2026屆高考生物二輪精準(zhǔn)復(fù)習(xí)第頁基因工程專題一、單選題1.下列關(guān)于PCR的敘述錯(cuò)誤的是（）A.用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)需要知道基因的部分序列 B.設(shè)計(jì)的引物序列必須全部能夠和模板DNA堿基互補(bǔ)

C.復(fù)性溫度過高可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物 D.第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有兩種引物的DNA片段所占比例為7/8【答案】B【解析】用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要根據(jù)已知的基因部分序列來設(shè)計(jì)引物，這樣引物才能與模板DNA結(jié)合，啟動(dòng)擴(kuò)增過程，A正確；設(shè)計(jì)的引物序列只需與模板DNA的特定區(qū)域互補(bǔ)配對即可，并非全部堿基互補(bǔ)，B錯(cuò)誤；復(fù)性溫度過高，引物與模板DNA難以結(jié)合，就無法進(jìn)行后續(xù)的延伸反應(yīng)，導(dǎo)致得不到擴(kuò)增產(chǎn)物，C正確；DNA復(fù)制為半保留復(fù)制，DNA復(fù)制n次，共形成2n個(gè)DNA，其中兩個(gè)DNA含有母鏈和子鏈（含引物A或引物B），（2n-2）個(gè)DNA都含有子鏈（含有引物A和引物B），第四輪循環(huán)即DNA復(fù)制4次，共形成16個(gè)DNA，產(chǎn)物中同時(shí)含有引物A和引物B的DNA片段所占的比率為14/16＝7/8，D正確。2.關(guān)于"瓊脂糖凝膠電泳"實(shí)驗(yàn)，下列敘述正確的是（）A.根據(jù)待分離DNA片段的大小，需用無菌水配制0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液B.向瓊脂糖溶液中加入適量的核酸染料后，需在沸水浴內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化C.將PCR產(chǎn)物和電泳緩沖液混合后，需用微量移液器將混合液緩慢注入加樣孔D.待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，需及時(shí)斷電并取出凝膠置于紫外燈下觀察【答案】D【解析】配制瓊脂糖溶液時(shí)，應(yīng)該用緩沖液而不是無菌水來配制，這樣才能維持合適的離子強(qiáng)度和pH等條件，保證電泳效果，A錯(cuò)誤；應(yīng)該是先在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化，然后待溶液稍冷卻后再加入適量的核酸染料混勻，B錯(cuò)誤；先將PCR產(chǎn)物和凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入加樣孔內(nèi)，而不是和電泳緩沖液混合，C錯(cuò)誤；待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，及時(shí)斷電停止電泳，取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相，D正確。3.下列關(guān)于“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)敘述錯(cuò)誤的是（）A.PCR過程中模板DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變B.PCR擴(kuò)增時(shí)需通過離心將各組分集中在微量離心管的底部C.制備瓊脂糖凝膠時(shí)，需待凝膠溶液稍冷卻后加入適量的核酸染料混勻D.可通過在紫外燈下觀察DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果【答案】A【解析】PCR過程中，模板DNA雙螺旋的兩條鏈并沒有被破壞，通過高溫解旋，分成單獨(dú)的鏈，每一條舊鏈作為模板再合成一條新鏈，這樣在新合成的兩個(gè)DNA分子中，一條鏈?zhǔn)桥f的而另外一條鏈?zhǔn)切碌模珹錯(cuò)誤；PCR擴(kuò)增時(shí)將各組分充分混合后進(jìn)行短時(shí)離心，以使管壁上的液體全部離心至管底，B正確；制備瓊脂糖凝膠時(shí)，需待凝膠溶液稍冷卻至不燙手（約50℃）后，再加入適量的核酸染料混勻。若溫度過高，核酸染料會(huì)因高溫分解，影響對DNA的染色效果，C選項(xiàng)敘述正確；DNA經(jīng)電泳分離后，不同大小和含量的DNA片段會(huì)在凝膠上形成不同位置和粗細(xì)的條帶。在紫外燈下，可觀察DNA條帶的分布位置判斷其大小，通過條帶的粗細(xì)程度判斷DNA的含量，從而評價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果，D正確。4.T4溶菌酶耐熱性差，將該酶的第3位氨基酸進(jìn)行如圖所示改造，可大大提高其耐熱性。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A.T4溶菌酶耐熱性改造設(shè)計(jì)思路與天然蛋白質(zhì)的合成方向相反B.根據(jù)設(shè)計(jì)的T4溶菌酶的氨基酸序列可推測出多種脫氧核苷酸序列C.利用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)對相關(guān)基因進(jìn)行改造，至少需替換兩個(gè)堿基對D.T4溶菌酶耐熱性提高的直接原因是其氨基酸的種類和數(shù)量發(fā)生改變【答案】D【解析】天然蛋白質(zhì)的合成方向是DNA→mRNA→蛋白質(zhì)，而T4溶菌酶耐熱性改造設(shè)計(jì)思路是根據(jù)需要改變的蛋白質(zhì)氨基酸序列確定mRNA上的堿基序列，再得出對應(yīng)基因的堿基序列，說明T4溶菌酶耐熱性改造設(shè)計(jì)思路與天然蛋白質(zhì)的合成方向相反，A正確；據(jù)圖所示，半胱氨酸有兩種密碼子，不同的密碼子對應(yīng)不同的脫氧核苷酸序列，因此根據(jù)設(shè)計(jì)的T4溶菌酶的氨基酸序列可推測出多種脫氧核苷酸序列，B正確；根據(jù)異亮氨酸和半胱氨酸對應(yīng)的密碼子序列可知，兩種氨基酸的密碼子至少有兩個(gè)堿基不同，那么利用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)對相關(guān)基因進(jìn)行改造，至少需替換兩個(gè)堿基對，C正確；T4溶菌酶耐熱性改造沒有改變氨基酸的數(shù)量，僅是異亮氨酸替換為半胱氨酸，D錯(cuò)誤。5.不對稱PCR是一種常見的單鏈DNA探針制備方法，其原理是反應(yīng)體系中加入一對數(shù)量不相等的引物，數(shù)量較少的為限制性引物，數(shù)量較多的為非限制性引物。假設(shè)體系中模板DNA數(shù)量為a，在PCR反應(yīng)的早期10個(gè)循環(huán)中，擴(kuò)增產(chǎn)物是雙鏈DNA，限制性引物耗盡，非限制性引物繼續(xù)引導(dǎo)合成大量目標(biāo)DNA單鏈。下列說法正確的是（）A.若B鏈為所需的DNA探針，則非限制性引物應(yīng)選用引物ⅣB.兩種引物與模板鏈結(jié)合時(shí)，需將溫度控制在72℃左右C.如果總共進(jìn)行25次循環(huán)，最終獲得的單鏈探針數(shù)為15×2010aD.