2025四川省醫(yī)致遠醫(yī)學(xué)檢驗有限責(zé)任公司基因檢測實驗員招聘2人筆試歷年難易錯考點試卷帶答案解析（第1套）一、單項選擇題下列各題只有一個正確答案，請選出最恰當(dāng)?shù)倪x項（共25題）1、在設(shè)計用于PCR擴增的引物時，下列哪項是必須避免的關(guān)鍵因素？A.引物長度為20個堿基B.引物的GC含量為50%C.兩條引物的3'端存在互補序列D.引物Tm值為60℃2、Sanger測序法（雙脫氧鏈終止法）中，雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）的主要作用是什么？A.為DNA聚合酶提供能量B.作為合成新鏈的唯一底物C.隨機終止DNA鏈的延伸D.提高引物與模板的結(jié)合效率3、根據(jù)我國相關(guān)管理規(guī)定，臨床基因擴增檢驗（如PCR檢測）必須在哪種資質(zhì)的實驗室中進行？A.通過ISO15189認證的實驗室B.獲得臨床基因擴增檢驗實驗室技術(shù)審核合格的實驗室C.具備CNAS認可的醫(yī)學(xué)實驗室D.任何具備PCR儀的醫(yī)學(xué)實驗室4、高通量測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)通常以FASTQ格式存儲，該文件的核心組成部分不包括以下哪一項？A.序列標(biāo)識符（Header）B.核苷酸序列（Sequence）C.序列的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測D.堿基質(zhì)量分數(shù)（QualityScore）5、在實時熒光定量PCR（qPCR）中，SYBRGreenI染料法與TaqMan探針法的根本區(qū)別在于？A.是否需要設(shè)計特異性引物B.熒光信號產(chǎn)生的機制C.對模板DNA的純度要求D.PCR擴增循環(huán)數(shù)的設(shè)定6、在酚-氯仿法提取DNA的過程中，加入氯仿的主要作用是什么？A.使DNA變性沉淀B.降解RNAC.促進水相與有機相分離，并去除脂質(zhì)D.激活DNA聚合酶7、在標(biāo)準PCR反應(yīng)體系中，決定擴增產(chǎn)物特異性的關(guān)鍵成分是？A.dNTPB.Mg2?C.模板DNAD.引物8、與Sanger測序相比，高通量測序（NGS）最顯著的優(yōu)勢是？A.讀長更長B.單次反應(yīng)可并行測序數(shù)百萬個DNA片段C.無需引物即可測序D.僅適用于RNA測序9、在基因檢測實驗中設(shè)置陰性對照的主要目的是？A.驗證目標(biāo)基因是否存在B.確認試劑是否有效C.排除實驗體系污染或非特異性擴增導(dǎo)致的假陽性D.提高檢測靈敏度10、在瓊脂糖凝膠電泳中，判斷未知DNA片段大小的主要依據(jù)是？A.DNA條帶的亮度B.與已知分子量的標(biāo)準DNAMarker的遷移距離比較C.電泳所用的電壓高低D.凝膠染色時間長短11、在標(biāo)準PCR反應(yīng)中，若出現(xiàn)非特異性擴增條帶，最常見的原因是？A.變性溫度過高B.退火溫度過低C.延伸時間過長D.模板DNA濃度過低12、Sanger測序中，測序峰圖在引物結(jié)合位點下游約20-50bp區(qū)域內(nèi)信號質(zhì)量通常較差，其主要原因是？A.DNA聚合酶在此區(qū)域活性降低B.殘存的熒光染料單體產(chǎn)生干擾峰C.模板DNA在此區(qū)域易形成二級結(jié)構(gòu)D.毛細管電泳分離效率下降13、使用酚-氯仿法提取DNA時，加入氯仿的主要作用是？A.裂解細胞膜B.降解RNAC.去除殘留酚并進一步變性蛋白質(zhì)D.沉淀DNA14、在qPCR實驗中，若某樣品的Ct值顯著偏大（如>35），在排除儀器故障后，最應(yīng)優(yōu)先考慮的因素是？A.模板量過低或目標(biāo)基因表達豐度低B.擴增產(chǎn)物濃度過高C.閾值線設(shè)置過低D.反應(yīng)體系中Mg2?濃度過高15、常規(guī)的臨床基因檢測（如無高致病性病原體操作）應(yīng)在何種生物安全等級（BSL）的實驗室中進行？A.BSL-1B.BSL-2C.BSL-3D.BSL-416、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)中，決定擴增產(chǎn)物特異性的關(guān)鍵因素是什么？A.耐熱DNA聚合酶的活性B.模板DNA的濃度C.與靶序列兩端互補的特異性引物D.dNTPs的種類和濃度17、在常規(guī)基因組DNA提取過程中，酚-氯仿抽提法的主要作用是什么？A.裂解細胞膜B.沉淀DNAC.去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)D.降解RNA18、在瓊脂糖凝膠電泳中，核酸分子能夠向陽極遷移的根本原因是什么？A.凝膠孔徑的篩分效應(yīng)B.核酸分子帶有負電荷C.電泳緩沖液的pH值D.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)19、根據(jù)我國實驗室生物安全標(biāo)準，處理已知不會導(dǎo)致健康成人疾病的微生物材料，通常應(yīng)在哪個級別的生物安全實驗室中進行？A.BSL-1B.BSL-2C.BSL-3D.BSL-420、限制性內(nèi)切酶在基因工程中的主要功能是什么？A.連接兩個DNA片段B.合成新的DNA鏈C.在特定位點切割雙鏈DNAD.降解單鏈RNA21、在基因檢測實驗中，以下哪種DNA提取方法屬于經(jīng)典有機溶劑抽提法？A.磁珠法B.離心柱法C.酚-氯仿抽提法D.煮沸裂解法22、PCR擴增過程中出現(xiàn)非特異性條帶，最可能的原因是？A.dNTP濃度過低B.退火溫度過低C.模板DNA濃度過低D.TaqDNA聚合酶失活23、與Sanger測序相比，下一代測序（NGS）技術(shù)的核心優(yōu)勢在于？A.單次讀長更長B.無需引物即可測序C.可實現(xiàn)高通量并行測序D.準確率更高24、進行常規(guī)人類基因組DNA提取與PCR擴增的實驗室，通常應(yīng)達到的生物安全防護等級為？A.BSL-1B.BSL-2C.BSL-3D.BSL-425、瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段的原理主要依據(jù)什么差異？A.DNA堿基組成B.DNA分子所帶電荷種類C.DNA分子大小D.DNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性二、多項選擇題下列各題有多個正確答案，請選出所有正確選項（共15題）26、多重PCR技術(shù)與常規(guī)PCR的主要區(qū)別在于：A.使用的DNA聚合酶不同B.反應(yīng)體系中包含多對引物C.