演講人：日期:單克隆抗體的生產(chǎn)流程CATALOGUE目錄01抗原制備02動(dòng)物免疫03細(xì)胞融合04雜交瘤篩選05克隆與擴(kuò)增06抗體純化與測試01抗原制備從病原體、細(xì)胞或組織中直接分離目標(biāo)抗原，需通過離心、過濾等技術(shù)去除雜質(zhì)，適用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抗原（如病毒表面蛋白）。抗原來源選擇天然抗原提取利用基因工程將抗原基因轉(zhuǎn)入細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，可規(guī)?；a(chǎn)高純度抗原（如人源化抗體靶點(diǎn)）。重組抗原表達(dá)通過化學(xué)合成短肽鏈模擬抗原表位，適用于線性表位研究或疫苗開發(fā)，但需驗(yàn)證其空間構(gòu)象的免疫原性。合成多肽抗原采用親和層析（如His標(biāo)簽純化）、離子交換層析或凝膠過濾層析，根據(jù)抗原特性分離目標(biāo)蛋白，純度需達(dá)90%以上。層析技術(shù)通過差速離心去除細(xì)胞碎片，再經(jīng)透析去除小分子雜質(zhì)，常用于病毒顆?；虼蠓肿訌?fù)合物的純化。超速離心與透析結(jié)合SDS或雙向電泳分離抗原，切膠回收目標(biāo)條帶，適用于微量抗原的制備。電泳輔助純化抗原純化流程佐劑應(yīng)用方法弗氏佐劑分為完全弗氏佐劑（含滅活分枝桿菌）和不完全弗氏佐劑（僅礦物油），通過乳化抗原延長免疫刺激，增強(qiáng)B細(xì)胞應(yīng)答。鋁鹽佐劑如TLR激動(dòng)劑（CpG寡核苷酸）或納米顆粒佐劑，可定向激活樹突細(xì)胞，提高抗體效價(jià)和親和力。氫氧化鋁或磷酸鋁吸附抗原，促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞攝取，適用于人用疫苗的常規(guī)免疫方案。新型佐劑開發(fā)02動(dòng)物免疫小鼠模型大鼠模型最常用的動(dòng)物模型，因其免疫系統(tǒng)成熟、成本低且易于操作，常用于雜交瘤技術(shù)中的B細(xì)胞來源。適用于需要更高抗體產(chǎn)量的場景，其脾臟體積較大，可提供更多B細(xì)胞用于融合實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物模型選擇轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如人源化小鼠模型，可直接產(chǎn)生人源抗體，避免后續(xù)抗體人源化改造的復(fù)雜步驟。兔模型適用于某些難以在小鼠中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原，兔單克隆抗體具有更高的親和力和多樣性。免疫方案設(shè)計(jì)抗原制備需純化目標(biāo)抗原，確保其免疫原性，可采用重組蛋白、多肽或滅活病原體等形式。常用弗氏佐劑（完全或不完全）或鋁佐劑，以增強(qiáng)免疫應(yīng)答，提高抗體滴度。通常包括初次免疫、多次加強(qiáng)免疫，間隔2-4周，最終在融合前3天進(jìn)行沖刺免疫以激活B細(xì)胞?？刹捎闷は?、腹腔或淋巴結(jié)注射，不同途徑影響抗原遞呈效率和免疫應(yīng)答強(qiáng)度。佐劑選擇免疫周期注射途徑抗體滴度檢測ELISA法通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)定量檢測血清中特異性抗體水平，評估免疫效果。WesternBlot驗(yàn)證抗體與目標(biāo)抗原的特異性結(jié)合能力，排除非特異性反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)適用于細(xì)胞表面抗原，檢測抗體與活細(xì)胞的結(jié)合活性及親和力。滴度閾值設(shè)定通常要求血清稀釋度≥1:10,000時(shí)仍能檢測到顯著信號(hào)，方可進(jìn)行細(xì)胞融合。03細(xì)胞融合細(xì)胞系選擇與培養(yǎng)選擇缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的骨髓瘤細(xì)胞系（如SP2/0或NS-1），確保其無法通過補(bǔ)救途徑合成DNA，從而在HAT培養(yǎng)基中死亡，僅融合成功的雜交瘤細(xì)胞能存活。骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備細(xì)胞狀態(tài)優(yōu)化通過定期傳代和營養(yǎng)補(bǔ)充（如胎牛血清、谷氨酰胺）維持骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期，保證細(xì)胞融合時(shí)的高活性與增殖能力。