīng)持續(xù)學(xué)習(xí)和培訓(xùn)，熟悉所用方法的原理和關(guān)鍵控制點，不斷提高實驗技能和問題解決能力。通過規(guī)范的流程管理和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟僮鲬B(tài)度，可以最大化免疫學(xué)抗體檢測的實用價值，為科研和臨床工作提供有力支持。

###一、概述

免疫學(xué)抗體檢測是利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，通過檢測樣本中目標(biāo)抗體的存在或濃度，用于疾病診斷、疾病監(jiān)測、生物研發(fā)等領(lǐng)域的實驗技術(shù)。本流程規(guī)范了從樣本準(zhǔn)備到結(jié)果分析的全過程，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

###二、檢測準(zhǔn)備

####（一）試劑與耗材準(zhǔn)備

1.抗原抗體試劑盒（根據(jù)檢測目標(biāo)選擇）

-包含標(biāo)準(zhǔn)品、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品等

-檢查試劑盒有效期及儲存條件是否合格

2.儀器設(shè)備

-酶標(biāo)儀、化學(xué)發(fā)光檢測儀或熒光顯微鏡等

-離心機、恒溫箱、移液器等

3.耗材

-微孔板、吸頭、樣本管、洗滌液、封閉液等

####（二）樣本要求

1.樣本類型

-血清、血漿、組織液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等

2.樣本采集規(guī)范

-避免溶血、脂血干擾

-低溫保存（如4℃或-20℃）

3.樣本預(yù)處理

-離心去除雜質(zhì)

-檢查樣本無沉淀或渾濁

###三、操作步驟

####（一）樣本處理

1.樣本稀釋

-根據(jù)試劑盒說明進行樣本稀釋

-使用無菌水或緩沖液調(diào)節(jié)濃度

2.預(yù)處理

-加入蛋白酶K等試劑去除內(nèi)源性酶干擾

####（二）檢測流程

1.**包被**

-將抗原包被于微孔板表面

-4℃孵育過夜或37℃溫育2小時

2.**封閉**

-加入封閉液（如BSA）阻斷非特異性結(jié)合

-37℃孵育1小時

3.**孵育樣本**

-加入待測樣本或標(biāo)準(zhǔn)品

-37℃孵育1小時

4.**洗滌**

-使用洗滌液洗滌微孔板3-5次

-吸干殘留液體

5.**加酶標(biāo)抗體**

-加入辣根過氧化物酶（HRP）或熒光標(biāo)記抗體

-37℃孵育30分鐘

6.**底物顯色**

-加入TMB或ECL等底物

-避光反應(yīng)15-30分鐘（根據(jù)試劑盒說明調(diào)整）

####（三）結(jié)果測定

1.酶標(biāo)儀檢測

-設(shè)置波長（如450nm）

-記錄吸光度值或熒光強度

2.熒光檢測儀檢測

-設(shè)定激發(fā)和發(fā)射波長

-讀取熒光信號

###四、質(zhì)量控制

1.**質(zhì)控品檢測**

-每批實驗加入質(zhì)控品

-評估檢測線性范圍和靈敏度

2.**重復(fù)性測試**

-同一樣本重復(fù)測定3次

-CV（變異系數(shù)）應(yīng)低于5%

3.**空白對照**

-使用空白樣本排除背景干擾

###五、結(jié)果分析

1.**定量分析**

-通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算抗體濃度

-單位通常為ng/mL或μg/L

2.**定性分析**

-判斷樣本是否高于或低于閾值

3.**結(jié)果報告**

-記錄檢測值、質(zhì)控范圍及臨床意義

###六、注意事項

1.嚴(yán)格無菌操作，避免污染

2.使用一次性吸頭減少交叉反應(yīng)

3.試劑現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍融

4.實驗結(jié)束后徹底清洗儀器

###七、總結(jié)

