ICS11.120.10C23PCRidentificationofDendrobiiOfficinalisCaulisIT/CACM1027.104—2018前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 1 25儀器設(shè)備 25.1離心機(jī) 25.2金屬浴 25.3制冰機(jī) 25.4渦旋振蕩器 25.5超純水發(fā)生器（分子生物學(xué)級(jí)別） 25.6高壓滅菌鍋 25.7PCR儀 25.8電泳儀及其附件 25.9凝膠成像儀 25.10核酸蛋白儀 25.11電子天平（感量0.01g） 35.12連續(xù)可調(diào)微量移液槍 35.13低溫冰箱 35.14其他 36試劑和溶液配制 36.1概述 36.2三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）溶液 36.30.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液 36.4前處理緩沖液 36.5CTAB提取緩沖液 36.6脫氧核糖核苷三磷酸dNTP混合液 36.710×PCR緩沖液 36.8不含3,→5,外切酶活性的Taq酶（5U/μL） 46.9鐵皮石斛檢測(cè)用引物對(duì)序列 46.10引物溶液 46.11瓊脂糖（電泳純） 46.12DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 4T/CACM1027.104—20186.1350×TAE電泳緩沖液 46.146×上樣緩沖液 47檢驗(yàn)程序 47.1概述 47.2取樣 47.3粉碎 57.4DNA提取 57.5PCR擴(kuò)增 57.6擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 68結(jié)果判定 68.1熒光染料顯色檢測(cè) 68.2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 69結(jié)果報(bào)告 69.1一般要求 69.2鑒定報(bào)告 6 711廢棄物處理 7附錄A（規(guī)范性附錄）多糖、多淀粉類(lèi)中藥及種子種苗DNA提取方法 8附錄B（資料性附錄）鐵皮石斛鑒定PCR反應(yīng)體系的建立 參考文獻(xiàn) T/CACM1027.104—2018本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》規(guī)定的規(guī)則起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專(zhuān)利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心、浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：袁媛、黃璐琦、馬臨科、蔣超、李文庭、趙玉洋、祝明、趙維良、周駿輝、何雅莉。T/CACM1027.104—20181鐵皮石斛PCR鑒定本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了使用PCR鑒定鐵皮石斛藥材和飲片、種子種苗的通用方法和要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鐵皮石斛藥材和飲片、種子種苗的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1送檢樣品testsample按一定規(guī)則取自某一整體，能反映該整體的相關(guān)信息，可以作為判斷該整體情況的一個(gè)或多個(gè)部3.2DNA提取DNAextraction從測(cè)試樣本中分離出DNA的方法。3.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction；PCR一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，即DNA片段的特異性體外擴(kuò)增過(guò)程，其特異性依賴于與目的DNA片段兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。3.4陽(yáng)性對(duì)照positivecontrol一般使用對(duì)照樣品代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過(guò)程。3.5T/CACM1027.104—20182陰性對(duì)照negativecontrol使用常見(jiàn)偽品藥材代替測(cè)試樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過(guò)程。3.6空白對(duì)照blankcontrol以水代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過(guò)程。3.7對(duì)照樣品standardsample可為鐵皮石斛對(duì)照藥材或（和）為種苗提供比較的相關(guān)材料。4方案根據(jù)鐵皮石斛與其他石斛近緣種核酸序列的差異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)鐵皮石斛鑒定特異性引物。利用兩步十六烷基三甲基溴化銨法（兩步CTAB法）提取樣品DNA，以提取DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物用凝膠電泳的方法進(jìn)行檢測(cè)。僅鐵皮石斛出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，而其他石斛無(wú)條帶。