沉降菌標準檢測操作流程及指南一、引言沉降菌檢測通過自然沉降法收集空氣中的活微生物粒子，經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)菌落數(shù)，以此評估環(huán)境微生物污染程度，是制藥、食品加工、醫(yī)療器械、潔凈實驗室等領(lǐng)域驗證環(huán)境合規(guī)性的核心手段。其結(jié)果直接反映潔凈環(huán)境對微生物的控制能力，關(guān)乎產(chǎn)品質(zhì)量與生產(chǎn)安全。二、檢測前準備（一）儀器與材料準備1.培養(yǎng)基：根據(jù)檢測目標選擇培養(yǎng)基（如胰酪大豆胨瓊脂TSA用于細菌，沙氏葡萄糖瓊脂SDA用于真菌），經(jīng)121℃高壓滅菌15-20分鐘，冷卻至45-50℃?zhèn)溆茫ū苊饽袒驙I養(yǎng)成分破壞）。2.培養(yǎng)皿：采用直徑90mm的無菌一次性培養(yǎng)皿（或重復(fù)使用的玻璃培養(yǎng)皿，需經(jīng)干熱滅菌160℃/2小時或濕熱滅菌后烘干）。3.輔助設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱（精度±1℃）、無菌采樣記錄單、記號筆、無菌鑷子（或手套）、壓差計、溫濕度計。（二）環(huán)境要求1.潔凈度穩(wěn)定：檢測需在環(huán)境穩(wěn)定運行后進行（如潔凈室自凈≥30分鐘、生產(chǎn)設(shè)備停運且清潔后），避免人員密集操作或物料搬運干擾。2.溫濕度與壓差：環(huán)境溫濕度需符合生產(chǎn)要求（如制藥潔凈室溫度20-24℃、濕度45-65%），靜壓差維持設(shè)計值（如潔凈區(qū)對非潔凈區(qū)≥10Pa），避免氣流紊亂影響沉降效果。（三）人員要求檢測人員需經(jīng)微生物操作培訓(xùn)，穿戴潔凈服、口罩、手套（必要時戴無菌手套），進入檢測區(qū)域前需風淋/手消毒，操作過程中避免說話、大幅度動作，防止引入額外微生物。三、標準操作流程（一）采樣點布置1.依據(jù)標準：參考《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》（GB/T____-2010）或行業(yè)規(guī)范（如GMP附錄、ISO____），根據(jù)環(huán)境面積、功能分區(qū)確定采樣點數(shù)量（例：面積≤30㎡的潔凈室設(shè)5個點，采用對角線或棋盤式分布，關(guān)鍵區(qū)域如操作臺上方需增設(shè)）。2.位置要求：采樣點距地面0.8-1.5m（與操作高度一致），距墻面≥0.5m，避開回風口、設(shè)備排氣口等氣流擾動區(qū)域。（二）采樣操作1.時間選擇：優(yōu)先在生產(chǎn)前（環(huán)境未受生產(chǎn)活動污染）或生產(chǎn)間歇期進行，若需監(jiān)測生產(chǎn)過程，需確保操作穩(wěn)定后采樣。2.暴露過程：用無菌鑷子取出培養(yǎng)皿，在采樣點上方輕輕打開皿蓋（避免抖動或快速移動），使培養(yǎng)基表面暴露于空氣中，同時記錄暴露起始時間。暴露時間依據(jù)標準或需求設(shè)定：常規(guī)監(jiān)測推薦30分鐘（菌落數(shù)適中便于計數(shù)），特殊場景（如高潔凈度環(huán)境）可延長至4小時，但需避免培養(yǎng)基脫水（可加蓋無菌保濕罩或縮短時間）。暴露結(jié)束后，立即用無菌操作蓋好皿蓋，標記采樣點編號、日期、時間。（三）培養(yǎng)與計數(shù)1.