免疫學(xué)抗體檢測操作流程需遵循標(biāo)準(zhǔn)化步驟，結(jié)合質(zhì)量控制措施，確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠。操作人員應(yīng)熟悉試劑盒原理并規(guī)范執(zhí)行每一步驟，以提升檢測效率與安全性。

###一、概述（續(xù)）

免疫學(xué)抗體檢測是利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，通過檢測樣本中目標(biāo)抗體的存在或濃度，用于疾病診斷、疾病監(jiān)測、生物研發(fā)等領(lǐng)域的實驗技術(shù)。本流程規(guī)范了從樣本準(zhǔn)備到結(jié)果分析的全過程，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

本流程適用于多種技術(shù)平臺，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）、時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）、膠體金免疫層析法（如快速檢測試紙）等。不同技術(shù)平臺在具體操作細(xì)節(jié)上可能存在差異，但核心原理和流程管理要求一致。熟悉并嚴(yán)格執(zhí)行本流程有助于減少操作誤差，提高檢測批次間的一致性。

###二、檢測準(zhǔn)備（續(xù)）

####（一）試劑與耗材準(zhǔn)備（續(xù)）

1.抗原抗體試劑盒（根據(jù)檢測目標(biāo)選擇）（續(xù)）

-**試劑盒組成詳述**：

-標(biāo)準(zhǔn)品：通常包含多個濃度梯度，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。需檢查其效期、性狀（如溶液是否澄清透明、有無沉淀或變色）。

-校準(zhǔn)品：用于校準(zhǔn)儀器，確保檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。需了解其校準(zhǔn)方式和數(shù)值。

-質(zhì)控品：分高、中、低三個濃度水平，用于監(jiān)控檢測過程的穩(wěn)定性和精密度。質(zhì)控品應(yīng)與樣本一同進行檢測。

-試劑緩沖液：如洗滌液、稀釋液、封閉液等，需確認(rèn)儲存條件（如2-8℃或-20℃）并檢查有效期和開瓶次數(shù)限制。

-包被抗原：已固定在微孔板或其他固相載體上的捕獲抗原。

-酶標(biāo)抗體/熒光標(biāo)記抗體：與目標(biāo)抗體結(jié)合的檢測抗體，帶有酶（如HRP、堿性磷酸酶AP）或熒光基團。

-底物：如TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）用于ELISA，ECL（化學(xué)發(fā)光）液用于CLIA。需注意底物的光敏性，避免光照。