無菌處理與滅活嚴(yán)格無菌操作避免污染，必要時(shí)用絲裂霉素C處理骨髓瘤細(xì)胞以阻斷其分裂能力，僅保留融合功能。融合技術(shù)操作010203PEG介導(dǎo)融合法使用聚乙二醇（PEG1500）作為融合劑，通過破壞細(xì)胞膜脂質(zhì)層促進(jìn)B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞膜融合，需精確控制PEG濃度（40-50%）和作用時(shí)間（1-2分鐘）以避免毒性。電融合技術(shù)采用低電壓脈沖（如1-2kV/cm）在交變電場中使細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔，提高融合效率，適用于對PEG敏感的細(xì)胞類型。融合后終止反應(yīng)迅速加入無血清培養(yǎng)基稀釋PEG，離心去除殘余融合劑，減少對細(xì)胞的損傷。HAT培養(yǎng)基篩選通過有限稀釋法或半固體培養(yǎng)基分離單個(gè)雜交瘤細(xì)胞，確保單克隆性，避免抗體分泌能力的丟失或混雜?？寺』囵B(yǎng)穩(wěn)定性檢測連續(xù)傳代3-6個(gè)月評估雜交瘤細(xì)胞染色體穩(wěn)定性及抗體分泌持續(xù)性，淘汰分泌能力下降的克隆。將融合后細(xì)胞置于含次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸苷（T）的培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏HGPRT死亡，B細(xì)胞自然凋亡，僅雜交瘤細(xì)胞存活并增殖。雜交瘤細(xì)胞形成04雜交瘤篩選HAT培養(yǎng)基使用選擇性篩選原理HAT培養(yǎng)基通過氨基蝶呤阻斷DNA合成的主要途徑，迫使細(xì)胞依賴次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的補(bǔ)救合成途徑存活，未成功融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏HGPRT酶而死亡。操作流程優(yōu)化需嚴(yán)格控制培養(yǎng)基中HAT成分的濃度比例（通常為1×10^-4M次黃嘌呤、4×10^-7M氨基蝶呤、1.6×10^-5M胸腺嘧啶核苷），并定期更換培養(yǎng)基以避免代謝產(chǎn)物積累影響雜交瘤生長。培養(yǎng)條件監(jiān)控維持37℃、5%CO2的恒溫恒濕環(huán)境，每日觀察細(xì)胞融合狀態(tài)，融合后7-10天可見雜交瘤細(xì)胞集落形成，需及時(shí)記錄克隆分布密度。特異性抗體檢測ELISA篩選體系采用96孔板包被靶抗原，加入雜交瘤上清液后通過酶標(biāo)二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG）顯色，OD值高于陰性對照3倍以上的孔判定為陽性。流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證交叉反應(yīng)性測試對于細(xì)胞表面抗原特異性抗體，需用表達(dá)靶抗原的活細(xì)胞與雜交瘤上清共孵育，結(jié)合FITC標(biāo)記的二抗進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，排除非特異性結(jié)合克隆。需檢測抗體對同源蛋白家族成員的結(jié)合能力，通過Westernblot或免疫組化評估其特異性，避免選擇多克隆反應(yīng)的雜交瘤。123有限稀釋法亞克隆通過吉姆薩染色確認(rèn)雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目（通常為80-100條），保留同時(shí)具備脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞染色體特征的克隆。染色體核型分析抗體分泌穩(wěn)定性測試連續(xù)傳代20代以上，采用間接ELISA監(jiān)測抗體產(chǎn)量波動(dòng)，選擇產(chǎn)量穩(wěn)定在±15%范圍內(nèi)的克隆株進(jìn)行凍存。將初篩陽性孔細(xì)胞稀釋至0.5個(gè)細(xì)胞/孔，進(jìn)行3輪以上亞克隆確保單克隆性，每次間隔5-7天觀察單克隆生長情況。陽性克隆初步鑒定05克隆與擴(kuò)增有限稀釋克隆法原理與操作流程通過梯度稀釋將雜交瘤細(xì)胞懸液分配到96孔板中，確保每個(gè)孔內(nèi)僅含單個(gè)細(xì)胞，從而獲得單克隆來源的細(xì)胞群。需重復(fù)3次以上稀釋操作以排除假陽性克隆。