T/CRHAXXX—202XII消化系統(tǒng)腫瘤類器官藥物敏感性檢測技術(shù)規(guī)范及操作指南范圍本文件規(guī)定了消化系統(tǒng)腫瘤類器官藥物敏感性檢測的樣品采集及處理、類器官建立及傳代、藥物敏感性檢測及結(jié)果解讀、類器官凍存及復(fù)蘇。本文件適用于消化系統(tǒng)腫瘤類器官的培養(yǎng)，靶向藥、免疫治療藥物、化療藥物的藥敏檢測，及指導消化系統(tǒng)腫瘤患者的個體化治療。規(guī)范性引用文件所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法請至少在標準正文部分引用1次請至少在標準正文部分引用1次GB19489-2008實驗室生物安全通用要求GB/T37864-2019生物樣本庫質(zhì)量和能力通用要求GB/T38736-2020人類生物樣本保藏倫理要求GB/T42060-2022醫(yī)學實驗室樣品采集、運送、接收和處理指南請至少在標準正文部分引用1次請至少在標準正文部分引用1次JG/T292潔凈工作臺YY0569II級生物安全柜術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。類器官organoids干細胞或前體細胞在體外三維培養(yǎng)條件下，通過增殖、分化和自組裝所形成的微型組織器官培養(yǎng)物。注：類器官在基因表達、細胞類型組成、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理/病理功能等方面，高度模擬體內(nèi)對應(yīng)組織器官(包括穩(wěn)態(tài)和病理過程)的特征。消化系統(tǒng)腫瘤類器官gastrointestinaltumororganoids利用消化系統(tǒng)腫瘤患者的腫瘤組織或細胞，在體外三維培養(yǎng)條件下形成的具有類似原生組織結(jié)構(gòu)的三維細胞團，能夠模擬原生腫瘤組織的生理和病理特性。注：消化系統(tǒng)腫瘤指胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌。消化系統(tǒng)腫瘤類器官培養(yǎng)基culturemediumforgastrointestinaltumororganoids本培養(yǎng)基體系可體外模擬消化系統(tǒng)腫瘤細胞生長及擴增所需的微環(huán)境，能夠誘導消化系統(tǒng)腫瘤細胞長期體外擴增培養(yǎng)，同時維持腫瘤細胞的原始特性，實現(xiàn)消化系統(tǒng)腫瘤類器官的體外長期存活和穩(wěn)定傳代。注：本培養(yǎng)基體系應(yīng)至少含胃癌培養(yǎng)基、結(jié)直腸癌培養(yǎng)基、肝癌培養(yǎng)基、膽管癌培養(yǎng)基、胰腺癌培養(yǎng)基。類器官傳代organoidpassage將生長至適宜大小且狀態(tài)良好的消化系統(tǒng)腫瘤類器官，通過物理機械分離結(jié)合化學酶消化的方法，解離為小細胞團或單細胞懸液。隨后，將所得細胞重新接種至與原始培養(yǎng)條件相同的培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng)，以實現(xiàn)類器官的擴增。注：新傳代類器官在形態(tài)結(jié)構(gòu)、增殖能力及功能特征上應(yīng)與原始類器官保持高度一致。傳代過程中嚴格遵循無菌操作規(guī)范，并定期監(jiān)測細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，確保傳代效率及生物學特性的穩(wěn)定性。