-終止液：用于終止酶促反應(yīng)或熒光反應(yīng)，如ELISA的H?SO?或HCl溶液，CLIA的酸停止液。

-**試劑檢查**：

-開封后檢查是否有霉變、變色或異物。

-檢查試劑瓶標(biāo)簽是否清晰，信息是否完整。

-檢查試劑在運輸和儲存過程中是否處于適宜的溫度范圍。

2.儀器設(shè)備（續(xù)）

-**酶標(biāo)儀/化學(xué)發(fā)光檢測儀**：

-預(yù)熱儀器至少30分鐘。

-使用校準(zhǔn)品進行波長校準(zhǔn)和吸光度/熒光強度零點校準(zhǔn)。

-定期使用標(biāo)準(zhǔn)板進行儀器性能驗證（如空白讀數(shù)、線性范圍、重復(fù)性）。

-**離心機**：

-確認(rèn)轉(zhuǎn)速或相對離心力（RCF）設(shè)置符合要求（如樣本預(yù)處理需3000-5000RPM，離心5-10分鐘）。

-檢查轉(zhuǎn)子是否完好，離心管是否合規(guī)。

-**恒溫箱/水浴鍋**：

-設(shè)置并驗證目標(biāo)溫度（如37℃±0.5℃）。

-檢查內(nèi)部是否清潔，避免交叉污染。

-**移液器**：

-選擇合適的量程和吸頭。

-檢查移液器是否在校準(zhǔn)有效期內(nèi)，定期進行功能檢查（如全量、空吸、連續(xù)吸放）。

-使用前輕彈吸頭混勻液體，避免產(chǎn)生氣泡。

3.耗材（續(xù)）

-**微孔板**：

-檢查板面是否清潔、透明，無劃痕或污漬。

-使用后及時清洗并按規(guī)程處理。

-**吸頭**：

-根據(jù)不同試劑（如buffers、concentratedreagents）選擇不同材質(zhì)（如聚丙烯、聚乙烯）和孔徑的吸頭。

-建議使用一次性無菌吸頭，減少交叉污染風(fēng)險。

-**樣本管/離心管**：

-確保管蓋密封良好。

-根據(jù)樣本量和實驗需求選擇合適規(guī)格。

-**其他**：

-洗滌液：確保濃縮洗滌液在稀釋后無沉淀。

-封閉液：如牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉等，需確保無支原體污染。

-無菌吸水紙/濾紙：用于吸除微孔板中的液體。

####（二）樣本要求（續(xù)）

1.樣本類型（續(xù)）

-**血清**：需使用血清分離管，避免EDTA等抗凝劑干擾。室溫靜置或4000-5000RPM離心10分鐘分離。

-**血漿**：根據(jù)是否抗凝（如肝素、EDTA、檸檬酸鈉）選擇不同處理方法。肝素抗凝血漿需注意避免高脂干擾。EDTA抗凝血漿需進行蛋白沉淀（如用三氯乙酸）或直接使用配套試劑盒。

-**組織液/細(xì)胞培養(yǎng)上清**：收集后需高速離心（如10000RPM,10分鐘）去除細(xì)胞碎片。

-**尿液**：需離心后取上清，避免結(jié)晶或細(xì)胞團塊。

-**唾液/腦脊液等特殊樣本**：需根據(jù)試劑盒說明進行預(yù)處理，如過濾除菌、蛋白沉淀等。

2.樣本采集規(guī)范（續(xù)）

-**采集容器**：使用清潔、干燥、無添加劑的采血管。塑料管比玻璃管更常用，以減少溶血風(fēng)險。

-**抗凝劑選擇**：根據(jù)檢測目的和樣本類型選擇合適的抗凝劑，并記錄在樣本標(biāo)簽上。

-**采集時間與方式**：避免空腹、劇烈運動、飲酒等影響樣本結(jié)果的因素。靜脈血采集通常為采血后立即置于室溫（或按說明書要求）靜置，避免劇烈搖晃。

-**標(biāo)識與記錄**：樣本管需清晰標(biāo)注姓名/編號、采集日期、時間、樣本類型、抗凝劑等信息。建立樣本信息與檢測信息一一對應(yīng)的系統(tǒng)。

3.樣本預(yù)處理（續(xù)）

-**離心**：所有液體樣本在加入試劑前均需離心，轉(zhuǎn)速和時間依據(jù)樣本類型和后續(xù)步驟要求（如血清3000RPM離心10分鐘）。

-**分裝**：對于大量樣本，可將處理后的樣本分裝至小離心管中，減少交叉污染風(fēng)險，并便于儲存。

-**稀釋**：

-嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行樣本稀釋。若樣本濃度過高，需用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液（如PBS、生理鹽水）進行適當(dāng)稀釋。