5儀器設(shè)備5.1離心機(jī)離心機(jī)最高速度應(yīng)≥12000r/min。5.2金屬浴金屬浴應(yīng)可放置2.0mL離心管，也可使用水浴鍋替代。5.3制冰機(jī)5.4渦旋振蕩器5.5超純水發(fā)生器（分子生物學(xué)級(jí)別）5.6高壓滅菌鍋5.7PCR儀PCR儀使用前應(yīng)進(jìn)行溫度校準(zhǔn)。5.8電泳儀及其附件附件應(yīng)包括水平電泳槽、制膠器、鯊魚(yú)齒梳等。5.9凝膠成像儀5.10核酸蛋白儀T/CACM1027.104—201835.11電子天平（感量0.01g）5.12連續(xù)可調(diào)微量移液槍至少應(yīng)包括2.5μL、10μL、200μL、1000μL等4種不同規(guī)格，并包括配套一次性吸頭。5.13低溫冰箱溫度可維持在4°C及-20°C。5.14其他6試劑和溶液配制6.1概述除另有規(guī)定外，實(shí)驗(yàn)試劑為不含DNA和DNA酶的分析純或生化試劑；實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682的要求；所配制的試劑均應(yīng)滅菌后保存，并在容器上注明試劑名稱(chēng)、濃度、配制時(shí)間、保存條件、失效日期和配制者姓名；PCR試劑應(yīng)小量分裝保存以減少污染；材料及試劑的保存都應(yīng)有防污染措施。6.2三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）溶液在800mL去離子水中溶解12.1g三羥甲基氨基甲烷（Tris），冷卻至室溫后用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。6.30.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液稱(chēng)量186.1g乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O）溶于800mL去離子水，充分?jǐn)噭?dòng)溶解，冷卻至室溫后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。6.4前處理緩沖液含有2%（2g/100mL）十六烷基三甲基溴化銨（CTAB100mmol/LTris-HCl（pH8.010mmol/LEDTA（pH8.0）。在800mL去離子水中溶解20gCTAB，100mLTris-HCl(1mol/L，pH8.0)，20mLEDTA(0.5mol/L,pH8.0)，溶解后加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。6.5CTAB提取緩沖液含有2%（2g/100mL）CTAB，100mmol/LTris-HCl（pH8.020mmol/LEDTA（pH8.02.5mol/L氯化鈉（NaCl）。在800mL去離子水中溶解20gCTAB，100mLTris-HCl(1mol/L,pH8.0)，40mLEDTA(0.5mol/L,pH8.0)，146.1gNaCl溶解后加滅菌去離子水至900mL，使用氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液調(diào)整pH至8.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。6.6脫氧核糖核苷三磷酸dNTP混合液含有等量dATP、dCTP、dGTP、dTTP，使用時(shí)調(diào)整濃度至10mmol/L。6.710×PCR緩沖液依據(jù)不同類(lèi)型的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶（Taq酶）選擇對(duì)應(yīng)的10×PCR緩沖液。T/CACM1027.104—201846.8不含3’→5’外切酶活性的Taq酶（5U/μL）應(yīng)在-20°C下保存，使用時(shí)置冰上操作。6.9鐵皮石斛檢測(cè)用引物對(duì)序列TPSH-AS1F：5'-CTGCTGAGATAAAATCCACCG-3'。TPSH-AS1R：5'-ATGCACATCCGAGCCTTAAT-3'。6.10引物溶液用無(wú)菌雙蒸水將上述引物溶解至10μmol/L。6.11瓊脂糖（電泳純）6.12DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)選擇可用于397bp目標(biāo)片段定性參照的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，如DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后應(yīng)出現(xiàn)100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp大小的指示條帶。6.1350×TAE電泳緩沖液在800mL去離子水中溶解242gTris，37.2g乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O加入57.1mL的醋酸，充分混勻，加去離子水定容至1L，室溫保存，使用時(shí)用去離子水50倍稀釋。6.146×上樣緩沖液在80mL去離子水中溶解溴酚藍(lán)250mg，二甲苯氰FF250mg，蔗糖40g，加水定容至100mL，分裝。