DB34T8212008動物組織中氯霉素的殘留測定酶聯(lián)免疫吸附法本標準規(guī)定了動物組織中氯霉素殘留量的酶聯(lián)免疫吸附測定方法。本標準適用于豬、牛、羊、雞等動物肌肉組織中氯霉素殘留量的測定。本方法的檢出限為0.1μg/kg，定量限為0.3μg/kg。當樣品中氯霉素殘留量在0.3~10.0μg/kg范圍內(nèi)時，方法回收率為70%~120%，相對標準偏差小于15%。氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一種廣譜抗生素，曾廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。但由于其可能引起人體再生障礙性貧血等嚴重不良反應，許多國家已禁止在食用動物中使用氯霉素。因此，建立快速、準確、靈敏的氯霉素殘留檢測方法對保障食品安全具有重要意義。酶聯(lián)免疫吸附法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）是基于抗原抗體特異性反應的檢測技術(shù)，具有操作簡便、靈敏度高、特異性強、適合批量樣品檢測等優(yōu)點，已成為氯霉素殘留篩查的重要手段。2原理本方法基于競爭性酶聯(lián)免疫吸附原理。樣品中殘留的氯霉素與酶標抗原競爭結(jié)合包被在微孔板上的特異性抗體，加入底物溶液后，酶催化底物顯色，用酶標儀在450nm波長下測定吸光度值。樣品中氯霉素濃度與吸光度值成反比，通過標準曲線可定量計算出樣品中氯霉素的含量。3試劑和材料3.1試劑除非另有說明，本標準所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級水。3.1.1乙腈：色譜純。3.1.2正己烷：色譜純。3.1.3氯霉素標準品：純度≥98%。3.1.4氯霉素酶標抗原：20℃保存，有效期6個月。3.1.5氯霉素抗體：20℃保存，有效期6個月。3.1.6包被緩沖液：0.05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.6）。3.1.7洗滌液：含0.05%Tween20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）。3.1.8封閉液：含1%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）。3.1.9底物溶液：3,3',5,5'四甲基聯(lián)苯胺（TMB）溶液。3.1.10終止液：2mol/L硫酸溶液。3.2標準溶液配制3.2.1氯霉素標準儲備液（1mg/mL）：準確稱取10.0mg氯霉素標準品，用乙腈溶解并定容至10mL，20℃保存，有效期3個月。3.2.2氯霉素標準工作液：用磷酸鹽緩沖液將標準儲備液稀釋成0.1、0.3、1.0、3.0、10.0μg/mL系列濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。3.3材料3.3.1酶標板：96孔可拆微孔板。3.3.2微量移液器：10~100μL、20~200μL、100~1000μL。3.3.3渦旋混合器。3.3.4離心機：轉(zhuǎn)速≥4000r/min。3.3.5氮吹儀。3.3.6酶標儀：配備450nm濾光片。3.3.7分析天平：感量0.0001g。3.3.8pH計：精度±0.01。4樣品前處理4.1樣品制備取動物組織樣品，去除脂肪和結(jié)締組織，剪碎后用組織搗碎機均質(zhì)，置于20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?.2提取準確稱取5.0g（精確至0.01g）均質(zhì)樣品于50mL離心管中，加入10mL乙腈，渦旋混合2min，以4000r/min離心10min。取上清液于另一離心管中，殘渣用10mL乙腈重復提取一次，合并上清液。4.3凈化將上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入10mL正己烷，振搖2min，靜置分層后棄去正己烷層。將乙腈層轉(zhuǎn)移至潔凈離心管中，于40℃水浴中氮吹至近干。用1mL磷酸鹽緩沖液溶解殘留物，渦旋混合1min，作為待測液。5測定步驟5.1包被用包被緩沖液將氯霉素抗體稀釋至工作濃度，每孔加入100μL，37℃孵育2h。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次3min。5.2封閉每孔加入200μL封閉液，37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次3min。5.3加樣每孔加入50μL標準工作液或待測液，再加入50μL氯霉素酶標抗原，混勻后37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌5次，每次3min。5.4顯色每孔加入100μL底物溶液，室溫避光顯色15min。5.5終止每孔加入50μL終止液，輕輕混勻。5.6測定用酶標儀在450nm波長下測定各孔吸光度值。6結(jié)果計算6.1標準曲線繪制以標準溶液濃度的對數(shù)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。6.2樣品含量計算將樣品待測液的吸光度值代入標準曲線回歸方程，計算出樣品中氯霉素的含量，按公式（1）計算樣品中氯霉素的殘留量：X=(C×V)/m式中：X——樣品中氯霉素殘留量，單位為微克每千克（μg/kg）；C——從標準曲線上查得的待測液中氯霉素濃度，單位為微克每升（μg/L）；V——待測液定容體積，單位為毫升（mL）；m——樣品質(zhì)量，單位為克（g）。7精密度和準確度在0.3、1.0、5.0μg/kg三個添加水平下，方法的回收率為70%~120%，相對標準偏差（RSD）小于15%。8注意事項8.1試劑配制應使用純水，避免使用金屬容器。8.2酶標抗原和抗體應避免反復凍融。8.3顯色反應應嚴格控