培養(yǎng)條件：細菌培養(yǎng)：將TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)皿置于30-35℃恒溫箱，培養(yǎng)48±2小時；真菌培養(yǎng)：將SDA培養(yǎng)基培養(yǎng)皿置于20-25℃恒溫箱，培養(yǎng)72±3小時。若需區(qū)分霉菌與酵母菌，可在SDA培養(yǎng)基中加入氯霉素（終濃度50μg/mL）抑制細菌生長。2.菌落計數(shù)：培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)皿，在菌落計數(shù)器或自然光下觀察，記錄每個培養(yǎng)皿的菌落總數(shù)（包括細菌、真菌菌落，形態(tài)差異明顯時可分別計數(shù)）。計數(shù)規(guī)則：若菌落數(shù)≤300，直接計數(shù)；若菌落數(shù)>300或存在重疊難以區(qū)分，需重新采樣（縮短暴露時間或調(diào)整采樣點）；若菌落數(shù)<10，可記錄實際數(shù)量并備注“低菌負荷”。四、結(jié)果判定與處理（一）合格判定依據(jù)行業(yè)標準判定結(jié)果：制藥行業(yè)（GMP）：A級潔凈區(qū)（ISO5級）沉降菌≤1CFU/4小時（暴露4小時），B級（ISO7級）≤10CFU/4小時，C級（ISO8級）≤50CFU/4小時，D級（ISO9級）≤100CFU/4小時（暴露時間可按比例調(diào)整，如30分鐘暴露則結(jié)果需×8）。食品行業(yè)：參考《食品安全國家標準食品生產(chǎn)通用衛(wèi)生規(guī)范》（GB____），潔凈加工區(qū)沉降菌通?！?0CFU/30分鐘。（二）超標處理若結(jié)果超標，需：1.立即復(fù)查采樣過程（培養(yǎng)皿滅菌、操作規(guī)范性），排除人為誤差；2.分析環(huán)境因素：檢查清潔消毒效果、氣流組織、人員/物料帶入污染等；3.采取整改措施（如加強清潔、更換高效過濾器、優(yōu)化人員操作），待環(huán)境恢復(fù)后重新采樣，直至結(jié)果合格。五、注意事項與常見問題（一）關(guān)鍵注意事項1.無菌操作：培養(yǎng)皿開啟、蓋合過程需在無菌狀態(tài)下進行，皿蓋應(yīng)倒扣在無菌墊上，避免接觸污染。2.培養(yǎng)基質(zhì)量：滅菌后需檢查培養(yǎng)基凝固狀態(tài)，避免氣泡或干裂；使用前需做無菌性驗證（取部分培養(yǎng)基培養(yǎng)，無菌落生長則合格）。3.環(huán)境干擾：采樣時禁止人員在采樣點附近走動、操作，避免氣流擾動導(dǎo)致菌落計數(shù)偏差。（二）常見問題及解決1.無菌落生長：原因：培養(yǎng)基滅菌不徹底、暴露時間過短、環(huán)境過度清潔或培養(yǎng)條件錯誤。解決：重新驗證培養(yǎng)基無菌性，延長暴露時間（如從30分鐘增至2小時），確認培養(yǎng)溫度/時間符合要求。2.菌落數(shù)過多（>300CFU）：原因：暴露時間過長、環(huán)境污染嚴重、采樣點布置不合理。解決：縮短暴露時間（如改為15分鐘），排查環(huán)境污染源（如設(shè)備泄漏、人員未按規(guī)程操作），重新規(guī)劃采樣點（避開污染區(qū)）。3.菌落形態(tài)異常：原因：培養(yǎng)基污染（滅菌不徹底）、采樣過程引入雜菌（如人員呼吸、操作不規(guī)范）。解決：嚴格執(zhí)行無菌操作，對可疑培養(yǎng)皿進行革蘭染色或生化鑒定，區(qū)分污染菌與環(huán)境菌，必要時重新采樣。六、附錄：常用標準與術(shù)語標準依據(jù)：GB/T____-2010、ISO____-1（潔凈室微生物監(jiān)測）、GMP附錄《無菌藥品》。術(shù)語解釋：沉降菌：通過重力自然沉降至培養(yǎng)基表面的