7檢驗(yàn)程序7.1概述為防止交叉污染，收樣、取樣、粉碎、DNA提取、核酸擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)應(yīng)在不同操作間或在同一操作間不同隔離區(qū)域進(jìn)行，進(jìn)入各區(qū)域應(yīng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即樣品制備區(qū)→核酸制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→檢測(cè)區(qū)。7.2取樣7.2.1概述送檢樣品可分成2批，每批可分為同樣的3份，總量不低于100g。收樣時(shí)應(yīng)檢查包裝的完整性，并在樣品袋上貼上標(biāo)簽，填寫(xiě)采集數(shù)據(jù)表。對(duì)商品包裝和送樣說(shuō)明進(jìn)行拍照記錄，照片隨樣品一起備檔。7.2.2藥材和飲片送檢樣品抽樣方法參照《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）藥材和飲片取樣法（通則0211）進(jìn)行取樣。去除藥材和飲片表面附著物，依次使用75%乙醇和無(wú)菌雙蒸水擦拭表面后晾干。T/CACM1027.104—201857.2.3種子種苗送驗(yàn)樣品、試樣的抽取、分取應(yīng)有代表性。在生產(chǎn)基地取樣，送驗(yàn)樣品可以為組織或器官；在加工或銷(xiāo)售地點(diǎn)取樣，送驗(yàn)樣品為種子或種苗。7.3粉碎取測(cè)試樣品置乳缽、勻漿機(jī)或球磨粉碎儀中充分研磨粉碎，必要時(shí)加適宜量液氮研磨。7.4DNA提取稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理的送檢樣品0.05g粉末置2.0mL的微量離心管中，加入已滅菌的前處理緩沖液1000μL、聚乙烯吡咯烷酮40（PVP40）粉末0.02g、β-巰基乙醇10μL，充分振蕩混勻，65℃水浴保溫20min，12000r/min離心10min，棄去上清液；沉淀加入1000μL已高壓滅菌的前處理緩沖液，混勻，再65℃水浴保溫10min，12000r/min離心10min，棄去上清液；重復(fù)此步驟一次；沉淀加入已滅菌的CTAB提取液1000μL、PVP40粉末0.02g、β-巰基乙醇10μL，混勻，65℃水浴保溫30min，結(jié)束后取出冷卻至室溫；加入900μL氯仿-異戊醇（體積比24:1充分振蕩混勻，12000r/min離心10min；轉(zhuǎn)移750μL上清液至另一新的2.0mL的微量離心管中，加入750μL氯仿-異戊醇（體積比24：1），充分振蕩混勻，12000r/min離心10min；轉(zhuǎn)移500μL上清液至另一新的2.0mL的微量離心管中，加入330μL異丙醇溶液，置-20℃放置1h；取出，12000r/min離心10min，棄去上清液，加入70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇500μL漂洗1min，12000r/min離心5min，棄上清；重復(fù)此步驟一次；加入無(wú)水乙醇500μL漂洗1min，12000r/min離心5min，棄去上清液；將具有DNA沉淀的微量離心管水平放置于37℃孵箱30min揮干乙醇，加入100μL滅菌水溶解沉淀，-20℃保存。7.5PCR擴(kuò)增7.5.1概述首次使用本方法時(shí)，應(yīng)校對(duì)PCR儀溫控準(zhǔn)確性，并使用陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照以核對(duì)使用的Taq酶或PCR預(yù)混液的適用性。7.5.2對(duì)照試驗(yàn)PCR檢測(cè)應(yīng)重復(fù)2次，并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照（可選擇金釵石斛DendrobiumnobileLindl.、7.5.3PCR反應(yīng)體系在200μL的PCR管中依次加入10×1μL、引物溶液（含正向和反向引物）各0.25μL、不含3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶1U、模板DNA（10ng～50ng）1μL，用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體積至25μL。將反應(yīng)液振蕩混勻，瞬時(shí)離心。7.5.4PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)將PCR管置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)。設(shè)置反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min，循環(huán)反應(yīng)32次(95℃30s,62℃30s,72℃30s),72℃延伸7min。取出PCR管，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)或置4°C下保存。T/CACM1027.104—201867.6擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)7.6.1熒光染料顯色檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)束后在PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入2μL100×SYBRGreenI染料，混勻后于365nm紫外波長(zhǎng)下檢測(cè)綠色熒光。若PCR產(chǎn)物出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照相同的熒光即為陽(yáng)性結(jié)果，反之為陰性結(jié)果。