類器官藥敏檢測drugsensitivitytestingfororganoids對培養(yǎng)成功的原代類器官，或傳代/復(fù)蘇的類器官，進行不同濃度的藥物接觸（通常在48或96孔板中進行），通過進行熒光圖像分析，可計算不同梯度藥物濃度對腫瘤細胞的抑制率，以評估藥物對類器官的殺傷作用，進而預(yù)測該藥物對患者腫瘤可能的治療效果。半抑制濃度請在標準正文部分至少引用1次halfmaximalinhibitoryconcentration(IC50)請在標準正文部分至少引用1次半抑制濃度常被稱作IC50值，指當給定藥物或化合物對目標生物體或細胞的生物活性(通常是抑制或抑制率)達到50%時，給定藥物或化合物的對應(yīng)濃度。是評價化合物影響生物活性的重要藥效學參數(shù)。藥物劑量與腫瘤類器官細胞存活率曲線下面積請在標準正文部分至少引用1次areaunderthedose-responsecurve(AUC)請在標準正文部分至少引用1次藥物劑量與腫瘤類器官細胞存活率曲線可以展示藥物的效力、最大效果（即達到最大響應(yīng)）以及單位劑量變化對響應(yīng)的影響。AUC作為一個綜合指標，它將藥物的生物效能和殺傷效果整合在一起，定義為在所有測試濃度下藥物引起的類器官活性變化的累積值。是評價化合物影響生物活性的重要藥效學參數(shù)。類器官凍存organoidcryopreservation需將類器官解離成小細胞團或單細胞懸液，加入凍存保護劑，放入超低溫冰箱凍存16h后，轉(zhuǎn)移到液氮中低溫保存，使其暫時脫離生長狀態(tài)而保留其細胞特性。注：凍存后的類器官在需要時能夠通過復(fù)蘇用于試驗。類器官復(fù)蘇請在標準正文部分至少引用1次organoidthawing請在標準正文部分至少引用1次將處于深低溫凍存的類器官取出并恢復(fù)其繼續(xù)生長狀態(tài)的過程。倫理審查委員會請在標準正文部分至少引用1次ethicsreviewcommittee請在標準正文部分至少引用1次負責對科學研究中涉及的倫理道德進行評估和審查的專門組織。注：消化系統(tǒng)腫瘤組織采集與處理應(yīng)獲得所在單位倫理委員會審批。知情同意請在標準正文部分至少引用1次informedconsent請在標準正文部分至少引用1次有自主判斷能力的供體或其法定監(jiān)護人，在獲得并充分了解樣本和數(shù)據(jù)捐贈相關(guān)信息之后，供體所受到的風險最小，且沒有受到任何利誘或恐嚇等不當行為影響的前提下，自愿自主的捐贈個人生物樣本及其關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)，并與采集者/收集者共同簽署的文件，包括但不限于合適條件下潛在研究應(yīng)用、研究成果潛在的商業(yè)應(yīng)用及其他問題所適用的內(nèi)容。注1：知情同意書包括但不限于有關(guān)組織處理方案和潛在應(yīng)用場景的信息。知情同意符合GB/T38736-2020第5.3條的要求。注2：消化系統(tǒng)腫瘤組織采集前應(yīng)簽署知情同意書，明確樣品收集方和被收集方雙方的利益和責任。知情同意書由采集者/收集者和被收集者共同簽署，一式兩份，正本由采集者/收集者保存，被收集者保存副本，詳見GB/T38736-2020第3.8條。注3：需要采取措施來保護組織提供者的個人信息的隱私，絕對禁止泄露可識別供體及其親屬身份的信息，如姓名、肖像、證件信息、社會關(guān)系等。