-稀釋后需充分混勻，確保濃度均勻。

-記錄稀釋倍數(shù)，在結(jié)果計算中予以考慮。

-**過濾**：對于某些方法（如CLIA），可能需要用0.22μm濾膜過濾樣本，去除大分子物質(zhì)或細(xì)胞碎片。

###三、操作步驟（續(xù)）

####（一）樣本處理（續(xù)）

1.樣本稀釋（續(xù)）

-**ELISA示例**：若要求樣本1:10稀釋，則取100μL樣本加入900μL稀釋液中，混勻。

-**CLIA示例**：若要求樣本1:100稀釋，則取10μL樣本加入990μL稀釋液中，混勻。

-**注意**：使用移液器精確吸取和轉(zhuǎn)移液體，混勻時避免產(chǎn)生氣泡。記錄所有樣本的最終稀釋倍數(shù)。

2.預(yù)處理（續(xù)）

-**蛋白酶K處理**：對于某些含有內(nèi)源性酶（如堿性磷酸酶）的樣本或方法，可在稀釋后加入蛋白酶K工作液（按說明書比例混合蛋白酶K和蛋白酶K緩沖液），37℃水浴消化30-60分鐘，并用酸終止反應(yīng)（如加入HCl）。此步驟需在無菌條件下操作。

-**酸化處理**：對于需要去除某些干擾物質(zhì)（如脂蛋白）或改變pH值的方法，可在樣本稀釋前或稀釋后加入酸性溶液（如0.1MHCl），作用一定時間后用堿中和（如NaOH）至中性再進行檢測。

####（二）檢測流程（續(xù)）

1.**包被**（以ELISA為例，其他方法原理類似）

-**微孔板準(zhǔn)備**：從包裝中取出微孔板，短時室溫晾干或用吸水紙輕輕吸干表面水分。如有必要，可用70%乙醇潤洗板面3次，吸干。

-**加入包被液**：根據(jù)說明書，用移液器將含捕獲抗原的包被液加入各微孔（通常100-200μL/孔），設(shè)置空白孔（空白對照）、標(biāo)準(zhǔn)品孔、質(zhì)控品孔和樣本孔。

-**包被條件**：

-溫度：常用4℃過夜孵育（增強結(jié)合親和力），或37℃溫育1-2小時（適用于細(xì)胞培養(yǎng)上清等生物樣本）。

-濕度：建議使用濕盒或密封膜，保持微孔板濕潤。

-**保存**：包被后可置于4℃冰箱保存，通?？煞€(wěn)定存放數(shù)周（依據(jù)試劑盒說明）。

2.**封閉**

-**洗滌**：棄去包被液，用洗滌液（如PBST或Tris-T緩沖液）洗滌微孔板3-5次，每次洗滌后用吸水紙在板邊吸除液體，或使用洗板機自動化操作。吸干殘留液體。

-**加入封閉液**：向各孔加入適量封閉液（如5%BSA或1-5%脫脂奶粉溶液），完全覆蓋孔表面。設(shè)置空白孔加入封閉液作為陰性對照。

-**封閉條件**：37℃，避光孵育1小時。此步驟需在封閉液液面下進行，避免蒸發(fā)。

3.**孵育樣本**

-**洗滌**：棄去封閉液，同上洗滌步驟3-5次。

-**加入樣本/標(biāo)準(zhǔn)品**：向各孔加入已預(yù)處理的樣本或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（通常100-200μL/孔）。設(shè)置空白孔加入等量稀釋液或封閉液作為調(diào)零對照。

-**孵育條件**：37℃，避光孵育1小時。確保樣本與包被抗原充分反應(yīng)。

4.**洗滌**

-**重復(fù)洗滌**：棄去液體，用洗滌液洗滌微孔板3-5次。這是去除未結(jié)合抗體和游離試劑的關(guān)鍵步驟，直接影響結(jié)果準(zhǔn)確性。建議使用洗板機確保洗滌徹底。

-**吸干**：最后一次洗滌后，可在吸水紙上拍干，或靜置片刻后吸干，確保孔內(nèi)無游離液體殘留。

5.**加酶標(biāo)抗體/熒光標(biāo)記抗體**

-**加入檢測抗體**：向各孔加入已用稀釋液（如封閉液或說明書推薦的稀釋液）稀釋好的酶標(biāo)抗體或熒光標(biāo)記抗體（按說明書比例稀釋）。設(shè)置空白孔加入等量稀釋液作為調(diào)零對照。