需要更高的退火溫度D.擴增產(chǎn)物必須通過測序鑒定27、高通量測序（NGS）相較于Sanger測序最顯著的優(yōu)勢是：A.單次反應(yīng)成本更低B.能夠一次并行測定大量核酸分子C.測序讀長更長D.不需要PCR預(yù)擴增28、在實時定量PCR實驗中，選擇內(nèi)參基因的主要目的是：A.增加目標(biāo)基因的擴增效率B.校正上樣量及實驗操作誤差C.直接檢測目標(biāo)基因的突變D.替代熒光染料進行信號檢測29、PCR實驗中最常見且主要的污染來源是：A.實驗用水未滅菌B.模板DNA濃度過高C.擴增產(chǎn)物泄漏或開蓋D.引物合成錯誤30、下列關(guān)于SNP（單核苷酸多態(tài)性）的描述，正確的是：A.指基因組中單個堿基的替換、插入或缺失B.通常指長度大于50bp的序列變異C.在人類基因組中發(fā)生頻率低于1%D.與InDel屬于同一種變異類型31、在進行基因組DNA提取實驗時，以下哪些操作或試劑有助于去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)？A.使用酚-氯仿抽提B.加入RNA酶C.加入蛋白酶KD.用75%乙醇洗滌沉淀32、關(guān)于聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）的基本原理，以下說法正確的是？A.PCR依賴于與靶序列兩端互補的特異性引物B.每個循環(huán)包括變性、退火和延伸三個步驟C.TaqDNA聚合酶在95℃時活性最強D.PCR擴增產(chǎn)物的特異性主要由退火溫度決定33、在瓊脂糖凝膠電泳中，影響DNA片段遷移速率的因素包括？A.DNA片段的大小B.瓊脂糖凝膠的濃度C.電泳緩沖液的pH值D.DNA分子的構(gòu)型（如線性、超螺旋）34、以下哪些措施屬于分子生物學(xué)實驗室的生物安全基本規(guī)范？A.實驗區(qū)域與辦公區(qū)域嚴格分區(qū)B.使用帶濾芯的吸頭防止氣溶膠污染C.將實驗廢棄物與生活垃圾混合處理D.定期對超凈工作臺進行紫外滅菌35、關(guān)于DNA在乙醇中沉淀的原理，以下說法正確的是？A.DNA在乙醇中溶解度極低，易形成絮狀沉淀B.加入單價陽離子（如Na?）可中和DNA磷酸基團的負電荷C.必須使用100%無水乙醇才能有效沉淀DNAD.低溫（如-20℃）有助于提高DNA沉淀效率36、在聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）中，以下哪些因素可能影響擴增的特異性和效率？A.引物設(shè)計的特異性B.退火溫度的設(shè)置C.DNA模板的純度D.TaqDNA聚合酶的保真度37、關(guān)于基因測序技術(shù)，以下說法正確的是？A.Sanger測序基于鏈終止法B.高通量測序（NGS）可實現(xiàn)大規(guī)模并行測序C.第三代測序技術(shù)無需PCR擴增D.Illumina平臺測序讀長通常比PacBio更長38、在分子生物學(xué)實驗中，以下哪些操作可有效防止RNA降解？A.使用DEPC處理的水和耗材B.在冰上操作RNA樣本C.戴手套避免RNase污染D.將RNA樣本長期保存于4℃39、關(guān)于質(zhì)粒DNA提取，以下說法正確的是？A.堿裂解法利用高pH使染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性B.質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密可在復(fù)性時優(yōu)先恢復(fù)雙鏈C.酚-氯仿抽提可去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)D.最終洗脫應(yīng)使用低鹽緩沖液或水40、下列哪些屬于基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分？A.向?qū)NA（gRNA）B.Cas9核酸酶C.PAM序列D.DNA連接酶三、判斷題判斷下列說法是否正確（共10題）41、在聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）中，退火溫度的設(shè)定主要取決于引物的長度和堿基組成。A.正確B.錯誤42、Sanger測序法在進行基因檢測時，必須設(shè)置陰性對照以排除污染或非特異性擴增的干擾。A.正確B.錯誤43、基因檢測中使用的DNA樣本若發(fā)生降解，不會影響后續(xù)PCR擴增結(jié)果的可靠性。A.正確B.錯誤44、甲基化特異性PCR（MSP）可用于檢測基因啟動子區(qū)域的CpG島甲基化狀態(tài)。A.正確B.錯誤45、在基因檢測實驗中，使用無RNase的耗材主要是為了防止RNA樣本被降解。A.正確B.錯誤46、在聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）中，退火溫度過高會導(dǎo)致引物無法與模板DNA結(jié)合，從而影響擴增效率。A.正確B.錯誤47、基因測序中的“讀長”（readlength）越長，越有利于基因組的準確組裝。A.正確B.錯誤48、RNA提取過程中必須嚴格防止RNase污染，因為RNase在常規(guī)高壓滅菌條件下仍具有活性。A.正確B.錯誤49、在Sanger測序中，ddNTP的作用是終止DNA鏈的延伸。A.正確B.錯誤50、DNA甲基化通常發(fā)生在CpG島的胞嘧啶上，且與基因表達激活相關(guān)。A.正確B.錯誤

參考答案及解析1.【參考答案】C【解析】引物設(shè)計的核心原則之一是避免引物二聚體的形成，尤其是3'端的互補。因為DNA聚合酶可以從3'端延伸，若兩條引物3'端互補并結(jié)合，會形成引物二聚體，嚴重干擾目標(biāo)片段的擴增，降低PCR效率和特異性。而A、B、D均為常規(guī)設(shè)計范圍內(nèi)的合理參數(shù)[[7]][[9]]。2.【參考答案】C【解析】ddNTP與普通dNTP結(jié)構(gòu)相似，但缺少3'-羥基，一旦被DNA聚合酶摻入到新合成的DNA鏈中，由于無法形成下一個磷酸二酯鍵，導(dǎo)致DNA鏈延伸不可逆地終止。通過在反應(yīng)中加入限量的不同標(biāo)記ddNTP，可產(chǎn)生一系列不同長度的終止片段，經(jīng)電泳分離后讀取序列[[17]][[19]]。3.【參考答案】B【解析】為確保檢測質(zhì)量和生物安全，《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》明確規(guī)定，涉及基因擴增的檢測項目，必須在通過技術(shù)審核合格的臨床基因擴增檢驗實驗室中進行[[26]]。ISO15189或CNAS是更廣泛的實驗室能力認可，但非該特定技術(shù)的法定準入前提。4.