7.6.2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入5μL6×上樣緩沖液混勻后于GelRed染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。8結(jié)果判定8.1熒光染料顯色檢測(cè)若送檢樣品PCR產(chǎn)物出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照相同的熒光、且空白對(duì)照無(wú)熒光即為陽(yáng)性，否則為陰性。8.2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)若陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)條帶，送檢樣品PCR擴(kuò)增條帶的大小與陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增條帶一致并位于250bp～500bp范圍內(nèi)為陽(yáng)性；否則為陰性。9結(jié)果報(bào)告9.1一般要求檢測(cè)結(jié)果應(yīng)表示為陽(yáng)性“+”或陰性“-”。9.2鑒定報(bào)告樣品經(jīng)檢測(cè)后，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體操作程序和結(jié)果做好詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)記錄，出具檢測(cè)報(bào)告。檢測(cè)報(bào)告至少包含以下內(nèi)容：a）藥材的名稱(chēng)、狀態(tài)和明確的標(biāo)識(shí)；b）檢測(cè)依據(jù)；c）取樣方法與日期；d）儲(chǔ)存條件；e）檢測(cè)開(kāi)始和結(jié)束日期；f）檢測(cè)負(fù)責(zé)人和實(shí)驗(yàn)人員；g）對(duì)照樣品與送檢樣品；h）特定方法取得的結(jié)果；i）檢測(cè)結(jié)論；j）檢測(cè)過(guò)程觀察到的特別情況；k）其它需要報(bào)告的內(nèi)容。T/CACM1027.104—2018710質(zhì)量保證檢測(cè)結(jié)果應(yīng)來(lái)自同一實(shí)驗(yàn)室樣品的兩份測(cè)試樣品。當(dāng)一份測(cè)試樣品的結(jié)果為陽(yáng)性，另一份為陰性時(shí)，要重新測(cè)試?？梢赃m當(dāng)調(diào)整核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中DNA模板量，使兩份試樣得到同樣的結(jié)果。此外，還需要檢測(cè)模板DNA的質(zhì)量，每個(gè)樣品應(yīng)至少制備兩份DNA（提取重復(fù)）必要時(shí)需檢測(cè)模板DNA的質(zhì)量，確保提取的DNA片段大于擴(kuò)增片段。如果經(jīng)過(guò)兩次以上從核酸提取開(kāi)始的重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果不一致，可在測(cè)試報(bào)告中表述該實(shí)驗(yàn)室樣品的測(cè)試結(jié)果為陰性，并注明定量檢測(cè)和定性檢測(cè)方法的檢測(cè)低限。11廢棄物處理檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物，收集后在焚燒爐中焚燒處理，有毒有害廢棄物應(yīng)經(jīng)過(guò)除害再進(jìn)行處理，處理要符合環(huán)保要求。T/CACM1027.104—20188（規(guī)范性附錄）多糖、多淀粉類(lèi)中藥及種子種苗DNA提取方法A.1范圍本方法適用于從富含多糖、淀粉的植源性中藥中快速提取DNA。A.2原理兩步CTAB法：CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑,具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖，而在高離子強(qiáng)度的溶液中與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸的特性。通過(guò)沉淀-提取兩步，能夠去除大部分多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，本方法達(dá)到了提高DNA純度和保證得率的雙重效果。A.3試劑和材料前處理緩沖液：2%（2g/100mL）CTAB，100mmol/LTris-HCl（pH8.010mmol/LEDTA（pH8.0）。CTAB提取緩沖液：2%（2g/100mL）CTAB，100mmol/LTris-HCl（pH8.0），20mmol/LEDTA（pH8.0），2.5mol/LNaCl。A.4儀器恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（及其附件）、球磨粉碎機(jī)、高壓滅菌鍋、不同規(guī)格可調(diào)量程移液槍等。