倫理要求與隱私保護見GB/T38736-2020第6條?？s略語下列縮略語適用于本文件。ATP請在標準正文部分至少引用1次：腺嘌呤核苷三磷酸（AdenosineTriphosphate）請在標準正文部分至少引用1次PBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphate-BufferedSaline）EP：EP管（EppendorfTube）AO/PI：吖啶橙/碘化丙啶（AcridineOrange/PropidiumIodide）PI：碘化丙啶（PropidiumIodide）Calcein-AM：鈣黃綠素乙酰甲酯（CalceinAcetoxymethylEster）GFP：綠色熒光蛋白（GreenFluorescentProtein）RFP：紅色熒光蛋白（RedFluorescentProtein）技術(shù)要求生物安全的要求本方法進行實驗的實驗室及所涉及的設(shè)備應(yīng)符合GB19489-2008標準的要求，實驗過程中應(yīng)使用符合YY0569要求的II級生物安全柜和符合JG/T292要求的潔凈工作臺，確保實驗環(huán)境的無菌性和安全性。實驗操作人員應(yīng)具備相應(yīng)的生物安全知識和實驗操作技能，確保實驗過程的安全和準確性。檢測技術(shù)要求樣本要求本方法涉及到的生物樣品包括消化系統(tǒng)腫瘤患者的實質(zhì)腫瘤組織或非實質(zhì)轉(zhuǎn)移灶組織，前者指可經(jīng)手術(shù)切除或穿刺活檢獲取到的位于原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶的實質(zhì)腫瘤組織，后者指對懷疑有腹腔轉(zhuǎn)移或胸腔轉(zhuǎn)移且伴有較大量腹水或胸水患者進行穿刺引流獲取到的腹水或胸水。對消化系統(tǒng)腫瘤患者生物樣本的采集應(yīng)符合GB/T37864-2019標準的要求，以確保生物樣本的正確采集、運輸及處理。檢測步驟要求應(yīng)嚴格遵循以下步驟：腫瘤樣品采集及制備細胞懸液、腫瘤類器官的培養(yǎng)及藥敏板制備、藥物接觸、藥敏檢測及結(jié)果分析、類器官的凍存。具體步驟詳見第6節(jié)。檢測方法與步驟腫瘤樣品采集及處理樣品采集實質(zhì)腫瘤組織樣品的采集手術(shù)獲取消化系統(tǒng)腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶的實質(zhì)腫瘤組織，體積不小于10mm×5mm×5mm；或穿刺活檢獲取腫瘤組織，直徑1mm以上且總長度不小于15mm；或內(nèi)鏡下鉗取腫瘤總體積不小于5mm×5mm×5mm。新鮮的實質(zhì)腫瘤組織應(yīng)在離體30min內(nèi)放進預(yù)冷的組織保存液，在4°C恒溫的低溫條件下運送到實驗室。對運輸過程的記錄應(yīng)符合GB/T37864-2019中A.3、B.3條，宜記錄的內(nèi)容包括但不限于運送方式、運送過程中的溫度，接收時溫度或溫度范圍、運送起止時間和日期。非實質(zhì)轉(zhuǎn)移灶樣品的采集手術(shù)前獲取消化系統(tǒng)腫瘤非實質(zhì)轉(zhuǎn)移灶，抽取患者腹水或胸水至少200ml。新鮮的腹水或胸水應(yīng)該離體30min內(nèi)放入無菌袋，在4°C恒溫的低溫條件下運送到實驗室。對運輸過程的記錄應(yīng)符合GB/T37864-2019中A.3、B.3條，宜記錄的內(nèi)容包括但不限于運送方式、運送過程中的溫度，接收時溫度或溫度范圍、運送起止時間和日期。