《GB/T36810-2018草莓枯萎病菌檢疫鑒定方法》

專題研究報(bào)告目錄聚焦檢疫核心:草莓枯萎病菌為何成為GB/T36810-2018的防控關(guān)鍵?專家視角解析標(biāo)準(zhǔn)制定邏輯樣本是基礎(chǔ):檢疫樣本如何科學(xué)采集與處理?GB/T36810-2018規(guī)范流程規(guī)避鑒定誤差的核心要點(diǎn)培養(yǎng)與純化:如何為病菌“搭好家”?GB/T36810-2018推薦培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的優(yōu)化邏輯致病性測(cè)定:如何驗(yàn)證病菌“

殺傷力”?標(biāo)準(zhǔn)方法下的致病性判定與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系標(biāo)準(zhǔn)落地:檢疫實(shí)踐中如何高效應(yīng)用?結(jié)合未來5年草莓產(chǎn)業(yè)趨勢(shì)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施路徑分析追本溯源:草莓枯萎病菌的生物學(xué)特性如何?標(biāo)準(zhǔn)框架下的病原識(shí)別與風(fēng)險(xiǎn)預(yù)判深度剖析形態(tài)鑒定:顯微鏡下的“

密碼”是什么?標(biāo)準(zhǔn)明確的病菌形態(tài)特征與鑒別要點(diǎn)實(shí)操指南分子鑒定:基因?qū)用嫒绾尉珳?zhǔn)“驗(yàn)身”?標(biāo)準(zhǔn)中PCR技術(shù)應(yīng)用的科學(xué)性與前瞻性解讀結(jié)果判定與記錄:鑒定結(jié)論如何嚴(yán)謹(jǐn)出具?GB/T36810-2018規(guī)范下的結(jié)果確認(rèn)與檔案管理與時(shí)俱進(jìn):GB/T36810-2018將如何迭代?應(yīng)對(duì)新病害風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)準(zhǔn)完善方向與專家建聚焦檢疫核心：草莓枯萎病菌為何成為GB/T36810-2018的防控關(guān)鍵？專家視角解析標(biāo)準(zhǔn)制定邏輯草莓枯萎病菌：威脅產(chǎn)業(yè)發(fā)展的“隱形殺手”01草莓枯萎病菌是典型土傳維管束病害病原，可導(dǎo)致草莓植株萎蔫、葉片黃化、根莖腐爛，發(fā)病率最高達(dá)80%，嚴(yán)重地塊絕收。其傳播途徑廣，可隨種苗、土壤、灌溉水?dāng)U散，一旦定植帶菌種苗，會(huì)在田間持續(xù)蔓延，且防治難度大，對(duì)草莓產(chǎn)業(yè)造成毀滅性打擊，這是標(biāo)準(zhǔn)將其列為重點(diǎn)檢疫對(duì)象的核心原因。02（二）標(biāo)準(zhǔn)制定的時(shí)代背景：產(chǎn)業(yè)升級(jí)倒逼檢疫規(guī)范化2018年前，草莓枯萎病菌鑒定缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各地檢疫方法差異大，導(dǎo)致誤判、漏判頻發(fā)。隨著我國草莓種植規(guī)?；?、種苗流通市場(chǎng)化，跨區(qū)域傳播風(fēng)險(xiǎn)劇增，亟需統(tǒng)一技術(shù)規(guī)范。GB/T36810-2018的出臺(tái)，填補(bǔ)了行業(yè)空白，為檢疫工作提供了權(quán)威依據(jù)。（三）專家視角：標(biāo)準(zhǔn)制定的核心邏輯與防控價(jià)值從植物檢疫學(xué)角度，標(biāo)準(zhǔn)以“預(yù)防為主、源頭管控”為核心，通過明確鑒定方法，實(shí)現(xiàn)病菌早發(fā)現(xiàn)、早處置。其價(jià)值不僅在于阻斷傳播鏈條，更在于為種苗繁育、產(chǎn)地檢疫提供技術(shù)支撐，助力草莓產(chǎn)業(yè)從“事后補(bǔ)救”向“事前預(yù)防”轉(zhuǎn)型，保障產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。、追本溯源：草莓枯萎病菌的生物學(xué)特性如何？標(biāo)準(zhǔn)框架下的病原識(shí)別與風(fēng)險(xiǎn)預(yù)判深度剖析病原分類地位：標(biāo)準(zhǔn)明確的病菌“身份信息”GB/T36810-2018界定，草莓枯萎病菌為半知菌亞門絲孢綱瘤座孢目鐮孢屬的尖孢鐮孢菌草莓?；停W(xué)名FusariumoxysporumSchltdl.f.sp.fragariaeWinks&Williams。該分類定位是精準(zhǔn)鑒定的基礎(chǔ)，避免與其他鐮孢菌專化型混淆。（二）核心生物學(xué)特性：病菌存活與傳播的“關(guān)鍵密碼”病菌菌絲無色具隔，分生孢子有大小兩型：小型分生孢子橢圓形，無隔或單隔；大型分生孢子鐮刀形，3-5隔。