*第七章

高效液相色譜分析法7.4.1

影響分離的因素7.4.2分離類型的選擇7.4.3液相色譜的應(yīng)用7.4.4制備型液相色譜第四節(jié)

影響分離的因素與操作條件的選擇Highperformanceliquidchromatograph,HPLC

Factorsinfluencedseparationandchoiceofoperationcondition*7.4.1

影響分離的因素1.影響分離的因素與提高柱效的途徑液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬(wàn)分之一，則在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u較小，可忽略不計(jì)，即：

H=A+Cu

液體的黏度比氣體大100倍，密度為氣體的1000倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。粒度較大時(shí)的LC曲線。*由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色譜中，不可能通過(guò)增加柱溫來(lái)改善傳質(zhì)。分離過(guò)程需要保持恒溫。2.流速流速是調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。*

3.固定相及分離柱

氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。

4.改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。*7.4.2分離類型選擇*7.4.2分離類型選擇*例1.色譜方法選擇實(shí)例——a,b,g,d生物酚分析實(shí)例條件一：

固定相：C18反相柱流動(dòng)相：95%甲醇-水條件二：

固定相：硅膠正相柱流動(dòng)相：正己烷2025/11/134.流動(dòng)相選擇溶劑的溶劑強(qiáng)度參數(shù)和極性是溶劑選擇的重要依據(jù)。液固色譜流動(dòng)相選擇常采用薄層色譜技術(shù)進(jìn)行初步探索。吸附劑含水量是控制吸附劑活性，影響溶質(zhì)保留的重要因素。反相色譜流動(dòng)相條件優(yōu)化（1）流動(dòng)相選擇改變流動(dòng)相溶劑性質(zhì)和組成，這是調(diào)節(jié)k和選擇性α最簡(jiǎn)便、有效的方法。如：采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。反相色譜流動(dòng)相條件優(yōu)化（1）流動(dòng)相選擇

Xe：接受質(zhì)子能力；Xd：給予質(zhì)子能力和靜電力；Xn：偶極矩。I組的Xe值較大，屬質(zhì)子受體溶劑；VII組的Xd值較大，屬質(zhì)子給于體溶劑；V組的Xn值較大，屬偶極作用力溶劑。同組溶劑在分離中具有相似的選擇性，不同組差別較大。反相色譜流動(dòng)相條件優(yōu)化（2）流動(dòng)相pH值流動(dòng)相緩沖溶液pH值對(duì)離子性溶質(zhì)保留有顯著影響，pH值變化可導(dǎo)致k值10倍左右變化，視溶質(zhì)離子化基團(tuán)多少而異。

（3）衍生化技術(shù)通過(guò)樣品組分柱前衍生化可達(dá)到兩個(gè)目的:一是降低溶質(zhì)極性，提高疏水性;二是向溶質(zhì)中引進(jìn)檢測(cè)響應(yīng)，主要是紫外吸收、熒光激發(fā)基團(tuán)，以提高檢測(cè)靈敏度或高選擇性檢測(cè)響應(yīng)。溶質(zhì)柱后衍生化則只有利于提高檢測(cè)靈敏度。2025/11/134.選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積，損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失，酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。*7.4.3HPLC的應(yīng)用

1.環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動(dòng)相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器*2.稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動(dòng)相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC柱壓：70104Pa

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器*3.血漿分析*7.4.4制備型液相色譜

獲得高純物質(zhì)（色譜純）的有效方法。半制備柱（內(nèi)徑8mm，長(zhǎng)度15～30cm），一次制備量0.1～１mg。1.色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷）

對(duì)分析柱：不影響柱效時(shí)的最大進(jìn)樣量；對(duì)制備柱：不影響收集物純度時(shí)的最大進(jìn)樣量；超載：進(jìn)樣量超過(guò)柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。

超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。*2.液相制備色譜的方法（1）主峰可獲得良好分離；使用制備柱，超載提高效率。（2）兩主成分之間的小組分；超載，分離切分使待分離組分成為主成分（富集）后，再次分離制備。

*3.制備型液相色譜

制備型液相色譜：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大，進(jìn)樣量大，采用制備柱，柱后有餾分收集器。

制備柱：內(nèi)徑20～50mm