因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的長度相同，不能通過電泳方法將其分離【答案】C【解析】由于DNA聚合酶只能從3'端延伸DNA鏈，引物Ⅱ和Ⅲ不能作為擴(kuò)增探針序列的引物，據(jù)題干信息“數(shù)量較多的非限制性引物將引導(dǎo)合成大量目標(biāo)DNA單鏈”可知，若B鏈為所需的DNA分子探針，即目標(biāo)DNA單鏈，則則非限制性引物應(yīng)選用引物Ⅰ，A錯(cuò)誤；B、兩種引物與模板鏈結(jié)合即復(fù)性過程，該過程中溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合，B錯(cuò)誤；如果體系中原模板DNA的數(shù)量為a，最初10次循環(huán)產(chǎn)物為雙鏈DNA分子為210×a個(gè)，其中有B鏈為210×a個(gè)，以這些鏈為模板，利用引物又進(jìn)行了15次循環(huán)，每次循環(huán)生成的都是A鏈，不改變B鏈的數(shù)目，即B每次循環(huán)開始都是210×a個(gè)，15次循環(huán)每次生成A也是210×a個(gè)，故最終獲得的單鏈探針數(shù)共為15×210×a個(gè)，C正確；單鏈DNA和雙鏈DNA的分子量不同，電泳可以將其分離，D錯(cuò)誤。6.某生物社團(tuán)利用洋蔥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。下列相關(guān)敘述正確的是()A.洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮可代替半透膜探究細(xì)胞膜的透性B.洋蔥勻漿中加入新配制的斐林試劑，溶液即呈磚紅色C.制作根尖有絲分裂裝片時(shí)，解離、漂洗、按壓蓋玻片都能更好地將細(xì)胞分散開D.粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑后顯藍(lán)色【答案】A【解析】洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮的原生質(zhì)層具有選擇透過性，可代替半透膜探究細(xì)胞膜的透性，A正確；洋蔥勻漿中加入新配制的斐林試劑，需要水浴加熱才可能出現(xiàn)磚紅色沉淀，證明洋蔥勻漿中含有還原糖，B錯(cuò)誤；制作根尖有絲分裂裝片時(shí)，解離、按壓蓋玻片的目的都是為了獲得單層細(xì)胞，這些操作均能更好地將細(xì)胞分散開，但漂洗的目的是洗去解離液，C錯(cuò)誤；粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑后經(jīng)過水浴加熱可顯藍(lán)色，D錯(cuò)誤。7.下圖是剔除轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的一種策略，下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A.分別帶有目的基因和標(biāo)記基因的兩個(gè)質(zhì)粒，都帶有T-DNA序列B.該方法建立在高轉(zhuǎn)化頻率基礎(chǔ)上，標(biāo)記基因和目的基因須轉(zhuǎn)到不同染色體上C.若要獲得除標(biāo)記基因的植株，轉(zhuǎn)化植株必須經(jīng)過有性繁殖階段遺傳重組D.獲得的無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生了染色體結(jié)構(gòu)變異【答案】D【解析】農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上，故分別帶有目的基因和標(biāo)記基因的兩個(gè)質(zhì)粒，都帶有T-DNA序列，進(jìn)而成功整合到受體細(xì)胞染色體上，A正確；該方法需要利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，在高轉(zhuǎn)化頻率的基礎(chǔ)上，將目的基因和標(biāo)記基因整合到染色體上，由圖可知，標(biāo)記基因和目的基因位于細(xì)胞中不同的染色體上，B正確；通過雜交分離結(jié)果可知，經(jīng)過有性繁殖階段遺傳重組后獲得了三種類型細(xì)胞，其中包括只含目的基因的，只含標(biāo)記基因的和既含目的基因又含標(biāo)記基因的，C正確；獲得的無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生了基因重組，D錯(cuò)誤。8.如圖為轉(zhuǎn)基因抗蟲煙草的培育流程，則下列敘述正確的是（）A.培育過程①需要使用限制酶和DNA聚合酶B.過程②將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入煙草細(xì)胞前需要使用CaCO3處理農(nóng)桿菌C.培育過程③④僅通過調(diào)節(jié)生長調(diào)節(jié)劑可誘導(dǎo)愈傷組織再生出新植株D.可通過觀察害蟲吞食轉(zhuǎn)基因煙草后的存活情況進(jìn)行個(gè)體水平檢測【答案】D【解析】過程①表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程，即形成重組Ti質(zhì)粒的過程，需要使用限制酶和DNA連接酶，但是不需要DNA聚合酶，A錯(cuò)誤；過程②是將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程，再將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入煙草細(xì)胞前需要先使用CaCl2處理農(nóng)桿菌，B錯(cuò)誤；過程③④為再分化成植株的過程，該過程中需要通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑的適當(dāng)配比，從而實(shí)現(xiàn)由愈傷組織誘導(dǎo)出芽和根的頂端分生組織的目的，并由此再生出新植株，C錯(cuò)誤；對轉(zhuǎn)基因抗蟲煙草的檢測，可通過進(jìn)行個(gè)體水平的檢測判斷轉(zhuǎn)基因是否成功，即讓害蟲吞食轉(zhuǎn)基因煙草，觀察害蟲的存活情況進(jìn)行判斷，D正確。9.數(shù)字PCR即DigitalPCR（dPCR），它是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。數(shù)字PCR能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對起始樣品的絕對定量。下圖為數(shù)字PCR技術(shù)的原理示意圖，有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）A.dPCR反應(yīng)體系需要加入一定的緩沖溶液和Mg2+B.dPCR是基于DNA單分子PCR方法進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量C.每個(gè)反應(yīng)單位有無熒光取決于是否含有靶分子D.PCR和dPCR在檢測病原體的靈敏度上完全相同【答案】D【解析】dPCR反應(yīng)體系擴(kuò)增蛋白目的基因時(shí)，需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，目的是保持（耐熱DNA聚合）并激活DNA聚合酶的活性，A正確；結(jié)合題圖可知，每個(gè)反應(yīng)單位中最多含有1個(gè)DNA分子，故dPCR是基于DNA單分子PCR方法進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量方法，B正確；熒光是由帶熒光標(biāo)記基因探針與靶分子堿基互補(bǔ)配對，故每個(gè)反應(yīng)單位有無熒光取決于是否含有靶分子，C正確；數(shù)字PCR技術(shù)是一種新的核酸檢測和定量方法，比傳統(tǒng)PCR檢測病原體更為靈敏，D錯(cuò)誤。