注：如有條件，應(yīng)送檢盡量多的腹水或胸水樣品。實驗準備使用前應(yīng)將樣本對應(yīng)癌種的試劑盒組分提前解凍混勻?；|(zhì)膠提前使用冰水浴解凍。樣品處理實質(zhì)腫瘤組織樣品的處理組織樣品預(yù)處理用10%雙抗PBS清洗3遍腫瘤組織，并浸泡5min，剔除其脂肪、肌肉組織和壞死組織。組織樣品的剪切和消化將組織塊轉(zhuǎn)移到1.5mL的EP管中，加入300μL組織消化液（膠原酶Ⅳ溶液，膠原酶Ⅳ濃度為2mg/mL），剪成大約1-3mm的組織塊，轉(zhuǎn)移到15mL的EP管中。向15mLEP管中加入5mL膠原酶Ⅳ溶液，于37℃180r/min振蕩消化。消化過程中每隔10min觀察消化情況，如所處理的腫瘤組織硬度過軟，則需每隔5min觀察一下消化情況，取少量液體在顯微鏡下觀察，10倍鏡下觀察到較多的細胞團（5-10個細胞團）后，靜置2min，未消化完全的組織沉淀將聚集在EP管下方，小心吸取上層液體，并過70μm孔徑的細胞篩，轉(zhuǎn)移到15mLEP管中，加入1倍體積的完全DMEM終止消化，剩余組織沉淀可繼續(xù)加5mL組織消化液消化，重復(fù)此步驟，直到細胞數(shù)量達到所需要求。樣品的過濾上層終止消化的液體400g，離心10min，去除上清液，保留沉淀。去除紅細胞觀察沉淀中有無紅細胞，加入紅細胞裂解液1-2mL，冰上裂解2-5min，加入三倍體積的PBS終止裂解，400g，離心5min，棄上清。制備細胞懸液沉淀用少量的DMEM培養(yǎng)基重懸，并吸取2uL體積的細胞懸液，在4倍鏡或10倍鏡下觀察細胞狀況，如細胞形態(tài)明確，細胞狀態(tài)較好，則所制取的細胞懸液可用于類器官培養(yǎng)。應(yīng)在樣本接收24h內(nèi)出具《樣本質(zhì)量反饋表》(見附錄A)。非實質(zhì)轉(zhuǎn)移灶樣品的處理樣品的過濾在超凈臺中取出患者腹水或胸水，利用70μm篩網(wǎng)過濾去除腹水或胸水中可能含有的絮狀物、胞外基質(zhì)雜質(zhì)，分批次使用50mlEP管進行離心（4?C，200×g，5min）。棄掉上清。去除紅細胞利用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸各管細胞沉淀并移至15mlEP管，按合適的比例（推薦比例為1:3）加入紅細胞裂解液，在冰上裂解8-12min后，離心（4?C，200×g，5min）。重復(fù)該步驟2-3次，至細胞沉淀中無肉眼可見的血紅色。移至1.5mlEP管。制備細胞懸液將離心后的細胞沉淀用PBS緩沖液重懸，吹打混勻后吸取10μL細胞懸液置于0.5mL的EP管中加入10μL的AO/PI染液充分混勻，取20μL細胞懸液加入細胞計數(shù)板，利用自動細胞分析儀檢測細胞數(shù)量及活率。細胞總數(shù)達1×106個以上，細胞活率達90%以上可用于類器官培養(yǎng)。應(yīng)在樣本接收24h內(nèi)出具《樣本質(zhì)量反饋表》(見附錄A)。腫瘤類器官的建立及傳代腫瘤類器官的初代培養(yǎng)細胞懸液與基質(zhì)膠混合將制備好的細胞懸液，轉(zhuǎn)移到1.5mLEP管中，置于冰上預(yù)冷3-5min后，加入適量的基質(zhì)膠，使細胞和基質(zhì)膠混勻后的細胞密度在5×105cell/mL?；靹蛉诤线^程應(yīng)全程在冰上操作，移液器吹打盡量輕柔，避免產(chǎn)生氣泡。細胞種板將混勻物加入細胞孔板的中心，細胞濃度為500cell/uL。