A.5DNA提取步驟DNA提取步驟如下：a）選取待測(cè)樣品粉末0.05g于2.0mL的微量離心管中，加入1000μL已滅菌的前處理緩沖液、0.02gPVP40、10μLβ-巰基乙醇充分振蕩混勻，65℃水浴保溫20min，期間輕搖2次～3次；b）沉淀加入1000μL已高壓滅菌的前處理緩沖液，混勻，再65℃水浴保溫10min，12000r/min離心10min，棄上層清液；重復(fù)此步驟一次；c）取出離心管，冷卻至室溫，12000r/min離心10min，棄上清；d）往沉淀加入1000μL已滅菌的CTAB提取緩沖液、0.02gPVP40、10μLβ-巰基乙醇充分振蕩混勻，65℃水浴30min；離心10min；T/CACM1027.104—20189f）轉(zhuǎn)移上層清液至另一新的2.0mL的微量離心管中，注意不要取到沉淀，加入等體積氯仿-異戊醇（體積比24：1），充分振蕩混勻，12000r/min離心10min；g）轉(zhuǎn)移上層清液至另一新的2.0mL的微量離心管中，注意不要取到沉淀，加入2/3體積的異丙醇溶液，置-20℃放置1h；h）取出，12000r/min離心10min，棄上層清液，加入70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇500μL漂洗1min，12000r/min離心5min，棄上清；i）再加入70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇500μL漂洗1min，12000r/min離心5min，棄上清；加入無(wú)水乙醇500μL漂洗1min，12000r/min離心5min，棄盡上清；j）將具有DNA沉淀的微量離心管水平放置于37℃孵箱30min揮干乙醇，加入100μL滅菌水溶解沉淀，-20℃保存。T/CACM1027.104—2018（資料性附錄）鐵皮石斛鑒定PCR反應(yīng)體系的建立B.1鐵皮石斛及其偽品資料鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimuraetMigo的干燥莖，收載于《中華人民共和國(guó)藥典》。由于鐵皮石斛具有良好的藥用、保健價(jià)值，市場(chǎng)需求量大，價(jià)格昂貴，市場(chǎng)上常出現(xiàn)用石斛屬其他物種魚(yú)目混珠作為“鐵皮石斛”的現(xiàn)象。文獻(xiàn)調(diào)查表明，鐵皮石斛的偽品主要包括齒瓣石斛、重唇石斛、鼓槌石斛、金釵石斛、美花石斛、細(xì)莖石斛、短棒石斛、流蘇石斛等石斛屬近緣物種，其形態(tài)和化學(xué)成分相似，尤其鐵皮石斛的加工制品如楓斗、干條等原植物形態(tài)特征已破壞，主要鑒定點(diǎn)如葉鞘紫斑等性狀特征消失，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和化學(xué)鑒定難以辨別，其他種石斛常偽充鐵皮石斛出現(xiàn)于市售飲片中。近20年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)在中藥鑒定中日益成熟，目前已積累了大量石斛屬DNA序列數(shù)據(jù)，對(duì)鐵皮石斛的DNA分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)時(shí)見(jiàn)報(bào)道。近3年來(lái)為開(kāi)展石斛屬的特異性分子標(biāo)記研究，研究者對(duì)中國(guó)大陸的石斛屬物種進(jìn)行了系統(tǒng)收集并研究其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，表明鐵皮石斛在系統(tǒng)發(fā)育上與常見(jiàn)石斛具有單系性，適合使用DNA分子標(biāo)記的方法進(jìn)行鑒定。據(jù)《中國(guó)植物志》記載，我國(guó)共具有石斛74種2變種，為保證分子鑒定結(jié)果的可靠性，應(yīng)盡可能收集所有石斛屬樣品。本標(biāo)準(zhǔn)起草時(shí)共收集到69種不同種石斛，用于設(shè)計(jì)PCR引物并進(jìn)行特異性PCR鑒定，以確保方法的特異性。收集了安徽、云南、浙江、廣西等主產(chǎn)區(qū)的157鐵皮石斛和市售藥材25批（其中楓斗10批，干條15批）用于測(cè)試鑒定方法的適用性。B.2特異性引物設(shè)計(jì)通過(guò)測(cè)序及從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查找正品鐵皮石斛及石斛屬近緣物種的ITS序列。用BioEdit軟件進(jìn)行序列比較，找到鐵皮石斛單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，設(shè)計(jì)鑒定引物TPSH-AS1F：5'-CTGCTGAGATAAAATCCACCG-3'和TPSH-AS1R：5'-ATGCACATCCGAGCCTTAAT-3'。為增加PCR鑒定的特異性，選擇2個(gè)SNP位點(diǎn)并引入人為錯(cuò)配以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，引物設(shè)計(jì)如圖B.1所示。圖B.1鐵皮石斛特異性PCR鑒定的引物設(shè)計(jì)T/CACM1027.104—2018B.3樣品收集收集了安徽、云南、廣西、浙江等不同產(chǎn)地鐵皮石斛與其混偽品樣本，共73種、351份，其中鐵皮石斛157份。材料經(jīng)中國(guó)科學(xué)院植物研究所金效華博士和安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心和中國(guó)科學(xué)院植物研究所。樣本信息詳見(jiàn)表B.1。