10.一種天然蛋白t-PA能高效降解因血漿纖維蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和腦血栓的急救藥，但是心?；颊咦⑸浯髣┝康膖-PA會(huì)誘發(fā)顱內(nèi)出血。研究證實(shí)，將t-PA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，能顯著降低其誘發(fā)出血的副作用。據(jù)此，先對天然t-PA基因的堿基序列進(jìn)行改造，然后再采取傳統(tǒng)的基因工程方法表達(dá)該改造后的基因，可制造出性能優(yōu)異的改良t-PA蛋白。下列說法正確的是（）A.以上技術(shù)制造出性能優(yōu)異的改良t-PA過程被稱為蛋白質(zhì)工程B.構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)需要選用限制酶XmaI和NheI切割質(zhì)粒pCLY11C.使用T4DNA連接酶不能將t-PA改良基因與質(zhì)粒pCLY11連接D.成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞在含有新霉素的培養(yǎng)基上能存活，且呈現(xiàn)藍(lán)色【答案】A【解析】該技術(shù)通過改造基因，從而產(chǎn)生出優(yōu)異的改良t-PA蛋白，因此該技術(shù)蛋白質(zhì)工程，A正確；根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，t-PA基因的左端黏性末端為CCGG-，為XmaⅠ酶切得到，t-PA基因的右端黏性末端為GATC-，為BglⅡ酶切得到，質(zhì)粒需要用相同的酶進(jìn)行酶切以得到與目的基因相同的黏性末端，因此質(zhì)粒需選用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割質(zhì)粒pCLY11，B錯(cuò)誤；T4DNA連接酶能連接黏性末端，還可以連接平末端，使用T4DNA連接酶能將t-PA改良基因與質(zhì)粒pCLY11連接，C錯(cuò)誤；t-PA能高效降解因血漿纖維蛋白凝聚而成的血栓，成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞在培養(yǎng)基上會(huì)出現(xiàn)具有抗性的白色菌落，D錯(cuò)誤。11.大腸桿菌經(jīng)溶菌酶和洗滌劑處理后，擬核DNA就會(huì)纏繞在細(xì)胞壁碎片上，靜置一段時(shí)間，質(zhì)粒分布在上清液中。利用上述原理可初步獲得質(zhì)粒DNA，分別用限制酶1和限制酶2對提取的質(zhì)粒DNA完全切割后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖所示（注：KB表示千堿基對數(shù)，M代表標(biāo)準(zhǔn)對照）。下列說法正確的是（）A.在提取白色絲狀物時(shí)雙向攪拌比單向攪拌更有利于獲得結(jié)構(gòu)完整的DNAB.將提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液后，加入二苯胺試劑即可呈現(xiàn)藍(lán)色C.若同時(shí)用限制酶1和限制酶2切割該DNA，電泳結(jié)果至少呈現(xiàn)2個(gè)條帶D.用瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒，被染色的質(zhì)粒不需要通過紫光燈照射就能看到結(jié)果【答案】C【解析】在提取白色絲狀物時(shí)單向攪拌更有利于獲得結(jié)構(gòu)完整的DNA，A錯(cuò)誤；將提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液后，加入二苯胺試劑經(jīng)沸水浴加熱后可呈現(xiàn)藍(lán)色，B錯(cuò)誤；利用上述原理可初步獲得質(zhì)粒DNA，分別用限制酶1和限制酶2對提取的質(zhì)粒DNA完全切割后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，質(zhì)粒為環(huán)狀DNA分子，用酶1切割得到2個(gè)DNA片段，說明酶1有2個(gè)切割位點(diǎn)，酶2切割得到1個(gè)DNA片段，說明酶2有0或1個(gè)酶切位點(diǎn)，故若同時(shí)用限制酶1和限制酶2切割該DNA，電泳結(jié)果至少呈現(xiàn)2個(gè)條帶，最多有3個(gè)條帶，C正確；凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒，被染色的質(zhì)粒還需要通過紫外燈照射才能看到結(jié)果，D錯(cuò)誤。12.一種雙鏈DNA分子被三種不同的限制酶切割，切割產(chǎn)物通過電泳分離，用大小已知的DNA片段的電泳結(jié)果作為分子量標(biāo)記（右圖左邊一列）。關(guān)于該雙鏈DNA,下列說法錯(cuò)誤的是（）A.呈環(huán)狀結(jié)構(gòu) B.分子質(zhì)量大小為10kb

C.有一個(gè)NotI和兩個(gè)EcoRI切點(diǎn) D.其NotI切點(diǎn)與EcoRI切點(diǎn)的最短距離為2kb【答案】D【解析】單用EcoRI處理和利用EcoRI和NotI雙酶切時(shí)產(chǎn)生的結(jié)果不同，說明DNA含有NotI酶切位點(diǎn)，因?yàn)橛肗otI處理只產(chǎn)生了一個(gè)10kb的條帶，所以該分子必須是環(huán)狀的，且長度一定是10kb，A正確；B正確；因?yàn)橛肗otI處理只產(chǎn)生了一個(gè)10kb的條帶，說明該環(huán)狀DNA上含有一個(gè)NotI切割位點(diǎn)，單用EcoRI處理后產(chǎn)生了4kb和6kb兩條帶，說明該環(huán)狀DNA上含有2個(gè)EcoRI切割位點(diǎn)，C正確：用EcoRI處理后產(chǎn)生的4kb的片段，進(jìn)一步被NotI酶切為3kb和1kb的片段，可以得知NotI切點(diǎn)與EcoRI切點(diǎn)的最短距離為1kb，最大距離為3kb，D錯(cuò)誤。13.制備熒光標(biāo)記的DNA探針時(shí)，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴(kuò)增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標(biāo)記的dATP)的反應(yīng)管①～④中，分別加入如表所示的適量單鏈DNA。已知形成的雙鏈DNA區(qū)遵循堿基互補(bǔ)配對原則，且在本實(shí)驗(yàn)的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個(gè)連續(xù)堿基對的雙鏈DNA區(qū)。能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針的反應(yīng)管有()A.①② B.②③ C.①④ D.③④【答案】D【解析】制備熒光標(biāo)記的DNA探針時(shí)，需要模板、引物、DNA聚合酶等，①試管中的兩種單鏈能錯(cuò)位配對，但是配對后伸出來的游離的單鏈?zhǔn)?