若為48孔板（孔徑約11mm），每孔加混勻物體積為10μL；若為96孔板（孔徑約6.8mm），每孔加混勻物體積為5μL。注1：移液器加樣時應(yīng)盡量靠近孔板底部，但不能碰到板底，不要完全壓縮移液器的柱塞，防止圓頂中出現(xiàn)氣泡。注2：隨免疫治療在惡性腫瘤系統(tǒng)治療中的應(yīng)用愈加廣泛，而免疫治療療效可能較大依賴免疫細胞微環(huán)境，建議使用初代類器官進行含免疫治療方案的藥敏檢測，故進行此步驟時即應(yīng)規(guī)劃好藥敏檢測的細胞種板。本團體標準建議針對每種擬檢測的藥物方案，需種板2個11mm孔和至少10個6.8mm孔。前者用于人群藥物敏感性分析，即使用固定濃度進行藥物接觸，通過前期積累的人群類器官藥敏數(shù)據(jù)庫分析其在人群的敏感性；后者用于個體藥敏分析，即使用梯度濃度進行藥物接觸，通過IC50或曲線下面積，進行不同藥物方案的敏感性對比分析。注3：考慮到消化系統(tǒng)腫瘤的腫瘤異質(zhì)性較大，建議至少使用5ul上述混勻物種板，以避免每孔類器官數(shù)目過少導致的結(jié)果波動。添加相應(yīng)腫瘤類型的培養(yǎng)基以48孔板為例。小心轉(zhuǎn)移培養(yǎng)板至37℃孵箱孵育30min，移動板時，基質(zhì)膠不應(yīng)移動或振動。待基質(zhì)膠凝固后，每孔加入200μL，37℃預(yù)熱的相應(yīng)腫瘤類型的培養(yǎng)基（見附錄B《消化系統(tǒng)腫瘤類器官培養(yǎng)基》）注：為防止脫落，不要將培養(yǎng)基直接打到基質(zhì)膠上，應(yīng)將培養(yǎng)基緩慢的打到孔壁上。培養(yǎng)過程跟進觀察類器官生長狀態(tài)，每三天更換培養(yǎng)基，每6小時或12小時光學顯微成像掃描一輪。腫瘤類器官鑒定結(jié)合形態(tài)學分析、組織病理學（HE染色和免疫組化）、分子鑒定（基因組測序）等進行腫瘤類器官鑒定。腫瘤類器官成熟度檢測培養(yǎng)過程中，應(yīng)對類器官進行類器官大小、密度及占比進行監(jiān)測，評估類器官成熟度，以選擇藥敏試驗的藥物接觸時機。對于不同類型的消化系統(tǒng)腫瘤類器官，建議選用不同成熟度評估標準（見附錄C《藥物敏感性試驗類器官成熟度評估》）。注：請注意腫瘤類器官進行藥物接觸時，類器官不應(yīng)達到完全的成熟度，建議在類器官細胞形態(tài)開始明確，每孔（以96孔板為例）類器官數(shù)量達到＞50個時，進行評估并加藥。培養(yǎng)階段性報告培養(yǎng)3至10天后，出具《類器官培養(yǎng)情況反饋表》(見附錄D)至醫(yī)生，同時根據(jù)類器官培養(yǎng)情況，評估可用于藥敏檢測的類器官數(shù)量及質(zhì)量，協(xié)助醫(yī)生確定篩藥數(shù)量及方案。腫瘤類器官的傳代對于含有免疫治療藥物方案的類器官藥敏檢測，建議使用初代培養(yǎng)的腫瘤類器官，不建議使用經(jīng)傳代或復(fù)蘇的腫瘤類器官。對于僅含靶向藥物或化療藥物方案的類器官藥敏檢測，在難以獲取到足量初代類器官時，可考慮選用傳代或復(fù)蘇的腫瘤類器官。前代類器官的收集及消化應(yīng)選擇通過成熟度檢測的類器官進行傳代。吸去原培養(yǎng)基，每孔加入200μL的PBS，利用1ml的槍頭破壞基質(zhì)膠，收集至已用潤洗液潤洗過的15mL離心管中，吹打7-8下，使細胞能從基質(zhì)膠中分離出來，離心(4°C，300×g，10min)，下層沉淀會有基質(zhì)膠殘留，殘留的基質(zhì)膠中可能有細胞存在，因此要小心棄掉上清。