【參考答案】C【解析】FASTQ文件是高通量測序的標(biāo)準原始數(shù)據(jù)格式，其基本結(jié)構(gòu)為每條序列信息占四行：第一行為序列標(biāo)識符，第二行為核苷酸序列，第三行為分隔符（通常為“+”），第四行為對應(yīng)每個堿基的質(zhì)量分數(shù)編碼（ASCII字符）[[35]][[41]]。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測是后續(xù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，并非原始數(shù)據(jù)的一部分。5.【參考答案】B【解析】SYBRGreenI是一種非特異性染料，能嵌入所有雙鏈DNA的小溝中發(fā)光，成本低但易受引物二聚體等非特異產(chǎn)物干擾。TaqMan探針法則依賴于序列特異的水解探針，其5'端帶熒光報告基團，3'端帶淬滅基團；當(dāng)探針被Taq酶的5'→3'外切酶活性水解后，報告基團與淬滅基團分離才發(fā)光，特異性更高。兩者核心差異在于熒光信號的產(chǎn)生機制[[8]][[9]]。6.【參考答案】C【解析】酚-氯仿法提取DNA時，酚作為蛋白質(zhì)變性劑可使蛋白質(zhì)變性，而氯仿的作用主要有兩個：一是有助于水相與有機相的清晰分層，二是溶解脂質(zhì)類雜質(zhì)，從而提高DNA純度。DNA主要存在于上層水相中，而變性蛋白質(zhì)位于中間界面，脂質(zhì)則溶于下層有機相[[10]][[16]]。7.【參考答案】D【解析】引物是PCR反應(yīng)中與模板DNA特定區(qū)域互補結(jié)合的短單鏈寡核苷酸，其序列決定了擴增的起始位置和目標(biāo)片段，因此是決定PCR產(chǎn)物特異性的關(guān)鍵。若引物設(shè)計不當(dāng)，可能導(dǎo)致非特異性擴增或無擴增[[18]][[19]]。8.【參考答案】B【解析】高通量測序（NGS）的核心優(yōu)勢在于其極高的并行處理能力，可在一次運行中同時對數(shù)百萬至數(shù)十億個DNA片段進行測序，大幅提高通量、降低單位成本。而Sanger測序一次僅能測定一個DNA片段[[27]][[31]]。9.【參考答案】C【解析】陰性對照通常不含目標(biāo)核酸序列（如無模板對照或健康人樣本），用于監(jiān)控實驗過程中是否存在試劑污染、交叉污染或非特異性信號。若陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果，則表明實驗結(jié)果不可靠[[38]][[42]]。10.【參考答案】B【解析】DNA片段在電場中遷移速率與其分子量的對數(shù)成反比，即片段越小遷移越快。通過將未知樣本與已知堿基數(shù)的標(biāo)準DNAMarker（如DL2000）在同一凝膠中電泳，比較條帶位置即可估算其大小[[47]][[50]]。11.【參考答案】B【解析】退火溫度過低會導(dǎo)致引物與非目標(biāo)序列發(fā)生部分結(jié)合，從而引發(fā)非特異性擴增，是PCR實驗中最常見的錯誤之一。溫度過高則可能導(dǎo)致擴增效率低下甚至無產(chǎn)物。因此，優(yōu)化退火溫度是提高PCR特異性的關(guān)鍵步驟[[3]]。12.【參考答案】B【解析】在Sanger測序起始階段，未完全去除的熒光染料單體（dyeblobs）會與正常的測序峰重疊，形成雜亂的背景信號，導(dǎo)致引物下游20-50bp內(nèi)的序列讀取不準確，這是該技術(shù)固有的局限性[[10]]。13.【參考答案】C【解析】酚抽提后水相中會殘留少量酚，而酚與氯仿互溶。加入氯仿進行第二次抽提，不僅可以進一步變性去除蛋白質(zhì)，還能將殘留的酚一并帶走，從而提高DNA純度[[20]]。14.【參考答案】A【解析】Ct值與模板起始量的對數(shù)呈負相關(guān)。Ct值過大通常直接反映起始模板量不足或目標(biāo)基因本身拷貝數(shù)/表達水平很低，這是首要排查方向，后續(xù)可考慮引物效率等問題[[8]]。15.【參考答案】B【解析】根據(jù)《微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準則》，涉及人類臨床樣本（可能含有潛在病原體，但通常風(fēng)險可控）的常規(guī)檢測工作，應(yīng)在BSL-2級實驗室中進行，并需獲得相應(yīng)備案[[36]]。16.【參考答案】C【解析】PCR技術(shù)的特異性主要依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，引物決定了擴增的起始位置和目標(biāo)片段，是保證產(chǎn)物特異性的核心要素。耐熱DNA聚合酶、模板濃度和dNTPs雖影響擴增效率，但不直接決定特異性[[7]]。17.【參考答案】C【解析】酚-氯仿抽提法是DNA提取的經(jīng)典方法，利用酚和氯仿使蛋白質(zhì)變性并進入有機相，而DNA保留在水相，從而有效去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)，提高DNA純度[[17]]。18.【參考答案】B【解析】核酸分子的磷酸骨架使其在中性或堿性條件下整體帶負電荷，在電場中會向正極（陽極）遷移。遷移速率還受分子大小和構(gòu)象影響，但帶負電是遷移的根本原因[[26]]。19.【參考答案】A【解析】生物安全一級（BSL-1）實驗室適用于處理對健康成人無致病性或危害極低的微生物，是防護水平最低的實驗室等級[[33]]。20.【參考答案】C【解析】限制性內(nèi)切酶能識別雙鏈DNA中特定的核苷酸序列，并在識別位點內(nèi)部或附近切割磷酸二酯鍵，產(chǎn)生特定的DNA片段，是基因克隆和分析的關(guān)鍵工具酶[[44]]。21.【參考答案】C【解析】酚-氯仿抽提法是經(jīng)典的DNA提取方法之一，通過蛋白酶K和SDS消化細胞后，利用酚和氯仿等有機溶劑去除蛋白質(zhì)，使DNA留在水相中，適用于獲得高分子量DNA[[1]]。磁珠法和離心柱法屬于現(xiàn)代商品化試劑盒常用方法，煮沸裂解法則操作簡單但純度較低。22.【參考答案】B【解析】退火溫度過低會導(dǎo)致引物與非靶序列結(jié)合，引發(fā)非特異性擴增，形成雜帶。其他如引物濃度過高、Mg2?濃度偏高也易導(dǎo)致此問題，而dNTP過低或酶失活通常表現(xiàn)為無擴增產(chǎn)物[[13]]。23.【參考答案】C【解析】NGS技術(shù)通過大規(guī)模并行測序，可同時處理數(shù)百萬至數(shù)十億DNA片段，顯著提升通量并降低成本。Sanger測序雖準確率高、讀長長，但通量低，適用于小規(guī)模靶向測序[[20]]。24.