′末端，因缺乏模板，無法利用原料進(jìn)行延伸，因此不能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針，①不符合題意；③試管中的兩種單鏈可以錯(cuò)位局部配對，配對后伸出來的游離單鏈?zhǔn)?′端，是可以彼此提供模板和引物，并且利用堿基被熒光標(biāo)記的dATP進(jìn)行延伸的，③符合題意；②和④試管加的都是1種單鏈DNA，試管中存在兩種可能：一是這條單鏈的3′端回折與自身一部分堿基配對，從而作為引物和模板，，但是配對區(qū)只有5個(gè)堿基對，即使經(jīng)過延伸最終只有8個(gè)堿基對，與題中“本實(shí)驗(yàn)的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個(gè)連續(xù)堿基對的雙鏈DNA區(qū)”這句話相矛盾；二是加入適量同種單鏈，2條相同單鏈之間可以反向互補(bǔ)配對成雙鏈區(qū)。對于②試管，配對后：，配對區(qū)大于9個(gè)堿基對，但因伸出來的模板鏈堿基是AGA，導(dǎo)致延伸時(shí)堿基被熒光標(biāo)記的dATP無法摻入到子鏈合成中去，因此②不符合題意；對于④試管，配對后：，配對區(qū)大于9個(gè)堿基對，且伸出來的模板鏈堿基是TTC，堿基被熒光標(biāo)記的dATP必然可以摻入到子鏈合成中去，④符合題意。綜上，故選D。14.科研人員利用花菜對DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)。使用不同的研磨液過濾提取DNA、加酒精后用不同的去雜質(zhì)方法純化DNA，并進(jìn)行相關(guān)檢測，結(jié)果如下表。的比值可檢查DNA純度，純DNA的為1．8，當(dāng)存在蛋白質(zhì)污染時(shí)，這一比值會(huì)明顯降低。下列說法正確的是（）A.研磨液配置過程中，需用2mol/L的HCl溶液將研磨液調(diào)至弱堿性B.與0．14mol/L相比，用2mol/L的NaCl溶液研磨得到的沉淀物中的DNA濃度更高C.去雜質(zhì)時(shí)應(yīng)用1500r/min的離心轉(zhuǎn)速將DNA沉淀下來，且離心法獲得的純度高D.DNA分子在堿性溶液中加熱降解后可與二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色絡(luò)合物【答案】A【解析】研磨液配置過程中，需用2mol/L的HCl溶液將研磨液調(diào)pH至8．0，呈弱堿性，A正確；表格顯示，2mol/LNaCl研磨后提取的DNA濃度更高（100．6ng/μLvs59．5ng/μL），但這是由于高鹽濃度下DNA溶解度高，雜質(zhì)沉淀更多，而非沉淀物中DNA濃度更高。實(shí)際上，高鹽濃度下DNA溶解于上清液，沉淀物中的DNA更少，B錯(cuò)誤；根據(jù)圖表信息可知，離心法獲得的OD260/OD280比值為1．53，高于靜置法的1．41，說明離心法純度更高，但是研磨液的NaCl濃度不同，所以無法得出去雜質(zhì)時(shí)應(yīng)用1500r/min的離心轉(zhuǎn)速將DNA沉淀下來，且離心法獲得的純度高，C錯(cuò)誤；二苯胺試劑需在酸性條件下與DNA反應(yīng)生成藍(lán)色絡(luò)合物，而非堿性條件，題目中“堿性溶液中加熱降解”的描述與實(shí)驗(yàn)原理不符，D錯(cuò)誤。15.雙脫氧測序法是第一代DNA測序方法。在4支試管中分別加入4種dNTP和少量的1種ddNTP進(jìn)行PCR，再把PCR產(chǎn)物變性，利用電泳進(jìn)行分離，根據(jù)結(jié)果確定特定堿基的位置。通過該方法測定并比較某疾病患者與對照個(gè)體DNA模板鏈的一段堿基序列，結(jié)果如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是（）注：dNTP是PCR的四種原料；雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四種；在DNA聚合酶作用下，ddNTP與dNTP競爭核苷酸鏈延長位點(diǎn)，以加入ddATP的體系為例：若配對的為ddATP，延伸終止；若配對的為dATP，繼續(xù)延伸。A.上述PCR反應(yīng)體系中模板鏈需要足夠多 B.患者該段序列中某位點(diǎn)的堿基C突變?yōu)門

C.5'－TAGTGCCCATC－3'為對照個(gè)體的一段序列 D.沿電泳方向，核苷酸鏈長度逐漸減小【答案】C【解析】在進(jìn)行序列時(shí)，模板量的數(shù)量需要足夠多，以確保測序的準(zhǔn)確性和可測性。如果模板DNA量不足，可能會(huì)導(dǎo)致測序結(jié)果不準(zhǔn)確或無法進(jìn)行，A正確；患者的測序結(jié)果為5'-CTACCTGTGAT-3'，對照個(gè)體的測序結(jié)果為5'-CTACCCGTGAT-3'，對比患者和對照個(gè)體的測序結(jié)果可知，患者該段序列中某位點(diǎn)的堿基C突變?yōu)門，B正確；依據(jù)雙脫氧測序法的原理，可以確定每個(gè)泳道中的條帶（DNA片段）的3'終端的堿基，如+ddATP的泳道中出現(xiàn)的條帶（DNA片段）的3'終端堿基就是A。另外由于每個(gè)片段的起始點(diǎn)相同，但終止點(diǎn)不同，因此可以通過比較片段的長度來確定DNA序列中每個(gè)位置上的堿基；圖示電泳方向?yàn)閺纳稀?，即對?yīng)的DNA片段為長→短，則對應(yīng)的DNA測序結(jié)果為3'→5'，如對照個(gè)體的電泳結(jié)果最短的條帶為+ddCTP泳道組的條帶，則說明該DNA片段5'端第一個(gè)堿基為C；因此對照個(gè)體的測序結(jié)果為5'-CTACCCGTGAT-3'，C錯(cuò)誤；電泳時(shí)，產(chǎn)物的片段越大，遷移速率越慢，故據(jù)圖可知沿電泳方向，核苷酸鏈長度逐漸減小，D正確。二、多選題16.反向PCR是一種通過已知序列設(shè)計(jì)引物對未知序列進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，其過程如下圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的有（）A.應(yīng)選擇引物1和引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增B.設(shè)計(jì)的引物中GC堿基含量越高，退火溫度越低C.PCR產(chǎn)物是包含所有已知序列和未知序列的環(huán)狀DNA分子D.整個(gè)過程需用到限制酶、DNA連接酶、耐高溫DNA聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄酶【答案】BCD【解析】DNA子鏈合成的方向?yàn)?'端到3'端，引物需要與模板的3'端結(jié)合，該過程需要對未知序列進(jìn)行擴(kuò)增，因此要通過已知序列設(shè)計(jì)引物對未知序列進(jìn)行擴(kuò)增，故應(yīng)選擇引物1和引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，A正確；G與C之間有3個(gè)氫鍵，A與T之間有2個(gè)氫鍵，故GC堿基含量越高，堿基對間氫鍵的含量越多，退火的溫度越高，B錯(cuò)誤；PCR產(chǎn)物是包含所有已知序列和未知序列的鏈狀DNA分子，C錯(cuò)誤；整個(gè)過程需用到限制酶、DNA連接酶和耐高溫DNA聚合酶，不需要逆轉(zhuǎn)錄酶，D錯(cuò)誤。故選BCD。17.