加入1-2mL類器官消化液，置于37°C水浴鍋消化5-8min，觀察消化狀態(tài)，如出現(xiàn)絲狀物，則用1mL槍頭吹打7-8下，繼續(xù)消化5-8min，加入1倍體積的DMEM培養(yǎng)基終止消化，混勻后離心（4°C，300×g，5min），棄掉上清。制備細胞懸液并接種至基質(zhì)膠將離心后的細胞沉淀用PBS緩沖液重懸，并混合以適量的基質(zhì)膠，操作中避免產(chǎn)生氣泡。培養(yǎng)傳代一般以1:2或者1:3的比例進行傳代，種植于相應(yīng)數(shù)量的細胞孔板中央。添加相應(yīng)腫瘤類型的培養(yǎng)基小心轉(zhuǎn)移培養(yǎng)板至37℃孵箱孵育30min，移動板時，基質(zhì)膠不應(yīng)移動或振動。待基質(zhì)膠凝固后，加入37℃預(yù)熱的相應(yīng)腫瘤類型的培養(yǎng)基。培養(yǎng)過程跟進、類器官鑒定、成熟度檢測、階段報告同前“6.2.1.4”、“6.2.1.5”、“6.2.1.6”、“6.2.1.7”節(jié)。人群藥物敏感性檢測及結(jié)果解讀藥敏檢測板制備建議每種藥物方案至少種1個11mm孔（48孔板），詳見“6.2.1.2”節(jié)。類器官培養(yǎng)符合成熟度評估（“6.2.1.5”節(jié)）后，進入下一步驟。藥物方案制定建議與臨床醫(yī)生討論制定需要檢測的藥物方案。每種藥物方案使用單一藥物濃度，不設(shè)置對照。藥物接觸培養(yǎng)加入藥物培養(yǎng)48h后，進行熒光染色。熒光顯微成像用0.1-10μM的PI和Calcein-AM熒光染料進行細胞死活染色，將兩種熒光染料以相同的濃度加入染色工作液中，每孔200μL，37℃孵箱孵育30min。棄去染料用PBS清洗兩遍后，加入200μLPBS進行熒光顯微成像掃描。注：采集的默認波長是明場、GFP和RFP。進行長時間成像時，使用顯微鏡環(huán)境控制應(yīng)保持5%CO2和37℃。結(jié)果解讀綠色熒光為CalceinAM活細胞染色。CalceinAM本身并無熒光，進入細胞后被活細胞中的內(nèi)源性酯酶水解后生成鈣黃綠素（Calcein，可發(fā)出綠色熒光），并滯留在細胞內(nèi)，因此活細胞呈現(xiàn)綠色。死細胞缺乏有活性的酯酶，因此不發(fā)光。紅色熒光為Propidiumlodide（PI）死細胞染色。PI是一種可對DNA進行染色的細胞核染色試劑，常用于細胞凋亡檢測。它是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。PI不能通過活細胞膜，因此活細胞不發(fā)光，但死細胞的細胞膜發(fā)生破損，PI可穿過破損的細胞膜對核染色，因此死細胞呈現(xiàn)紅色熒光。藥物有效分數(shù)：紅/綠熒光比值定量顯示了每孔藥物對腫瘤類器官的殺傷效果，該值越高，說明死亡細胞比例越高，殺傷效果越好。實驗組的紅色熒光/（紅色+綠色熒光）比值減去陰性對照組紅色熒光/（紅色+綠色熒光）比值，得到的數(shù)值說明該藥物對腫瘤類器官的殺傷作用，數(shù)值越大，說明該藥物對樣本越有效。人群藥物敏感性：將數(shù)據(jù)庫中此類腫瘤類器官在該檢測濃度下進行檢測的樣本數(shù)定義為數(shù)據(jù)庫已有樣本數(shù)，根據(jù)藥物有效分數(shù)將已有樣本從高到低排列，分別對應(yīng)敏感至不敏感個體。將檢測樣本的藥物有效分數(shù)與總體隊列比較，對應(yīng)為本報告藥物有效分數(shù)的數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)庫中的排位即可反映個體在人群中的敏感性排位。