其厚垣孢子可在土壤中存活5-10年，耐低溫、干旱，在15-30℃范圍內(nèi)均可生長，25-28℃為適宜發(fā)病溫度，這些特性決定了其持久侵染能力。結(jié)合病菌特性，檢疫需聚焦種苗調(diào)運(yùn)（帶菌主載體）、連作地塊（病菌積累區(qū)）及高溫高濕產(chǎn)區(qū)（發(fā)病適宜環(huán)境）。標(biāo)準(zhǔn)通過明確特性指標(biāo)，為檢疫人員劃定風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域與對(duì)象，提升預(yù)判精準(zhǔn)度，提前布設(shè)防控防線。02（三）風(fēng)險(xiǎn)預(yù)判：基于生物學(xué)特性的檢疫重點(diǎn)方向01、樣本是基礎(chǔ)：檢疫樣本如何科學(xué)采集與處理？GB/T36810-2018規(guī)范流程規(guī)避鑒定誤差的核心要點(diǎn)樣本采集原則：標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)的“代表性與典型性”標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定采集需遵循“隨機(jī)抽樣、病健結(jié)合”原則。種苗樣本按批次抽取，每批次抽取量不低于0.1%且不少于50株；田間樣本需在發(fā)病中心及周邊采集典型病株，同時(shí)采集健康植株作對(duì)照，確保樣本能反映整體檢疫對(duì)象的病菌攜帶情況。12（二）不同場(chǎng)景采樣方法：種苗、田間與土壤的采集規(guī)范種苗采集需剪取根莖部2-3cm組織；田間病株采集整株，重點(diǎn)保留根莖交界部；土壤樣本采用五點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)取0-20cm土層，混合后取500g。每種樣本均需標(biāo)注來源、時(shí)間、品種等信息，避免混淆。（三）樣本處理關(guān)鍵步驟：避免污染與病菌失活的操作技巧樣本采集后24小時(shí)內(nèi)處理，種苗與病株組織需用無菌水沖洗，再用75%酒精表面消毒30秒，無菌水沖洗3次；土壤樣本需風(fēng)干、過2mm篩去除雜質(zhì)。處理過程全程無菌操作，防止雜菌污染，保障后續(xù)鑒定準(zhǔn)確性。12、形態(tài)鑒定：顯微鏡下的“密碼”是什么？標(biāo)準(zhǔn)明確的病菌形態(tài)特征與鑒別要點(diǎn)實(shí)操指南制片技術(shù)：標(biāo)準(zhǔn)推薦的臨時(shí)裝片制作方法采用挑取法：從培養(yǎng)好的菌落邊緣挑取少量菌絲及孢子，置于滴有無菌水或乳酚油的載玻片上，輕輕攤開，加蓋蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。若觀察厚垣孢子，需用棉藍(lán)染色液染色，增強(qiáng)觀察效果，該方法操作簡便，適合快速初步鑒定。12（二）核心形態(tài)鑒別特征：顯微鏡下的“識(shí)別要點(diǎn)”A標(biāo)準(zhǔn)明確鑒別核心：大型分生孢子頂端尖細(xì)，基部有足細(xì)胞，3隔者最常見，大小為25-50μm×3-5μm；小型分生孢子成串產(chǎn)生，大小5-12μm×2-3μm；厚垣孢子圓形，壁厚，單生或雙生。需與尖孢鐮孢菌其他?；蛯?duì)比，重點(diǎn)區(qū)分孢子大小與形態(tài)差異。B（三）形態(tài)鑒定的局限性與互補(bǔ)措施01形態(tài)鑒定易受培養(yǎng)條件影響，存在誤判可能。標(biāo)準(zhǔn)要求當(dāng)形態(tài)特征不明確時(shí)，需結(jié)合分子鑒定或致病性測(cè)定進(jìn)一步確認(rèn)，形成“形態(tài)初篩+精準(zhǔn)驗(yàn)證”的鑒定體系，彌補(bǔ)單一方法的不足，提升鑒定可靠性。02、培養(yǎng)與純化：如何為病菌“搭好家”？GB/T36810-2018推薦培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的優(yōu)化邏輯首選培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基的配方與制備規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)推薦馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配方為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15-20g、水1000mL。制備時(shí)馬鈴薯去皮切塊煮沸30分鐘，過濾取汁，加入其他成分溶解，121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻至50℃左右倒平板，確保培養(yǎng)基無菌且營養(yǎng)適宜。