-**孵育條件**：37℃，避光孵育30-60分鐘。此步驟需確?？贵w與樣本中目標(biāo)抗原結(jié)合。

6.**底物顯色/熒光激發(fā)**

-**酶標(biāo)儀（TMB法）**：

-**洗滌**：同上洗滌步驟3-5次。

-**加入底物**：向各孔加入新鮮配制的TMB底物溶液（按說明書比例混合底物液A和液B，現(xiàn)配現(xiàn)用）。設(shè)置空白孔加入等量終止液。

-**孵育與終止**：室溫避光孵育15-30分鐘，期間溶液顏色由藍(lán)變黃。加入終止液（如2MH?SO?），溶液顏色迅速變橙黃色。計時從加入終止液開始。

-**化學(xué)發(fā)光檢測儀（ECL法）**：

-**洗滌**：同上洗滌步驟3-5次。

-**加入ECL液**：向各孔加入新鮮配制的ECL發(fā)光液。設(shè)置空白孔加入等量暗反應(yīng)液（或直接讀數(shù)，依據(jù)儀器和說明書）。

-**反應(yīng)與讀數(shù)**：立即在化學(xué)發(fā)光檢測儀上讀取信號強度。ECL信號不穩(wěn)定，讀數(shù)需在反應(yīng)高峰期完成。通常讀數(shù)窗口為2-10分鐘。

####（三）結(jié)果測定（續(xù)）

1.酶標(biāo)儀檢測（續(xù)）

-**參數(shù)設(shè)置**：根據(jù)試劑盒說明書設(shè)置檢測波長（如TMB法設(shè)450nm，參考波長設(shè)650nm減去空白孔讀數(shù)）。

-**讀數(shù)**：確保酶標(biāo)儀預(yù)熱充分，使用校準(zhǔn)過的吸頭讀取各孔的吸光度值（OD值）。記錄標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本的OD值。

2.熒光檢測儀檢測（續(xù)）

-**參數(shù)設(shè)置**：設(shè)置激發(fā)波長和發(fā)射波長。例如，HRP標(biāo)記物常用激發(fā)485nm/發(fā)射535nm，堿性磷酸酶常用激發(fā)630nm/發(fā)射650nm（具體依試劑而定）。

-**讀數(shù)**：校準(zhǔn)儀器后，依次讀取各孔的熒光強度值。確保在信號衰減前完成讀數(shù)。

###四、質(zhì)量控制（續(xù)）

1.**質(zhì)控品檢測（續(xù)）**

-**頻率**：每批樣本檢測必須包含高、中、低三個濃度水平的質(zhì)控品。

-**評估內(nèi)容**：

-**線性范圍**：質(zhì)控品結(jié)果應(yīng)在試劑盒標(biāo)定的線性范圍內(nèi)。計算質(zhì)控品結(jié)果與預(yù)期值的百分比誤差，各水平通常要求在±20%（低濃度）、±15%（中濃度）、±10%（高濃度）范圍內(nèi)。

-**精密度**：同一樣本重復(fù)測定（如3次）的變異系數(shù)（CV）應(yīng)低于5%。質(zhì)控品的批內(nèi)和批間CV也應(yīng)符合要求。

-**結(jié)果趨勢**：連續(xù)多批質(zhì)控品結(jié)果應(yīng)呈合理趨勢，無突然跳變。

-**異常處理**：若質(zhì)控品結(jié)果超出可接受范圍，應(yīng)立即停止檢測當(dāng)前批次樣本，查找原因（如試劑、儀器、操作問題），待問題解決并重新驗證質(zhì)控品合格后方可繼續(xù)檢測。

2.**重復(fù)性測試（續(xù)）**

-**操作**：選取3-5個樣本（包括高、中、低濃度），每個樣本重復(fù)測定3次。

-**計算**：計算每個樣本的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，進而計算變異系數(shù)（CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均值×100%）。

-**判斷**：CV應(yīng)低于5%，表明檢測