【參考答案】A【解析】根據(jù)我國實驗室生物安全標(biāo)準，操作非致病性人類樣本（如血液、口腔拭子）進行基因檢測，一般在生物安全一級（BSL-1）實驗室即可，該等級適用于對健康成人無致病性的微生物操作[[32]]。25.【參考答案】C【解析】在電場作用下，DNA分子因帶負電向正極遷移，其遷移速率主要取決于分子大小：小片段遷移快，大片段遷移慢，從而實現(xiàn)按長度分離[[43]]。所有DNA在相同緩沖體系中電荷密度相近，故分離主要靠分子量差異。26.【參考答案】B【解析】多重PCR是在單個反應(yīng)體系中同時加入兩對及以上引物，以擴增多個靶序列[[5]]。其基本原理與常規(guī)PCR相同，核心區(qū)別在于引物數(shù)量的增加，使一次反應(yīng)可檢測多個目標(biāo)[[1]]。27.【參考答案】B【解析】高通量測序技術(shù)的核心特點是能夠一次并行對大量核酸分子進行大規(guī)模平行測序，其測序通量遠超Sanger測序（每次僅能測一條DNA片段）[[11]]。28.【參考答案】B【解析】內(nèi)參基因在各組織和細胞中表達相對恒定，用于校正上樣量、提取效率等實驗誤差，確保目標(biāo)基因表達量定量的準確性[[20]]。29.【參考答案】C【解析】由于PCR擴增產(chǎn)物拷貝量巨大，極微量的產(chǎn)物泄漏或反應(yīng)管意外開蓋即可造成嚴重污染，形成假陽性結(jié)果，是PCR實驗室最主要的污染源[[31]]。30.【參考答案】A【解析】SNP是由單個核苷酸發(fā)生替換（轉(zhuǎn)換、顛換）、插入或缺失引起的DNA序列多態(tài)性[[39]]。雖然插入缺失（InDel）也是變異類型，但SNP特指單堿基變化，而InDel通常指小片段（<50bp）插入或缺失[[37]]。31.【參考答案】AC【解析】酚-氯仿抽提是經(jīng)典的去除蛋白質(zhì)方法，能有效分離DNA與蛋白質(zhì)；蛋白酶K可降解組蛋白等DNA結(jié)合蛋白。RNA酶用于去除RNA雜質(zhì)，75%乙醇主要用于洗滌DNA沉淀以去除鹽分，不直接去除蛋白質(zhì)[[9]][[10]]。32.【參考答案】ABD【解析】PCR依賴特異性引物結(jié)合靶序列兩端，循環(huán)包含變性（約95℃）、退火（引物結(jié)合）和延伸（72℃左右）；Taq酶最適延伸溫度為72℃，而非95℃；退火溫度影響引物特異性結(jié)合，是決定產(chǎn)物特異性的關(guān)鍵因素[[2]][[7]]。33.【參考答案】ABD【解析】DNA遷移速率與其分子量對數(shù)成反比，凝膠濃度越高，小片段分離越好；超螺旋DNA比線性DNA遷移更快。標(biāo)準電泳緩沖液（如TAE、TBE）pH穩(wěn)定，對遷移率影響極小，故C不選[[4]][[5]]。34.【參考答案】ABD【解析】實驗室應(yīng)分區(qū)管理，防止交叉污染；濾芯吸頭可阻隔氣溶膠，保護樣本和操作者；紫外滅菌可有效殺滅表面微生物。實驗廢棄物必須按生物危害物規(guī)范處理，嚴禁混入生活垃圾[[1]]。35.【參考答案】ABD【解析】乙醇降低DNA溶解度，陽離子中和電荷減少分子間斥力，促進聚集；通常使用預(yù)冷的70%-100%乙醇，70%乙醇也常用于洗滌；低溫可增強沉淀效果。并非必須100%乙醇，C錯誤[[10]]。36.【參考答案】A、B、C、D【解析】PCR擴增的特異性和效率受多種因素影響。引物設(shè)計不合理易導(dǎo)致非特異性擴增；退火溫度過高或過低會影響引物與模板的結(jié)合；模板中含有抑制物（如酚、氯仿）會降低擴增效率；而Taq酶雖耐熱但缺乏3'→5'外切酶校對活性，保真度較低，可能引入突變。因此四項均正確。37.【參考答案】A、B、C【解析】Sanger測序確實采用雙脫氧核苷酸鏈終止法；NGS（如Illumina）能同時對數(shù)百萬DNA片段測序；第三代測序（如PacBio、Nanopore）可直接對單分子DNA測序，無需PCR擴增。但Illumina讀長一般為50–300bp，遠短于PacBio的數(shù)千至數(shù)萬bp，故D錯誤。38.【參考答案】A、B、C【解析】RNA極易被環(huán)境中廣泛存在的RNase降解。DEPC可滅活RNase；冰上操作減緩酶活性；戴手套防止皮膚RNase污染。但RNA長期保存應(yīng)置于-80℃，4℃僅適用于短期存放，故D錯誤。39.【參考答案】A、B、C、D【解析】堿裂解法中，高pH使DNA雙鏈變性，但質(zhì)粒因共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)在中和時快速復(fù)性，而染色體DNA因線性結(jié)構(gòu)難以復(fù)性而沉淀；酚-氯仿有效去除蛋白；洗脫時低鹽環(huán)境利于DNA溶解。四項均符合標(biāo)準操作原理。40.【參考答案】A、B、C【解析】CRISPR-Cas9系統(tǒng)依賴gRNA引導(dǎo)Cas9蛋白識別靶序列，Cas9負責(zé)切割DNA雙鏈，而PAM（ProtospacerAdjacentMotif）是Cas9識別靶點所必需的鄰近基序。DNA連接酶參與DNA修復(fù)，但非CRISPR系統(tǒng)本身的組成部分，故D錯誤。41.【參考答案】A【解析】退火溫度是PCR的關(guān)鍵參數(shù)之一，通常根據(jù)引物的熔解溫度（Tm）來設(shè)定，而Tm受引物長度及其GC含量（G和C堿基比例）直接影響。GC堿基對含三個氫鍵，比AT更穩(wěn)定，因此GC含量高的引物Tm更高，需更高退火溫度[[4]]。42.【參考答案】A【解析】Sanger測序流程包括PCR擴增、產(chǎn)物純化和測序反應(yīng)，為確保結(jié)果準確性，必須設(shè)置陰性對照（如無模板對照）以監(jiān)控是否存在試劑污染或非特異性擴增，這是標(biāo)準質(zhì)控要求[[7]]。43.【參考答案】B【解析】DNA降解會導(dǎo)致模板完整性受損，尤其當(dāng)目標(biāo)擴增片段較長時，可能無法有效擴增，造成假陰性或信號減弱，嚴重影響檢測準確性。因此，高質(zhì)量DNA是可靠PCR的前提。44.【參考答案】A【解析】MSP是一種專門用于分析DNA甲基化的方法。經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化胞嘧啶不變，?jù)此設(shè)計特異性引物可區(qū)分甲基化與非甲基化狀態(tài)[[4]]。45.【參考答案】A【解析】RNase（核糖核酸酶）廣泛存在于環(huán)境中，極易降解RNA。因此，在涉及RNA操作（如RT-PCR）時，必須使用無RNase的槍頭、離心管等耗材，以保障RNA完整性，確保實驗結(jié)果可靠。46.【參考答案】A.正確【解析】退火溫度是PCR關(guān)鍵參數(shù)之一。若溫度過高，引物與模板DNA無法有效結(jié)合，導(dǎo)致擴增失?。蝗魷囟冗^低，則可能產(chǎn)生非特異性擴增。