（二）選擇性培養(yǎng)基：抑制雜菌的“專屬領(lǐng)地”針對(duì)污染嚴(yán)重的樣本，標(biāo)準(zhǔn)推薦使用鐮孢菌選擇性培養(yǎng)基（如Komada培養(yǎng)基），其含有的抗生素與化學(xué)試劑可抑制細(xì)菌及其他真菌生長，僅允許鐮孢菌生長，便于從復(fù)雜樣本中分離目標(biāo)病菌，提高分離效率。12（三）優(yōu)化培養(yǎng)條件：溫度、濕度與光照的精準(zhǔn)控制培養(yǎng)溫度控制在25±1℃,采用黑暗培養(yǎng)或散射光培養(yǎng)，避免強(qiáng)光直射。培養(yǎng)基濕度通過滅菌后的冷卻條件控制，平板凝固后表面濕潤無積液。培養(yǎng)3-5天后觀察菌落形態(tài)，7天左右進(jìn)行形態(tài)鑒定，確保病菌充分生長且形態(tài)典型。、分子鑒定：基因?qū)用嫒绾尉珳?zhǔn)“驗(yàn)身”？標(biāo)準(zhǔn)中PCR技術(shù)應(yīng)用的科學(xué)性與前瞻性解讀分子鑒定原理：基于ITS與專化型基因的精準(zhǔn)識(shí)別01標(biāo)準(zhǔn)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，針對(duì)病菌核糖體DNA的ITS區(qū)域及尖孢鐮孢菌草莓?；吞禺愋曰蛟O(shè)計(jì)引物，通過擴(kuò)增特定基因片段，實(shí)現(xiàn)病菌的精準(zhǔn)鑒定。該方法基于基因序列的唯一性，比形態(tài)鑒定更具特異性與準(zhǔn)確性。02（二）關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟：從DNA提取到電泳檢測(cè)的規(guī)范操作01首先采用CTAB法提取病菌DNA，去除蛋白質(zhì)與雜質(zhì)；隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系含引物、Taq酶、dNTP等，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘；最后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。02（三）前瞻性：分子鑒定技術(shù)在未來檢疫中的升級(jí)方向標(biāo)準(zhǔn)采用的PCR技術(shù)為基礎(chǔ)分子方法，未來可結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR、LAMP技術(shù)等，實(shí)現(xiàn)病菌的快速定量檢測(cè)，縮短鑒定時(shí)間至2-3小時(shí)，同時(shí)提升對(duì)低濃度帶菌樣本的檢出能力，適應(yīng)大規(guī)模種苗快速檢疫的產(chǎn)業(yè)需求。12、致病性測(cè)定：如何驗(yàn)證病菌“殺傷力”？標(biāo)準(zhǔn)方法下的致病性判定與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系測(cè)定材料：標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的寄主品種與病菌接種體制備01選用敏感草莓品種（如紅顏、章姬）的健康幼苗，苗齡3-4葉期；病菌接種體為PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的菌絲體，制成濃度為1×10?個(gè)/mL的孢子懸浮液，確保接種體活性一致，保證測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性。02（二）核心接種方法：傷根接種法的操作與優(yōu)勢(shì)標(biāo)準(zhǔn)推薦傷根接種法：將草莓幼苗根部用無菌剪刀輕微劃傷，浸泡于孢子懸浮液中30分鐘，取出后移栽至滅菌基質(zhì)中，置于25-28℃、相對(duì)濕度80%以上的環(huán)境中培養(yǎng)。該方法模擬自然侵染過程，致病性表現(xiàn)明顯，結(jié)果可靠。（三）致病性判定標(biāo)準(zhǔn)：癥狀觀察與再分離驗(yàn)證01接種后2-4周觀察，若植株出現(xiàn)萎蔫、葉片黃化等典型癥狀，且從病部再分離出相同形態(tài)的病菌，即可判定為具有致病性。標(biāo)準(zhǔn)明確癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，便于量化評(píng)估病菌毒力，為風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)劃分提供依據(jù)。02、結(jié)果判定與記錄：鑒定結(jié)論如何嚴(yán)謹(jǐn)出具？