對該排位進行百分化，并用100%減去該百分數(shù)即得到人群藥物敏感性。人群藥物敏感性越大，說明本樣本對該藥物越敏感；反之，人群敏感分數(shù)越小，說明本樣本對該藥物越抵抗。數(shù)據(jù)庫的人群排位基于前期累積的病例，同時新檢測樣本的數(shù)據(jù)也進一步擴充數(shù)據(jù)庫，提高后續(xù)分析的準確性。個體藥物敏感性檢測及結(jié)果解讀藥敏檢測板制備建議每種藥物方案至少種10個6.8mm孔（96孔板），詳見“6.2.1.2”節(jié)。類器官培養(yǎng)符合類器官藥敏試驗成熟度評估（“6.2.1.5”節(jié)）后，進入下一步驟。藥物方案制定建議與臨床醫(yī)生討論制定需要檢測的藥物方案。應(yīng)至少設(shè)置陰性對照組及空白組，建議設(shè)置陽性質(zhì)控組及陰性質(zhì)控組。按照如下要求進行處理：a）空白組：接種不含類器官的基質(zhì)膠，設(shè)置3復(fù)孔，不添加藥物，補充60μL培養(yǎng)基；b）陰性對照組：接種有類器官，但不添加藥物，補充60μL培養(yǎng)基；c）藥物測試組：接種有類器官，設(shè)置藥物濃度梯度，添加相應(yīng)藥液60μL；d）陽性質(zhì)控組：接種有參考品類器官的孔，添加陽性藥物接觸，補充60μL培養(yǎng)基；e）陰性質(zhì)控組：接種有參考品類器官的孔，添加陰性藥物接觸，補充60μL培養(yǎng)基。藥物接觸培養(yǎng)每種藥物方案建議設(shè)置8-10個藥物濃度梯度。加入藥物培養(yǎng)5-6天，在此期間每6小時或12小時光學顯微成像掃描一輪。酶標儀檢測CCK8和培養(yǎng)基以1：10的比例稀釋，每孔50μL，37℃孵箱孵育3-5h后，酶標儀檢測OD450，3h后可以進行第一次檢測，防止OD450值過高，導致數(shù)據(jù)檢測不出來，檢測完后可以繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直到下一次檢測。檢測間隔建議3h一次，不應(yīng)超過6h。結(jié)果解讀個體藥物敏感性是通過分析“藥物劑量與腫瘤類器官細胞存活率曲線”下的面積（AUC）或IC50來計算和評估的。個體藥物敏感性曲線可以展示藥物的效力、最大效果（即達到最大響應(yīng)）以及單位劑量變化對響應(yīng)的影響。AUC作為一個綜合指標，它將藥物的生物效能和殺傷效果整合在一起，定義為在所有測試濃度下藥物引起的類器官活性變化的累積值；AUC值越低，表示藥物抑制類器官增殖或殺傷類器官的能力越強。腫瘤類器官的凍存及復(fù)蘇凍存根據(jù)制定的藥敏檢測方案進行藥物接觸后，未進行檢測的類器官孔板應(yīng)進行凍存。類器官凍存液為無血清凍存液，一般宜用含有10%的二甲基亞砜（DMSO）。凍存前每孔加入500μL類器官收集液，將類器官吸至試管內(nèi)，按照50μL膠加500μL類器官收集液，置于冰上60min，去除培養(yǎng)基質(zhì)，離心清洗后，加入細胞消化酶消化3-5min，使其消化成單細胞懸液，離心獲取細胞沉淀后加入適量類器官凍存液混勻（1mL左右），分裝于500μL低溫凍存管中，放入程序性凍存盒內(nèi)于-80°C深低溫冰箱過夜保存，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。復(fù)蘇從液氮罐中取出的類器官凍存管要快速放入37°C水浴鍋中使其盡快融化。吸出類器官凍存物移至15mL無菌離心管中，再加入10倍體積的類器官培養(yǎng)基混勻。