合理設(shè)置退火溫度（通常比引物Tm值低3–5℃）是確保PCR特異性和效率的關(guān)鍵[[3]]。47.【參考答案】A.正確【解析】讀長指單次測序反應(yīng)獲得的連續(xù)堿基數(shù)。較長的讀長有助于跨越重復(fù)區(qū)域和復(fù)雜結(jié)構(gòu)，顯著提升基因組組裝的連續(xù)性和準確性，尤其在三代測序技術(shù)（如PacBio、Nanopore）中優(yōu)勢明顯。48.【參考答案】A.正確【解析】RNase具有極強的穩(wěn)定性，即使經(jīng)過高壓滅菌（121℃）仍可能保持活性。因此RNA實驗需使用DEPC水、RNase抑制劑及專用耗材，操作環(huán)境也需嚴格防污染，否則RNA極易降解。49.【參考答案】A.正確【解析】Sanger測序依賴雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）隨機摻入新生DNA鏈。因其3'端缺少羥基，無法形成磷酸二酯鍵，導(dǎo)致鏈延伸終止，從而產(chǎn)生不同長度的DNA片段用于序列讀取。50.【參考答案】B.錯誤【解析】DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶（形成5-甲基胞嘧啶），通常導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊縮，抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而抑制基因表達，而非激活。這是表觀遺傳調(diào)控的重要機制之一。

2025四川省醫(yī)致遠醫(yī)學(xué)檢驗有限責(zé)任公司基因檢測實驗員招聘2人筆試歷年難易錯考點試卷帶答案解析（第2套）一、單項選擇題下列各題只有一個正確答案，請選出最恰當(dāng)?shù)倪x項（共25題）1、在聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）中，退火溫度主要取決于以下哪一因素？A.DNA模板的濃度B.引物的長度和堿基組成C.TaqDNA聚合酶的活性D.反應(yīng)體系中Mg2?的濃度2、下列哪種技術(shù)可用于檢測基因表達水平？A.SouthernblotB.NorthernblotC.WesternblotD.Easternblot3、在Sanger測序法中，DNA鏈終止的關(guān)鍵成分是？A.dNTPB.RNA引物C.ddNTPD.DNA聚合酶4、人類基因組中占比最大的DNA序列類型是？A.編碼蛋白質(zhì)的外顯子B.啟動子區(qū)域C.轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列D.內(nèi)含子5、CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，引導(dǎo)RNA（gRNA）的主要功能是？A.切割DNA雙鏈B.識別并結(jié)合特定DNA序列C.合成新的DNA鏈D.修復(fù)DNA斷裂6、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)的核心原理是什么？A.利用抗體與抗原的特異性結(jié)合進行檢測B.通過電泳分離不同大小的蛋白質(zhì)C.在體外模擬DNA天然復(fù)制過程，利用引物特異性擴增目標(biāo)DNA片段[[6]]D.直接讀取DNA分子的堿基序列7、下列哪種方法常用于檢測已知的特定基因突變位點？A.Sanger測序B.實時定量PCR（qPCR）C.常規(guī)PCR結(jié)合電泳分析[[7]]D.高通量測序8、分子診斷技術(shù)的診斷材料主要基于什么？A.蛋白質(zhì)B.糖類C.DNA和RNA[[3]]D.脂質(zhì)9、基因測序技術(shù)能一次性發(fā)現(xiàn)哪些類型的基因變異？A.僅能檢測單個氨基酸替換B.僅能檢測染色體數(shù)目異常C.可檢測基因多態(tài)性、點突變、小片段缺失等多種復(fù)雜基因變異類型[[2]]D.只能檢測基因的表達水平10、PCR技術(shù)在基因突變檢測中的地位如何？A.是最不常用的技術(shù)B.是最基礎(chǔ)、最廣泛應(yīng)用的DNA突變檢測技術(shù)[[4]]C.僅用于蛋白質(zhì)檢測D.主要用于RNA干擾研究11、在基因檢測實驗中，以下哪種DNA提取方法屬于經(jīng)典的有機溶劑抽提法？A.煮沸裂解法B.磁珠法C.酚-氯仿抽提法D.玻璃棒纏繞法12、標(biāo)準PCR反應(yīng)體系中，提供新鏈合成原料的是？A.引物B.TaqDNA聚合酶C.模板DNAD.dNTP13、Sanger測序技術(shù)實現(xiàn)鏈終止的關(guān)鍵試劑是？A.dNTPB.ddNTPC.RNA引物D.限制性內(nèi)切酶14、在基因檢測實驗中，最常見的外源性污染類型是？A.質(zhì)粒污染B.擴增產(chǎn)物（amplicon）污染C.培養(yǎng)基污染D.酶制劑失活15、在瓊脂糖凝膠電泳中，DNA片段的遷移速率主要取決于？A.DNA片段的堿基序列B.DNA片段的濃度C.DNA片段的分子大小D.電泳緩沖液的pH值16、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）的第一步是高溫變性，其主要目的是什么？A.使引物與模板DNA特異性結(jié)合B.在DNA聚合酶作用下合成新鏈C.將雙鏈DNA模板解離為單鏈D.降解反應(yīng)體系中的RNA雜質(zhì)17、在DNA甲基化檢測中，重亞硫酸鹽（Bisulfite）處理的核心作用是：A.切割甲基化的胞嘧啶位點B.將未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）C.富集甲基化DNA片段D.激活甲基化依賴的限制性內(nèi)切酶18、高通量測序數(shù)據(jù)中，“Q30”值為90%表示：A.90%的reads長度≥30bpB.90%堿基的測序錯誤率≤0.1%C.數(shù)據(jù)比對率≥90%D.30%的堿基錯誤率≤1%19、與Sanger測序相比，第二代測序（NGS）最顯著的技術(shù)優(yōu)勢是：A.單條讀長更長B.無需PCR擴增步驟C.可實現(xiàn)大規(guī)模并行測序D.測序錯誤類型僅為插入缺失20、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析技術(shù)依賴于以下哪種分子生物學(xué)原理？A.DNA雙鏈的熱變性與復(fù)性B.特異性核酸序列的熒光探針雜交C.限制性內(nèi)切酶對特定序列的識別與切割D.