關(guān)鍵設(shè)備與試劑使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀精確調(diào)整細(xì)胞濃度，培養(yǎng)基需添加HAT（次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶）選擇性成分以抑制非融合細(xì)胞生長。質(zhì)量控制要點(diǎn)顯微鏡下每日觀察孔內(nèi)細(xì)胞形態(tài)和增殖情況，排除多克隆污染，并通過ELISA檢測上清液抗體分泌水平確認(rèn)單克隆性?？寺》€(wěn)定性評估長期傳代穩(wěn)定性測試分子水平驗(yàn)證連續(xù)培養(yǎng)30代以上，定期檢測抗體分泌量、親和力及細(xì)胞遺傳學(xué)特征（如核型分析），確保無分泌能力退化或突變。凍存復(fù)蘇驗(yàn)證將克隆細(xì)胞液氮凍存后復(fù)蘇，比較凍存前后抗體產(chǎn)量和特異性，評估細(xì)胞耐受性及功能恢復(fù)能力。通過RT-PCR擴(kuò)增抗體輕重鏈可變區(qū)基因，測序確認(rèn)克隆來源的唯一性及基因序列穩(wěn)定性。大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生物反應(yīng)器工藝優(yōu)化采用攪拌式或波浪式生物反應(yīng)器，控制溶氧（DO）、pH及溫度參數(shù)，優(yōu)化灌流或批式培養(yǎng)策略以提高抗體滴度（通常目標(biāo)為1-5g/L）。下游收獲與澄清培養(yǎng)終止時(shí)通過離心、深層過濾或切向流過濾（TFF）去除細(xì)胞碎片，收獲上清液進(jìn)入純化環(huán)節(jié)，過程中需監(jiān)測宿主細(xì)胞蛋白（HCP）和DNA殘留量。無血清培養(yǎng)基開發(fā)使用化學(xué)成分明確的無血清培養(yǎng)基替代傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基，降低批次差異和病毒污染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)添加生長因子（如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白）維持細(xì)胞活力。06抗體純化與測試純化方法選擇親和層析法利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，通過固定化抗原或ProteinA/G等配體吸附目標(biāo)抗體，再通過洗脫緩沖液分離純化，適用于高純度單克隆抗體的規(guī)模化生產(chǎn)。01離子交換層析法根據(jù)抗體表面電荷差異，通過調(diào)整緩沖液pH和離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)分離，適合去除宿主細(xì)胞蛋白（HCP）和DNA等雜質(zhì)，常作為親和層析后的精純步驟。疏水相互作用層析基于抗體疏水性的差異進(jìn)行分離，適用于特定條件下（如高鹽濃度）抗體的純化，可有效去除聚集體和降解片段。尺寸排阻層析通過分子大小差異分離抗體與雜質(zhì)，主要用于去除抗體聚集體或片段化產(chǎn)物，但處理量較低，多用于終產(chǎn)品分析。020304抗體濃度測定紫外分光光度法通過測定280nm處吸光度（A280）計(jì)算抗體濃度，利用抗體中色氨酸和酪氨酸的紫外吸收特性，需注意核酸等雜質(zhì)的干擾并校正。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）采用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗體建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過抗原-抗體反應(yīng)定量檢測樣品濃度，靈敏度高但耗時(shí)較長。毛細(xì)管電泳法通過毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）分離抗體并定量，可同時(shí)分析抗體純度和濃度，適用于高精度要求的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。微流控芯片技術(shù)集成化檢測平臺(tái)結(jié)合熒光標(biāo)記或免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)快速、低樣本消耗的濃度測定，適合高通量篩選場景。功能特性驗(yàn)證抗原結(jié)合活性檢測采用表面等離子共振（SPR）或生物膜干涉技術(shù)（BLI）實(shí)時(shí)測定抗體與抗原的結(jié)合動(dòng)力學(xué)（KD值），評估親和力和特異性。糖基化修飾分析使用質(zhì)譜或液相色譜（