GB/T36810-2018規(guī)范下的結(jié)果確認(rèn)與檔案管理結(jié)果判定邏輯：多方法協(xié)同的“三重驗(yàn)證”體系標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定鑒定結(jié)論需結(jié)合形態(tài)特征、分子檢測(cè)及致病性測(cè)定結(jié)果：三者均陽性則判定為檢出草莓枯萎病菌；形態(tài)與分子陽性但致病性陰性，需重新培養(yǎng)后復(fù)測(cè)；僅單一方法陽性，需補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，避免誤判，確保結(jié)論嚴(yán)謹(jǐn)。（二）鑒定記錄核心要素：標(biāo)準(zhǔn)要求的“全程可追溯”信息記錄需包含樣本信息（來源、數(shù)量、品種）、實(shí)驗(yàn)條件（培養(yǎng)基、溫度、試劑批次）、各步驟結(jié)果（菌落形態(tài)、PCR電泳圖、致病性癥狀）及操作人員、日期等。記錄需清晰、準(zhǔn)確，簽字確認(rèn)，確保整個(gè)鑒定過程可追溯、可核查。（三）鑒定報(bào)告出具規(guī)范：結(jié)論明確與風(fēng)險(xiǎn)提示并重報(bào)告需明確寫出“檢出”或“未檢出”結(jié)論，對(duì)檢出樣本需注明病菌毒力等級(jí)（基于致病性測(cè)定），并附上風(fēng)險(xiǎn)提示，如建議對(duì)帶菌種苗銷毀、田間進(jìn)行土壤消毒等。報(bào)告需加蓋檢疫機(jī)構(gòu)公章，具備法律效力。12、標(biāo)準(zhǔn)落地：檢疫實(shí)踐中如何高效應(yīng)用？結(jié)合未來5年草莓產(chǎn)業(yè)趨勢(shì)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施路徑分析種苗繁育環(huán)節(jié)：標(biāo)準(zhǔn)為“健康種苗”保駕護(hù)航未來草莓種苗將向集約化、標(biāo)準(zhǔn)化繁育發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)可作為種苗企業(yè)自檢與檢疫機(jī)構(gòu)抽檢的核心依據(jù)。建議繁育基地建立“育苗前土壤檢疫+育苗中定期監(jiān)測(cè)+出苗前最終鑒定”的全流程標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用模式，從源頭杜絕帶菌種苗流通。0102（二）跨區(qū)域調(diào)運(yùn)檢疫：標(biāo)準(zhǔn)破解“流通風(fēng)險(xiǎn)”難題01隨著電商發(fā)展，草莓種苗跨區(qū)域調(diào)運(yùn)日益頻繁。檢疫機(jī)構(gòu)需嚴(yán)格依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)開展調(diào)運(yùn)檢疫，對(duì)來自發(fā)病區(qū)的種苗強(qiáng)制進(jìn)行分子鑒定，出具合格證明后方可調(diào)運(yùn)。同時(shí)建立跨區(qū)域檢疫信息共享平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)協(xié)同防控。02（三）基層檢疫機(jī)構(gòu)：標(biāo)準(zhǔn)落地的“最后一公里”保障措施01針對(duì)基層機(jī)構(gòu)設(shè)備不足問題，建議推廣“形態(tài)初篩+縣級(jí)機(jī)構(gòu)分子驗(yàn)證”的分級(jí)檢測(cè)模式，同時(shí)加強(qiáng)基層人員標(biāo)準(zhǔn)培訓(xùn)，提升操作技能。鼓勵(lì)開發(fā)簡易快速檢測(cè)試劑盒，降低基層應(yīng)用門檻，確保標(biāo)準(zhǔn)在一線高效落地。02、與時(shí)俱進(jìn)：GB/T36810-2018將如何迭代？應(yīng)對(duì)新病害風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)準(zhǔn)完善方向與專家建議No.1當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)面臨的新挑戰(zhàn)：病菌變異與檢測(cè)技術(shù)升級(jí)需求No.2近年來，草莓枯萎病菌出現(xiàn)新的變異菌株，部分菌株形態(tài)與基因序列發(fā)生變化，現(xiàn)有引物可能無法精準(zhǔn)識(shí)別；同時(shí)，快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展也要求標(biāo)準(zhǔn)納入更高效的鑒定方法，以適應(yīng)產(chǎn)業(yè)快速檢疫的需求。（二）標(biāo)準(zhǔn)完善核心方向：拓展檢測(cè)范