大腸桿菌經(jīng)溶菌酶和洗滌劑處理后，擬核DNA就會(huì)纏繞在細(xì)胞壁碎片上，靜置一段時(shí)間，質(zhì)粒分布在上清液中，利用上述原理可初步獲得質(zhì)粒DNA。用三種限制酶處理提取的產(chǎn)物，電泳結(jié)果如圖所示。下列敘述正確的是（）A.可利用DNA在酒精中溶解度較大的特點(diǎn)來提取質(zhì)粒DNAB.將提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液后，可用二苯胺試劑進(jìn)行鑒定C.凝膠中的DNA分子通過染色，可在紫外燈下被檢測出來D.根據(jù)電泳結(jié)果，質(zhì)粒上沒有限制酶I和II的切割位點(diǎn)，有限制酶Ⅲ的切割位點(diǎn)【答案】BC【解析】蛋白質(zhì)可溶于酒精，而DNA在冷酒精中溶解度很低，所以在提取DNA時(shí)加入酒精，使溶于酒精的蛋白質(zhì)等物質(zhì)溶解，而讓DNA析出，A錯(cuò)誤；由于DNA在2mol/LNaCl溶液中溶解度較大，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，所以將提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液后，可用二苯胺試劑在沸水條件進(jìn)行鑒定，B正確；凝膠中的DNA分子通過染色，可在紫外燈下出現(xiàn)一定的顏色特征，從而被檢測出來，C正確；因?yàn)橘|(zhì)粒的本質(zhì)是環(huán)狀的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ處理后電泳只有一條條帶，可能是該質(zhì)粒上有一個(gè)切割位點(diǎn)，也可能沒有切割位點(diǎn)，D錯(cuò)誤。故選BC。18.關(guān)于“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”（實(shí)驗(yàn)1）和“DNA的粗提取與鑒定”（實(shí)驗(yàn)2）的實(shí)驗(yàn)操作，下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）A.實(shí)驗(yàn)1中，DNA電泳時(shí)需要在瓊脂糖熔化之后凝固之前加入核酸染料B.實(shí)驗(yàn)1中，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，加樣前應(yīng)先接通電源C.實(shí)驗(yàn)2中，取洋蔥研磨液的上清液，加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為70%的冷酒精后析出DNAD.實(shí)驗(yàn)2中，需先將白色絲狀物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺試劑并進(jìn)行沸水浴，用于鑒定DNA【答案】BC【解析】DNA電泳鑒定時(shí)需要在瓊脂糖熔化之后尚未完全凝固之前加入核酸染料，預(yù)先將染料加入凝膠中，可使電泳分離后的DNA分子在凝膠中能充分染色，A正確；進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳時(shí)，應(yīng)在加樣后再接通電源，B錯(cuò)誤；實(shí)驗(yàn)2中，取洋蔥研磨液的上清液，加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精（或冷的無水乙醇）后析出DNA，C錯(cuò)誤；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色，因此實(shí)驗(yàn)2中需先將白色絲狀物（析出的DNA）溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺試劑并進(jìn)行沸水浴，用于鑒定DNA，D正確。19.熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測樣本中某種DNA含量，其原理是：在PCR反應(yīng)體系中每加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)與某條模板鏈部分互補(bǔ)的熒光探針，在PCR反應(yīng)過程中，子鏈延伸至熒光探針處，TaqDNA聚合酶會(huì)將其水解以便繼續(xù)催化合成子鏈；熒光探針?biāo)夂蟀l(fā)出的熒光可被熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到，且每擴(kuò)增一個(gè)DNA，就有一個(gè)熒光分子生成。如圖為熒光定量PCR技術(shù)的部分過程，下列說法正確的是（）A.TaqDNA聚合酶與模板結(jié)合時(shí)遵循堿基互補(bǔ)配對原則 B.若用cDNA作模板，上述技術(shù)也可估計(jì)某基因的轉(zhuǎn)錄效率

C.探針完整時(shí)，有熒光，Taq酶延伸至探針處時(shí)切斷探針，熒光消失 D.達(dá)到某熒光強(qiáng)度所需的循環(huán)次數(shù)與起始模板DNA量呈負(fù)相關(guān)【答案】BD【解析】TaqDNA聚合酶的作用是催化脫氧核苷酸聚合形成子鏈，其與模板結(jié)合時(shí)不遵循堿基互補(bǔ)配對原則，A錯(cuò)誤；cDNA由mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測cDNA的量，可反映對應(yīng)mRNA的量，進(jìn)而估計(jì)某基因的轉(zhuǎn)錄效率，B正確；根據(jù)題意，熒光探針?biāo)夂蟛虐l(fā)出熒光，完整時(shí)無熒光，Taq酶切斷探針后熒光出現(xiàn)，C錯(cuò)誤；起始模板DNA量越多，達(dá)到某熒光強(qiáng)度所需的循環(huán)次數(shù)越少，二者呈負(fù)相關(guān)，D正確。三、非選擇題20.蝦青素可由β-胡蘿卜素在β-胡蘿卜素酮化酶（BKT）和β-胡蘿卜素羥化酶（CRTR-B）的作用下轉(zhuǎn)化而來，具有抗衰老、增強(qiáng)免疫等功能。杜氏鹽藻是單細(xì)胞浮游植物，生長快，易培養(yǎng)，能大量合成β-胡蘿卜素?？蒲腥藛T利用“無縫克隆技術(shù)”（如圖1）構(gòu)建含BKT基因和CRTR-B基因的表達(dá)載體（如圖2，3），導(dǎo)入杜氏鹽藻，以實(shí)現(xiàn)蝦青素的工廠化生產(chǎn)，回答下列問題。（1）獲取目的基因：紅球藻是天然蝦青素的重要來源，提取紅球藻的總DNA為_____，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增BKT基因和CRTR-B基因，此過程需要_____（至少寫兩種）。（2）構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體：①PCR獲取抗除草劑基因過程中，為確?；騼啥司哂兴柰葱蛄?，需在引物的一端添加對應(yīng)的同源序列。若將來需要將抗除草劑基因能夠從重組質(zhì)粒中切除，還需要在基因兩側(cè)加入限制酶識(shí)別序列，則擴(kuò)增抗除草劑基因時(shí)，設(shè)計(jì)的引物序列（5，→3，）為_____。A．抗除草劑基因部分序列＋限制酶識(shí)別序列＋同源序列B．同源序列＋抗除草劑基因部分序列＋限制酶識(shí)別序列C．同源序列＋限制酶識(shí)別序列＋抗除草劑基因部分序列②科研人員利用“無縫克隆技術(shù)”同時(shí)將BKT基因和CRTR-B基因插入質(zhì)粒，形成的重組質(zhì)粒對應(yīng)部位如圖2所示，推測此過程擴(kuò)增CRTR-B基因所用的引物為_____。