反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA21、在聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）中，引物設(shè)計的關(guān)鍵原則之一是：A.引物長度通常為5–10個堿基B.引物應(yīng)盡可能形成二級結(jié)構(gòu)以增強特異性C.兩個引物的Tm值應(yīng)盡量接近D.引物3'端應(yīng)富含G或C以防止錯配延伸22、下列哪種技術(shù)可用于檢測單核苷酸多態(tài)性（SNP）？A.熒光原位雜交（FISH）B.Sanger測序C.蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）D.流式細胞術(shù)23、在基因檢測實驗中，使用乙二胺四乙酸（EDTA）的主要作用是：A.促進DNA聚合酶活性B.作為DNA染色劑C.抑制核酸酶活性D.增強PCR擴增效率24、關(guān)于RNA提取過程中的操作，以下說法正確的是：A.可使用普通玻璃器皿反復(fù)使用無需特殊處理B.操作應(yīng)在無RNase的環(huán)境中進行C.RNA可在室溫下長期保存而不降解D.提取時無需使用異硫氰酸胍等變性劑25、在二代測序（NGS）文庫構(gòu)建過程中，“接頭連接”步驟的主要目的是：A.降解多余引物B.增加DNA片段長度C.便于片段與測序芯片結(jié)合并進行擴增D.標(biāo)記甲基化位點二、多項選擇題下列各題有多個正確答案，請選出所有正確選項（共15題）26、在聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）中，以下哪些因素會影響擴增的特異性和效率？A.引物設(shè)計的特異性B.退火溫度的設(shè)置C.Mg2?離子濃度D.模板DNA的純度27、下列哪些屬于二代測序（NGS）技術(shù)的特點？A.高通量并行測序B.單次運行可產(chǎn)生數(shù)G到Tb級別的數(shù)據(jù)C.無需PCR擴增即可直接測序D.讀長通常短于Sanger測序28、在基因檢測實驗中，為防止樣本交叉污染，應(yīng)采取哪些措施？A.使用帶濾芯的吸頭B.實驗區(qū)域物理分隔（如試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增區(qū)）C.定期紫外線照射工作臺面D.同一移液器在不同樣本間連續(xù)使用以提高效率29、以下哪些是DNA提取過程中常用的裂解方法？A.蛋白酶K消化B.SDS（十二烷基硫酸鈉）處理C.高溫煮沸D.乙醇沉淀30、關(guān)于實時熒光定量PCR（qPCR），以下說法正確的是？A.可通過Ct值反映初始模板量B.常用的熒光標(biāo)記方法包括SYBRGreen和TaqMan探針C.不需要設(shè)置內(nèi)參基因即可進行絕對定量D.擴增產(chǎn)物需通過凝膠電泳驗證31、在聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）中，可能導(dǎo)致非特異性擴增的因素有哪些？A.退火溫度過低B.引物濃度過高C.Mg2?濃度過高D.循環(huán)次數(shù)過少32、關(guān)于基因組DNA提取的質(zhì)量控制，下列說法正確的是？A.A260/A280比值在1.8–2.0之間表明DNA純度較高B.A260/A230比值偏低可能提示存在有機溶劑或鹽類污染C.DNA降解會導(dǎo)致瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)彌散條帶D.使用反復(fù)凍融的組織樣本可提高DNA得率33、下列關(guān)于不同代際DNA測序技術(shù)特點的描述，正確的是？A.第一代測序（Sanger法）讀長較長，準確性高B.第二代測序通量高，但讀長較短C.第三代測序可實現(xiàn)單分子實時測序，無需PCR擴增D.第二代測序無法用于全基因組測序34、在分子生物學(xué)實驗中，為防止PCR污染，應(yīng)采取哪些措施？A.分區(qū)操作（試劑配制區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增區(qū)）B.使用帶濾芯的吸頭C.定期對實驗臺面進行紫外線照射D.所有試劑反復(fù)凍融以保持活性35、關(guān)于生物安全實驗室分級及防護要求，下列說法正確的是？A.BSL-1適用于對健康成人無致病性的微生物B.BSL-2需配備生物安全柜和高壓滅菌設(shè)備C.BSL-3實驗室需負壓環(huán)境和獨立通風(fēng)系統(tǒng)D.所有基因檢測實驗必須在BSL-4實驗室進行36、關(guān)于Sanger測序法（雙脫氧鏈終止法）的原理，以下說法正確的有？A.依賴于雙脫氧核苷酸（ddNTP）隨機摻入導(dǎo)致DNA鏈合成終止B.需要使用四種不同熒光標(biāo)記的ddNTP分別進行獨立反應(yīng)C.其測序產(chǎn)物可通過毛細管電泳進行分離和檢測D.可一次性讀取數(shù)百萬條DNA片段序列37、在PCR反應(yīng)體系中，以下哪些成分是必需的？A.模板DNAB.熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq酶）C.dNTPs（脫氧核苷三磷酸）D.RNA引物38、關(guān)于DNA提取過程中常用的酚-氯仿法，以下描述正確的有？A.酚可使蛋白質(zhì)變性，有助于去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)B.氯仿有助于去除脂類物質(zhì)并促進水相與有機相分離C.上清液（水相）中含有DNAD.該方法適用于高通量自動化提取39、在基因檢測實驗中，以下哪些措施有助于防止PCR污染？A.設(shè)立陰性對照（不含模板DNA）B.使用帶濾芯的吸頭C.在同一區(qū)域配制反應(yīng)體系和擴增產(chǎn)物分析D.定期紫外線照射工作臺面40、關(guān)于實時熒光定量PCR（qPCR）中的Ct值，以下說法正確的有？A.Ct值是指熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)B.Ct值越小，表示起始模板量越多C.Ct值可用于絕對定量和相對定量D.同一樣品不同基因的Ct值可以直接比較表達量三、判斷題判斷下列說法是否正確（共10題）41、PCR擴增過程中，退火溫度通常設(shè)定為低于引物Tm值5℃左右，以確保引物特異性結(jié)合模板DNA。A.正確B.錯誤42、在基因檢測的DNA提取過程中，酚-氯仿法的主要作用是通過變性蛋白質(zhì)來實現(xiàn)DNA與蛋白質(zhì)的分離。A.正確B.錯誤43、TaqDNA聚合酶在PCR擴增中具有3'→5'外切酶校對活性，能顯著提高擴增產(chǎn)物的保真度。A.正確B.錯誤44、與高通量測序（NGS）相比，Sanger測序法的單次讀長更長。A.正確B.錯誤45、基因檢測實驗中設(shè)置陰性對照的主要目的是驗證實驗體系是否存在污染或非特異性擴增。A.正確B.錯誤46、實時熒光定量PCR（qPCR）中，Ct值越小，表示模板起始拷貝數(shù)越低。A.正確B.錯誤47、基因檢測主要通過分析DNA或RNA的結(jié)構(gòu)、數(shù)量或表達功能異常來識別遺傳性疾病的基因水平變化[[1]]。A.正確B.錯誤48、定量PCR技術(shù)通過在反應(yīng)體系中加入熒光基團，實時監(jiān)測擴增產(chǎn)物的熒光信號變化來實現(xiàn)對模板的定量分析[[5]]。A.正確B.錯誤49、新一代高通量測序技術(shù)的第一步是將基因組DNA隨機打斷成數(shù)百堿基長度的小片段[[3]]。A.正確B.錯誤50、第一代DNA測序技術(shù)（如Sanger法）與化學(xué)降解法的原理完全相同。A.正確B.錯誤