表B.1樣品表1Dendrobiumoficinale2D.oficinale3D.oficinale4D.oficinale45D.oficinale46D.moniliforme7D.wilsonii18D.henanense29D.clavatum4D.hookerianum3D.devonianum311D.henryi3D.gratiosissimum2D.capillipes1D.chrysanthum4D.crepidatum6D.falconeri3D.brymerianum3D.harveyanum3D.hancockii2D.pendulum2D.crystallinum2D.hercoglossum1D.christyanum2D.densiflorum7D.fanjingshanense4D.willamsonii8D.salaccense2D.strongylanthum8D.aduncum5D.monticolaSummerh1T/CACM1027.104—2018表B.1（續(xù)）2D.menglaensis1D.exile4D.porphyrochilum4D.acinaciforme3D.sinense6D.bellatulum4D.sino-minutiflorum4D.myakii15D.stuposum1D.okinawense1D.ruckeri2D.hainanensis31D.wangliangii22D.wattii4D.nobile6D.xichouense1D.cucullatum3D.chrysotoxum5D.compactum1D.pulchrum1D.sulcatum1D.moschatum1D.pachyglossum1D.fimbriatum1D.ellipsophyllum1D.heterocarpum1D.senile1D.polyanthum1D.dixanthum3D.cariniferum1D.wardianum1D.pseudotenellum11D.unicum1D.jenkinsii2T/CACM1027.104—2018B.4特異性PCR鑒定方法的建立B.4.1模板DNA提取選取無(wú)霉變的待測(cè)干燥藥材標(biāo)本1g，置于粉碎機(jī)中研磨粉碎至可過(guò)40目篩；將0.05g粉末轉(zhuǎn)移到2.0mL的微量離心管中，加入1000μL已滅菌的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）沉淀液（配方：2%(2g/100mL)CTAB，100mmol/LTris-HClpH8.0，100mmol/LEDTA）、0.02gPVP40、10μLβ-巰基乙醇充分振蕩混勻，65℃水浴1.5h~2h，期間輕搖2次~3次；結(jié)束后取出冷卻至室溫（25℃),12000r/min離心10min，棄上清；沉淀加入1000μL已高壓滅菌的CTAB沉淀液，混勻，再65℃水浴保溫10min，12000r/min離心10min，棄上層清液；重復(fù)此步驟一次；加入1000μL已滅菌的CTAB提取液（配方：2%(2g/100mL)CTAB，100mmol/LTris-HClpH8.0，20mmol/LEDTA，2.5mol/LNaCl）、0.02gPVP40、10μLβ-巰基乙醇充分振蕩混勻，65℃水浴30min，加入900μL氯仿-異戊醇（體積比24∶1充分振蕩混勻，12000r/min離心11）充分振蕩混勻，12000r/min離心10min；取上清，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上；取出，12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70體積分?jǐn)?shù)）乙醇洗滌兩次，37℃揮干乙醇，用適量滅菌水溶解，-20℃保存。另取鐵皮石斛對(duì)照藥材約50mg，同法制成對(duì)照藥材模板DNA溶液。B.4.2對(duì)照PCR的選擇和建立PCR鑒定易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，為防止誤差的產(chǎn)生，PCR鑒定須建立嚴(yán)格的陽(yáng)性、陰性及空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照為經(jīng)過(guò)中國(guó)科學(xué)院植物研究所金效華博士鑒定的正品鐵皮石斛，陰性對(duì)照為非鐵皮石斛的石斛屬近緣物種，空白對(duì)照為無(wú)菌雙蒸水。B.4.3PCR反應(yīng)體系的建立B.4.3.1概述10mmol·L-1dNTPs，0.5），TPSH-AS1F/TPSH-AS1R(10μmol·L-1)5'-CTGCTGAGATAAAATCCACCG-3'和5'-ATGCACATCCGAGCCTTAAT-3'各0.25μl，用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體積。將離心管置PCR儀上，鐵皮石斛鑒定PCR反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性5min，循環(huán)反應(yīng)35次(95℃30s,60℃40s,72℃40s),72℃延伸5min，4℃保溫。取5μL反應(yīng)液經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，接通電源按5V·cm-1恒壓進(jìn)行電泳20min，電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。PCR反應(yīng)各主要參數(shù)均經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的考察。B.4.3.2退火溫度考察分別設(shè)置退火溫度56℃、58℃、60℃、62℃及64℃,結(jié)果表明在58℃~62℃時(shí)，鐵皮石斛正品能擴(kuò)增得到397bp的亮帶，陰性對(duì)照在此范圍內(nèi)均未擴(kuò)增，如圖B.2。為確保PCR鑒定的準(zhǔn)確性，確定PCR退火溫度為62℃。T/CACM1027.104—2018圖B.2退火溫度對(duì)特異性PCR鑒定鐵皮石斛的影響B(tài).4.3.3循環(huán)次數(shù)考察分別選用27、30、33、36和39個(gè)循環(huán)進(jìn)行考察，結(jié)果表明2