③最終形成的重組質(zhì)粒如圖3所示，其中atpA啟動(dòng)子和psbA啟動(dòng)子均為杜氏鹽藻葉綠體啟動(dòng)子，選用內(nèi)源性啟動(dòng)子的目的是_____。（3）準(zhǔn)備受體細(xì)胞：選取初始杜氏鹽藻涂布到杜氏鹽藻固體培養(yǎng)基進(jìn)行第一次培養(yǎng)，一段時(shí)間后，挑取生長良好的單藻落到杜氏鹽藻液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。期間可取藻液滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，第二次培養(yǎng)的目的是_____。（4）目的基因?qū)爰跋嚓P(guān)檢測：采用基因槍法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入杜氏鹽藻葉綠體，一段時(shí)間后，先用含_____的培養(yǎng)基初篩已轉(zhuǎn)化的杜氏鹽藻，然后采用_____技術(shù)檢測是否成功轉(zhuǎn)錄出β-胡蘿卜素酮化酶和β-胡蘿卜素羥化酶的mRNA。（5）葉綠體轉(zhuǎn)化是植物基因工程的新熱點(diǎn)，葉綠體的諸多特點(diǎn)為葉綠體轉(zhuǎn)化提供優(yōu)勢，如葉綠體基因組小，功能清晰，使基因操作方便；葉綠體具有自我復(fù)制功能，一個(gè)植物細(xì)胞可含有多個(gè)葉綠體，每個(gè)葉綠體中含有多個(gè)基因組，可大大提高_(dá)____；另外，葉綠體基因位于細(xì)胞質(zhì)中，可有效避免_____?！敬鸢浮浚?）模板dNTP、耐高溫的DNA聚合酶、緩沖液等（2）C⑥⑧確保目的基因正常表達(dá)（3）擴(kuò)大培養(yǎng)杜氏鹽藻（4）除草劑PCR（分子雜交）（5）目的基因的表達(dá)量基因污染【解析】（1）因紅球藻是天然蝦青素的重要來源，是目的基因的來源，故可提取紅球藻的總DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增其DNA中的BKT基因和CRTR-B基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此過程需要TaqDNA聚合酶（耐高溫DNA聚合酶）的催化，同時(shí)還需要dNTP、緩沖液等。（2）①根據(jù)PCR擴(kuò)增的原理，在PCR過程中，為確?；騼啥司哂兴柰葱蛄?，需在5’端添加對應(yīng)的同源序列；根據(jù)題意，若要確?？钩輨┗蚰軌驈闹亟M質(zhì)粒中切除，則所需引物（5’一3’）的序列應(yīng)為“同源序列十限制酶識(shí)別序列十特異性擴(kuò)增引物序列（抗除草劑基因部分序列）”，C正確．②根據(jù)圖2所示，要通過“無縫克隆法”同時(shí)將BKT基因和CRTR-B基因插入質(zhì)粒，則要保證BKT基因一側(cè)有一致同源序列，另一側(cè)能帶上CRTR-B基因，因此擴(kuò)增BKT基因所用的引物為①③；同理，擴(kuò)增CRTR-B基因所用的引物為⑥⑧。③啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄的起始信號，選用內(nèi)源性啟動(dòng)子的目的是防止基因沉默，確保目的基因能表達(dá)。（3）選取初始杜氏鹽藻涂布到杜氏鹽藻固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的目的是純化杜氏鹽藻，挑取生長狀態(tài)良好的單藻落到杜氏鹽藻液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)的目的是擴(kuò)大培養(yǎng)杜氏鹽藻。（4）采用基因槍法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入杜氏鹽藻葉綠體，一段時(shí)間后，用含除草劑的選擇培養(yǎng)基篩選已轉(zhuǎn)化的杜氏鹽藻；而后再通過抗原—抗體雜交實(shí)驗(yàn)檢測是否成功表達(dá)β-胡蘿卜素酮化酶和β-胡蘿卜素羥化酶。（5）因每個(gè)葉綠體中含有多個(gè)基因組，可大大提高目的基因的表達(dá)量；且葉綠體基因位于細(xì)胞質(zhì)中，一般不能穩(wěn)定遺傳，因此可避免基因污染。21.為篩選出能與SARS病毒的S蛋白特異性結(jié)合的受體蛋白，研究人員利用基因工程技術(shù)，在S蛋白末端添加TAP標(biāo)簽（能特異性地與人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)IgG類抗體結(jié)合）形成S-TAP融合蛋白，再利用該標(biāo)簽在病毒敏感細(xì)胞中純化出S蛋白及其相互作用的蛋白質(zhì)，部分過程如圖?；卮鹣铝袉栴}。注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶識(shí)別序列，各限制酶識(shí)別序列及切割后產(chǎn)生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示啟動(dòng)子；Kozak序列是調(diào)控基因表達(dá)的重要序列且不含限制酶識(shí)別序列。（1）為成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR擴(kuò)增S基因時(shí)，需在F引物的5'端外側(cè)依次添加_______序列。PCR時(shí)新合成鏈的延伸方向是_______（填“5′→3′”或“3′→5′”）。（2）使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，DNA分子的遷移速率與______有關(guān)。（3）在該重組質(zhì)粒pcDNA3．1-S-TAP中，T7的作用是_______，重組質(zhì)粒中還應(yīng)該有的結(jié)構(gòu)有______。（4）為檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中是否表達(dá)出了S-TAP融合蛋白，科研人員將轉(zhuǎn)染細(xì)胞置于載玻片，洗滌、固定后，滴加帶有熒光標(biāo)記的______稀釋液，熒光顯微鏡下觀察，若出現(xiàn)熒光標(biāo)記，則說明轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)出了S-TAP融合蛋白?！敬鸢浮浚?）Kozak和SmaⅠ酶5′→3′（2）凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象（3）RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)（4）IgG類抗體【解析】（1）依題意，Kozak序列是調(diào)控基因表達(dá)的重要序列且不含限制酶識(shí)別序列，T7表示啟動(dòng)子，根據(jù)構(gòu)建的重組質(zhì)粒圖示可分析，在S基因的上游加入了Kozak序列以調(diào)控S基因表達(dá)，故要在F引物的5'端外側(cè)添加Kozak序列；目的基因和質(zhì)粒要連接構(gòu)成表達(dá)載體，根據(jù)T7啟動(dòng)子的方向及質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)可知，S基因上游不能用XhoI（S基因會(huì)被XhoI酶切），應(yīng)該有用Smal酶切，故F引物的5'端外側(cè)還要添加SmaI酶識(shí)別序列；PCR是體外DNA復(fù)制技術(shù)，DNA復(fù)制的方向是新鏈的5′→3′，故PCR時(shí)新合成鏈的延伸方向是5′→3′。