參考答案及解析1.【參考答案】B【解析】退火溫度是PCR反應(yīng)中的關(guān)鍵參數(shù)，主要由引物的長度及其GC含量決定。GC堿基對含三個氫鍵，比AT更穩(wěn)定，因此GC含量高的引物需要更高的退火溫度。一般通過公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估算引物熔解溫度，退火溫度通常設(shè)為Tm減去3–5℃。其他選項雖影響PCR效率，但不主導(dǎo)退火溫度設(shè)定。2.【參考答案】B【解析】Northernblot用于檢測RNA，可分析特定基因的表達水平及轉(zhuǎn)錄本大小。Southernblot檢測DNA，Westernblot檢測蛋白質(zhì)，Easternblot則是對蛋白質(zhì)翻譯后修飾的檢測，使用較少。因此，檢測基因表達（即mRNA水平）應(yīng)選用Northernblot。3.【參考答案】C【解析】Sanger測序依賴雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）的摻入。ddNTP缺少3'-OH基團，一旦摻入DNA鏈，無法形成磷酸二酯鍵，導(dǎo)致鏈延伸終止。通過在四個反應(yīng)中分別加入不同熒光標(biāo)記的ddNTP（ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP），可讀取DNA序列。dNTP是正常延伸所需，但不會終止反應(yīng)。4.【參考答案】C【解析】人類基因組中約50%以上由轉(zhuǎn)座子和各類重復(fù)序列（如Alu、LINE、SINE等）構(gòu)成。編碼蛋白質(zhì)的外顯子僅占約1–2%，內(nèi)含子占比雖高但低于重復(fù)序列。啟動子區(qū)域分散且總量較小。重復(fù)序列雖多不具編碼功能，但在基因組進化與調(diào)控中具有潛在作用。5.【參考答案】B【解析】gRNA由crRNA和tracrRNA融合而成，其5'端約20個核苷酸可與靶DNA序列互補配對，從而引導(dǎo)Cas9蛋白定位到特定位點。Cas9蛋白負責(zé)切割DNA雙鏈，而非gRNA。gRNA不參與DNA合成或修復(fù)，其核心作用是序列特異性識別與靶向。6.【參考答案】C【解析】PCR技術(shù)是在體外模擬細胞內(nèi)DNA復(fù)制的過程，通過高溫變性、低溫退火（引物與模板結(jié)合）和適溫延伸三個步驟的循環(huán)，利用特異性引物選擇性地將目標(biāo)DNA片段擴增數(shù)百萬倍[[5]]。7.【參考答案】C【解析】常規(guī)PCR結(jié)合電泳分析可通過擴增特定DNA片段并觀察其大小，快速檢測已知的突變位點或特定基因型，是分子診斷中常用的基礎(chǔ)方法[[7]]。8.【參考答案】C【解析】分子診斷技術(shù)是以DNA和RNA為診斷材料，通過檢測基因的存在、缺陷或表達異常來診斷人體狀態(tài)和疾病[[3]]。9.【參考答案】C【解析】基因測序技術(shù)能夠?qū)^長的基因片段進行檢測，并可一次性發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性、點突變、小片段缺失等多種復(fù)雜的基因變異類型[[2]]。10.【參考答案】B【解析】聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）被認為是最基本、最為廣泛應(yīng)用的DNA突變檢測技術(shù)，因為它能將微量的DNA在幾小時內(nèi)擴增至百萬倍以上，便于后續(xù)檢測[[4]]。11.【參考答案】C【解析】酚-氯仿抽提法是DNA提取的經(jīng)典方法之一，通過蛋白酶K和SDS消化細胞后，利用酚和氯仿等有機溶劑去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)，使DNA保留在水相中，從而實現(xiàn)純化。該方法提取的DNA純度高、片段大，適用于后續(xù)PCR等高要求實驗。而煮沸法雜質(zhì)多，磁珠法屬于現(xiàn)代固相提取技術(shù)[[1]]。12.【參考答案】D【解析】dNTP（脫氧核苷三磷酸）包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP，是DNA聚合酶合成新鏈時所需的四種基本原料。引物用于啟動合成，Taq酶催化反應(yīng)，模板DNA提供復(fù)制藍圖，但只有dNTP直接參與新鏈的核苷酸聚合[[10]]。13.【參考答案】B【解析】Sanger測序（雙脫氧鏈終止法）依賴于ddNTP（雙脫氧三磷酸核苷酸）。ddNTP缺少3'-OH基團，一旦摻入新鏈即終止延伸。通過在四個反應(yīng)中分別加入不同熒光標(biāo)記的ddNTP（ddA、ddT、ddC、ddG），可生成一系列不同長度的終止片段，經(jīng)電泳后讀取序列[[20]]。14.【參考答案】B【解析】擴增產(chǎn)物污染是PCR實驗室中最常見且危害最大的污染源，因其拷貝數(shù)極高，極微量氣溶膠即可導(dǎo)致假陽性。防控措施包括分區(qū)操作、使用帶濾芯吸頭、定期清潔及設(shè)立陰性對照[[28]]。15.【參考答案】C【解析】DNA分子帶負電，在電場中向正極遷移。其遷移速率與分子量的對數(shù)值成反比——片段越小，遷移越快。瓊脂糖濃度也影響分辨率，但決定遷移快慢的核心因素是片段長度[[38]]。16.【參考答案】C【解析】PCR循環(huán)包含變性、退火、延伸三步。變性是通過加熱（通常94–98℃）破壞雙鏈DNA的氫鍵，使其解鏈為單鏈模板，為后續(xù)引物結(jié)合做準備。若變性不充分，將導(dǎo)致擴增失敗[[9]]。選項A描述的是退火步驟，B是延伸步驟。17.【參考答案】B【解析】重亞硫酸鹽法是甲基化檢測的金標(biāo)準之一。