（2）PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。（3）依題意，T7表示啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。基因表達(dá)載體是載體的一種，包含目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)等。結(jié)合圖示可知，基因表達(dá)載體中已有啟動(dòng)子、目的基因，還應(yīng)有的結(jié)構(gòu)是終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)。（4）依題意，S蛋白末端添加TAP標(biāo)簽?zāi)芴禺愋缘嘏c人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)IgG類抗體結(jié)合，若要檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中是否表達(dá)出了S-TAP融合蛋白，可滴加帶有熒光標(biāo)記的IgG類抗體稀釋液，置熒光顯微鏡下觀察，若出現(xiàn)熒光標(biāo)記，則說明轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)出了S-TAP融合蛋白。22.TRE元件是一種特定的DNA序列，由多個(gè)四環(huán)素操縱子（tetO）串聯(lián)組成。TetR（四環(huán)素阻遏蛋白）是大腸桿菌中的一種蛋白質(zhì)，含有DNA結(jié)合域，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合TRE序列。在沒有四環(huán)素的情況下，TetR與TRE結(jié)合，抑制基因表達(dá)；在四環(huán)素存在時(shí)，TetR與之結(jié)合，釋放TRE，允許基因表達(dá)。通過基因工程手段，TetR可以被改造成不同的形式，如tTA和rtTA?；卮鹣铝袉栴}：（1）TRE、TetR的基本組成單位分別是_____、_____。（2）四環(huán)素（Tet）誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是一種基于大腸桿菌的Tet抗性所建立的用于誘導(dǎo)基因表達(dá)的調(diào)控系統(tǒng)，分為抑制型系統(tǒng)（Tet-off）和激活型系統(tǒng)（Tet-on）。①結(jié)合下圖分析，tTA、rtTA與TRE結(jié)合后對Tet抗性基因表達(dá)的影響是：_____、_____（從“促進(jìn)”“抑制”中選填）。四環(huán)素與tTA、rtTA結(jié)合后_____（從“可以”“不可以”中選填）改變其構(gòu)象。若要使Tet抗性基因在非調(diào)控狀態(tài)處于表達(dá)狀態(tài)，應(yīng)選擇的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是_____。②tTA：通過將TetR與單純皰疹病毒的VP16（病毒粒子蛋白16）的C端結(jié)構(gòu)域融合而成的。rtTA：通過改變幾個(gè)對四環(huán)素依賴抑制有重要作用的氨基酸殘基，從而導(dǎo)致了一種反Tet阻遏物（rTetR）的產(chǎn)生，再將rTetR與VP16融合得到rtTA．推測產(chǎn)生tTA和rtTA的變異類型分別是_____、_____。（3）下圖所示為科研人員預(yù)期的轉(zhuǎn)基因成功的小鼠（gL）體內(nèi)細(xì)胞—細(xì)胞接觸的信號通路：將綠色熒光蛋白（GFP）設(shè)計(jì)為信號分子，αGFP-N-tTA融合蛋白為_____，完成細(xì)胞間的信息交流。操作時(shí)需獲得以心肌細(xì)胞作為信號發(fā)送細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因小鼠，為保證在心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)GFP，表達(dá)載體中應(yīng)含有_____，構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)需要用到的工具酶有_____。將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入小鼠的_____中，同樣方法獲得內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)αGFP-N-tTA的轉(zhuǎn)基因小鼠。將上述兩種轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，經(jīng)篩選獲得gL小鼠。在gL小鼠中，科研人員使用LacZ基因作為報(bào)告基因。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞與心肌細(xì)胞接觸時(shí)，由于GFP和aGFP-N-tTA結(jié)合，引起_____，進(jìn)入細(xì)胞核與tetO結(jié)合，啟動(dòng)LacZ基因表達(dá)，使正在與心肌細(xì)胞接觸的內(nèi)皮細(xì)胞呈藍(lán)色?！敬鸢浮浚?）脫氧核苷酸氨基酸（2）促進(jìn)促進(jìn)可以抑制型系統(tǒng)（Tet-off）基因重組基因重組和基因突變（3）受體心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)基因的啟動(dòng)子限制酶和DNA連接酶受精卵受體被切斷，tTA被釋放【解析】（1）TRE元件是一種特定的DNA序列，基本組成單位是脫氧核苷酸。TetR（四環(huán)素阻遏蛋白）是大腸桿菌中的一種蛋白質(zhì)，基本組成單位是氨基酸。（2）①從圖中信息可知，tTA和rtTA對Tet抗性基因表達(dá)的調(diào)控受四環(huán)素影響。在無四環(huán)素時(shí)，tTA可結(jié)合到TRE上，促進(jìn)Tet抗性基因表達(dá)；有四環(huán)素時(shí)。tTA與四環(huán)素結(jié)合后失去與TRE的結(jié)合能力，抑制該基因表達(dá)，即四環(huán)素改變tTA構(gòu)象使其無法促進(jìn)基因表達(dá)。rtTA的情況則相反，無四環(huán)素時(shí)，它無法發(fā)揮促進(jìn)Tet抗性基因表達(dá)的作用；存在四環(huán)素時(shí)，rtTA與四環(huán)素結(jié)合后能結(jié)合TRE，進(jìn)而促進(jìn)基因表達(dá)，也就是四環(huán)素改變r(jià)tTA構(gòu)象，使其可以與TRE結(jié)合。若期望Tet抗性基因在不添加四環(huán)素的非調(diào)控狀態(tài)下表達(dá)，應(yīng)選擇抑制型系統(tǒng)（Tet-off），因?yàn)榇讼到y(tǒng)中，無四環(huán)素時(shí)tTA能結(jié)合TRE，從而促進(jìn)基因表達(dá)。②tTA是通過將TetR與單純皰疹病毒的VP16的C端結(jié)構(gòu)域融合而成的，這一過程屬于基因工程中的操作，是將不同來源的基因進(jìn)行組合，其變異類型為基因重組。