其原理是：未甲基化的C被轉(zhuǎn)化為U（后續(xù)PCR中變?yōu)門），而5-甲基胞嘧啶（5mC）不發(fā)生反應(yīng)，從而通過測序或PCR區(qū)分甲基化狀態(tài)[[20]]。該方法不直接切割或富集DNA。18.【參考答案】B【解析】質(zhì)量值Q=-10lgP，其中P為錯誤概率。Q30對應(yīng)P=0.001，即錯誤率0.1%、正確率99.9%。Q30≥85%是業(yè)界常見質(zhì)控標(biāo)準[[26]]。因此，Q30為90%意味著90%的堿基達到該準確度。19.【參考答案】C【解析】NGS的核心突破在于高通量并行化——一次運行可同時測序數(shù)百萬至數(shù)十億DNA片段，大幅降低成本與時間；而Sanger測序為單反應(yīng)單片段[[35]]。NGS讀長通常短于Sanger，且仍需PCR建庫[[37]]。20.【參考答案】C【解析】RFLP技術(shù)基于不同個體DNA序列差異可能導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶識別位點的有無或位置變化，經(jīng)酶切后產(chǎn)生不同長度的DNA片段，通過電泳即可分辨多態(tài)性[[46]]。這是第一代DNA分子標(biāo)記的核心原理。21.【參考答案】C【解析】PCR引物設(shè)計中，上下游引物的熔解溫度（Tm值）應(yīng)盡量接近，以保證在同一退火溫度下都能有效結(jié)合模板。引物長度通常為18–25個堿基；引物應(yīng)避免形成二級結(jié)構(gòu)；3'端雖可含G/C，但并非為“防止錯配延伸”，反而3'端錯配易導(dǎo)致非特異性擴增。22.【參考答案】B【解析】Sanger測序可準確讀取DNA序列，適用于檢測已知或未知的SNP位點。FISH用于染色體結(jié)構(gòu)或定位分析；WesternBlot檢測蛋白質(zhì)表達；流式細胞術(shù)用于細胞表型分析，均不直接用于SNP檢測。23.【參考答案】C【解析】EDTA是一種金屬離子螯合劑，可螯合Mg2?等二價陽離子，而這些離子是DNase等核酸酶的輔因子，因此EDTA通過抑制核酸酶活性來保護DNA不被降解，常用于DNA提取和儲存緩沖液中。24.【參考答案】B【解析】RNA極易被環(huán)境中廣泛存在的RNase降解，因此提取過程必須使用無RNase的耗材、試劑和操作環(huán)境。通常需使用DEPC水處理器皿，或使用一次性無RNase耗材，并在低溫下快速操作和保存。25.【參考答案】C【解析】NGS文庫構(gòu)建中，接頭（adapters）是一段已知序列的短DNA，連接到DNA片段兩端，使其能夠與測序平臺的流動池（flowcell）表面的互補序列結(jié)合，并作為PCR擴增和測序引物的結(jié)合位點，是測序的關(guān)鍵前提。26.【參考答案】ABCD【解析】PCR的特異性和效率受多重因素影響：引物設(shè)計不當(dāng)會導(dǎo)致非特異性擴增；退火溫度過高或過低分別影響結(jié)合效率或特異性；Mg2?是Taq酶的輔因子，濃度過高會降低特異性，過低則影響擴增效率；模板DNA若含雜質(zhì)（如酚、乙醇）會抑制酶活性，降低擴增效率。27.【參考答案】ABD【解析】二代測序具有高通量、大規(guī)模并行測序能力，單次可產(chǎn)出海量數(shù)據(jù)，但多數(shù)平臺（如Illumina）讀長較短（100–300bp），低于Sanger測序（約800–1000bp）；目前主流NGS仍需PCR擴增構(gòu)建文庫，僅部分平臺（如納米孔測序）可實現(xiàn)直接測序，但不屬于典型的二代測序。28.【參考答案】ABC【解析】防止交叉污染的關(guān)鍵在于物理隔離（分區(qū)操作）、使用防氣溶膠吸頭（帶濾芯）、定期清潔消毒（如UV照射降解DNA）。選項D明顯錯誤，同一移液器連續(xù)用于不同樣本極易導(dǎo)致交叉污染，應(yīng)避免。29.【參考答案】ABC【解析】DNA提取中，蛋白酶K可降解蛋白質(zhì)；SDS破壞細胞膜和核膜并變性蛋白；高溫煮沸可裂解細胞并滅活核酸酶。乙醇沉淀是DNA純化步驟，用于析出DNA，不屬于裂解方法。30.【參考答案】AB【解析】qPCR中Ct值與初始模板量呈負相關(guān)，可用于定量；SYBRGreen結(jié)合雙鏈DNA發(fā)光，TaqMan探針依賴熒光共振能量轉(zhuǎn)移，二者均為常用方法。絕對定量需標(biāo)準曲線，相對定量需內(nèi)參基因；qPCR為閉管操作，擴增產(chǎn)物無需電泳驗證。31.【參考答案】A、B、C【解析】非特異性擴增是PCR常見問題，通常由退火溫度過低（使引物與非靶序列結(jié)合）、引物或Mg2?濃度過高（增強非特異性結(jié)合）以及循環(huán)次數(shù)過多引起。循環(huán)次數(shù)過少通常導(dǎo)致產(chǎn)量不足，而非非特異性產(chǎn)物[[12]]。32.【參考答案】A、B、C【解析】A260/A280反映蛋白質(zhì)污染，理想值為1.8–2.0；A260/A230偏低提示胍鹽、酚或乙醇殘留；DNA降解在電泳中呈拖尾或彌散。反復(fù)凍融會破壞DNA完整性，降低得率[[18]][[24]]。33.【參考答案】A、B、C【解析】Sanger法讀長達800–1000bp，準確率>99.99%；二代測序（如Illumina）高通量、短讀長（100–300bp），廣泛用于全基因組測序；三代測序（如PacBio、Nanopore）可直接測單分子DNA，無需擴增[[30]][[32]][[34]]。34.【參考答案】A、B、C【解析】防污染關(guān)鍵在于物理隔離（分區(qū)）、使用防氣溶膠吸頭、紫外線滅活殘留DNA。反復(fù)凍融會降低酶和試劑穩(wěn)定性，應(yīng)避免[[14]]。35.【參考答案】A、B、C【解析】BSL-1處理低風(fēng)險微生物；BSL-2處理中等風(fēng)險病原體，需基礎(chǔ)防護設(shè)備；BSL-3用于可通過氣溶膠傳播的高致病性病原體，要求負壓和獨立排風(fēng)。常規(guī)基因檢測通常在BSL-2進行，無需BSL-4[[37]][[43]]。36.【參考答案】AC【解析】Sanger測序利用ddNTP在DNA合成過程中隨機終止鏈延伸，產(chǎn)生不同長度的片段，經(jīng)電泳分離后讀取序列?，F(xiàn)代自動測序通常使用四種熒光標(biāo)記的ddNTP在同一反應(yīng)體系中完成，而非分別反應(yīng)。該方法通量低，不能一次性讀取數(shù)百萬條序列（此為高通量測序特點），故B、D錯誤。A、C符合其基本原理[[1]][[6]]。37.【參考答案】ABC【解析】PCR必需成分包括模板DNA、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（耐高溫）、dNTPs作為合成原料以及DNA引物（非RNA引物）。細胞內(nèi)DNA復(fù)制使用RN