rtTA的產(chǎn)生，首先是TetR的四環(huán)素結(jié)合部位發(fā)生了幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸的突變，這是由于基因序列發(fā)生改變導(dǎo)致的，屬于基因突變；之后又將產(chǎn)生的反Tet阻遏物（rTetR）與VP16融合得到rtTA，這一融合過程又涉及到基因工程中的基因重組操作，所以產(chǎn)生rtTA的變異類型包含基因重組和基因突變。（3）依題意，GFP與αGFP-N-tTA融合蛋白結(jié)合，完成細(xì)胞間的信息交流，GFP為信息分子，則αGFP-N-tTA融合蛋白為受體。啟動(dòng)子是一段有特殊序列的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。因此，為保證在心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)GFP，表達(dá)載體中應(yīng)含有心肌細(xì)胞中特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子。高度分化的動(dòng)物細(xì)胞無全能性，要獲得小鼠個(gè)體，只能由受精卵發(fā)育而成。因此，基因表達(dá)載體應(yīng)導(dǎo)入小鼠的受精卵中。由圖示可知GFP和αGFP-N-tTA結(jié)合后，αGFP-N-tTA融合蛋白位于的信號接收細(xì)胞獲得信息，αGFP-N-tTA融合蛋白作為受體被切斷，使tTA被釋放，進(jìn)入細(xì)胞核與tetO結(jié)合，啟動(dòng)LacZ基因表達(dá)，使正在與心肌細(xì)胞接觸的內(nèi)皮細(xì)胞呈藍(lán)色。23.隨著對CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究，越來越多的Cas9變體被發(fā)掘。CRISPR/Cas12a系統(tǒng)是近幾年研究正熱的系統(tǒng)，該系統(tǒng)是由crRNA和Cas12a（Cpf1）蛋白形成的復(fù)合體。crRNA能特異性識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，引導(dǎo)Cas12a蛋白到相應(yīng)位置剪切DNA。圖1是CRISPR/Cas9系統(tǒng)、CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的工作原理示意圖。請回答下列問題。注：PAM是一種短DNA序列，N表示任意堿基。PAM可以幫助Cas9、Cas12a識(shí)別和切割目標(biāo)DNA序列?！啊北硎驹谙鄳?yīng)位置剪切DNA。（1）Cas9是一種核酸內(nèi)切酶，能與_______組成的sgRNA（向?qū)NA）構(gòu)成復(fù)合體，該復(fù)合體能與DNA分子特定堿基序列結(jié)合。Cas9催化_______水解，從而使DNA在PAM序列的上游被切斷。一般來說，在使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對不同基因進(jìn)行編輯時(shí)，應(yīng)使用Cas9和_______（填“相同”或“不同”）的sgRNA結(jié)合構(gòu)成復(fù)合體進(jìn)行相關(guān)基因的編輯。（2）在CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中，crRNA序列與目的基因特定堿基序列部分結(jié)合，結(jié)合區(qū)域最多含_______種核苷酸。與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中的_______能獨(dú)立發(fā)揮引導(dǎo)功能，切割DNA后形成的是_______（填“黏性”或“平”）末端。（3）某科研團(tuán)隊(duì)基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)對宮頸癌細(xì)胞中的KIFC1基因進(jìn)行敲除，來探討KIFCI基因在宮頸癌細(xì)胞中的功能及對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響。他們利用crRNA對應(yīng)基因序列和PX458質(zhì)粒（如圖2）構(gòu)建crRNA/Cas12a重組載體，轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究。①為保證crRNA對應(yīng)的基因序列與PX458質(zhì)粒正確連接，應(yīng)在擴(kuò)增該基因序列的一對引物的5'端分別添加________兩種限制酶的識(shí)別序列。其中P1的堿基序列為5'_______3'（寫出前9個(gè)堿基，2分）。PX458質(zhì)粒中利用U6、CMV兩個(gè)啟動(dòng)子，而不共用同一個(gè)啟動(dòng)子的目的是_______。②將crRNA/Cas12a重組載體成功轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中KIFCl蛋白表達(dá)量，細(xì)胞數(shù)目的變化如圖3所示，由此得出結(jié)論是_______。判斷依據(jù)是：_______，證明HeLa細(xì)胞中KIFC1基因敲除成功；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目顯著低于對照組，表明KIFC1敲除可參照蛋白使HeLa細(xì)胞增殖能力下降。【答案】（1）tracrRNA、crRNA磷酸二酯鍵不同（2）8crRNA黏性（3）PvitII、EcoRICAGCTGCTC實(shí)現(xiàn)兩種基因的獨(dú)立表達(dá)，有利于crRNA、Cas12a各自發(fā)揮作用KIFC1基因可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)組的KIFC1蛋白表達(dá)量明顯下降，（兩組的參照蛋白表達(dá)量沒有明顯差異）【解析】（1）結(jié)合圖示可知，Cas9能與tracrRNA、crRNA組成的sgRNA（向?qū)NA）構(gòu)成復(fù)合體，該復(fù)合體能與DNA分子特定堿基序列結(jié)合。DNA相鄰核苷酸之間通過磷酸二酯鍵相連，Cas9催化磷酸二酯鍵水解，從而使DNA在PAM序列的上游被切斷。sgRNA的組成部分之一是crRNA，crRNA通過堿基互補(bǔ)配對原則與目標(biāo)基因的堿基序列互補(bǔ)配對，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的切割，不同的基因核苷酸序列不同，因此需要使用Cas9和不同的sgRNA結(jié)合構(gòu)成復(fù)合體進(jìn)行相關(guān)基因的編輯。crRNA與目的基因部分結(jié)合，結(jié)合區(qū)域含單鏈DNA和RNA，DNA基本單位是四種脫氧核苷酸，RNA是四種核糖核苷酸，所以結(jié)合區(qū)域最多有8種核苷酸。對比圖示兩種系統(tǒng)，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的crRNA能獨(dú)立引導(dǎo)，切割DNA形成黏性末端。（3）①質(zhì)粒上含有3種限制酶識(shí)別序列，若選擇KpnI限制酶識(shí)別序列，對質(zhì)粒進(jìn)行切割時(shí)會(huì)破壞Cas12a基因，因此應(yīng)選擇PvitII、EcoRI對質(zhì)粒進(jìn)行酶切獲得黏性末端，保證目的基因準(zhǔn)確接入完成轉(zhuǎn)錄，應(yīng)在擴(kuò)增該基因序列的一對引物的5'端分別添加PvitII、EcoRI兩種限制酶的識(shí)別序列。