之后操作同前述的類器官傳代培養(yǎng)過程。類器官鑒定與質(zhì)量控制要求如下：a）根據(jù)類器官形態(tài)、直徑、透亮度等參數(shù)進行分析，進行類器官活性、細胞量質(zhì)控，其中活性不低于50%，細胞量滿足藥敏檢測量需求；b）類器官與源組織在細胞類型、基因表達方面應(yīng)高度一致。類器官HE染色后，由具備病理鑒定資質(zhì)的專業(yè)人員判定類器官與源組織的組織學特征，如應(yīng)符合腫瘤細胞特征：核深染、異常核分裂像、核質(zhì)比失調(diào)等；通過免疫組化及全外顯子測序，判斷類器官與源組織在特征標志物的表達及基因突變的一致性；c）當類器官傳代后，應(yīng)能進行體外重建成新的類器官，并且傳代前后類器官的形態(tài)和特征應(yīng)保持一致；d）真菌、細菌、支原體等均為陰性。真菌、細菌污染判斷常規(guī)通過顯微鏡于鏡下肉眼觀察，支原體污染通過商品化支原體檢測試劑盒去類器官培養(yǎng)上清檢測確認。數(shù)據(jù)管理宜根據(jù)類器官的具體用途，制定數(shù)據(jù)管理規(guī)范，其中應(yīng)包括數(shù)據(jù)內(nèi)容和保存期限，數(shù)據(jù)管理的權(quán)限和責任等方面的要求。對于詳細的臨床樣本數(shù)據(jù)管理，見國家藥品監(jiān)督管理部門發(fā)布的《藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》(GCP)中有關(guān)數(shù)據(jù)管理的相關(guān)部分內(nèi)容。廢棄物處理在類器官的構(gòu)建、傳代、組織樣本獲取、培養(yǎng)、鑒定、凍存等操作過程中所產(chǎn)生的廢棄物，應(yīng)遵守生物樣本處置與管理規(guī)范以及相關(guān)醫(yī)療廢物處理規(guī)范，按照GB19489-2008和GB/T38736-2020的要求，將不合格或者污染的類器官、細胞等廢棄物妥善處置于指定地點。

附錄A（資料性）樣本質(zhì)量反饋表表A.1入室樣本質(zhì)控表樣本號癌種取樣部位取樣方式樣本離體時間樣本入室時間入室照片及狀態(tài)樣本到達時冷藏箱內(nèi)溫度：寄送包裝是否完好？保存管是否漏液？保存液是否澄清？保存液是否結(jié)冰？樣本是否浸沒于保存液？樣本處理時間樣本大體形態(tài)樣本重量：描述：樣本預(yù)處理情況消化時間：鏡下細胞數(shù)量、活性：細胞數(shù)量：樣本培養(yǎng)前總結(jié)

表A.2樣本質(zhì)量評分表變量分類評分標準*評分病灶特征轉(zhuǎn)移灶105原發(fā)灶5惡性積液5取樣方式組織樣本外科手術(shù)1010內(nèi)鏡活檢5穿刺活檢5惡性積液引流10穿刺5樣本質(zhì)量/體積>0.5g或200ml15150.2~0.5g或50~200ml10<0.2g或50ml5樣本中組織細胞占比>40%201510%~40%15<10%5幾乎無0樣本離體到放入保存液中的時間<10分鐘151010~20分鐘10>20分鐘0樣本離體時間<12小時101012-24小時524-48小時0處理后細胞活力>50%201015%~50%10<15%5幾乎無0樣本綜合評分75說明：以上評分基于統(tǒng)計學多因素分析，分值設(shè)定以各變量權(quán)重為依據(jù)。一般情況下，當樣本綜合得分<40分時，或“樣本中組織細胞占比”和“處理后細胞活力”兩項中有一項得分為0時，將不對樣本做進一步處理。當40分<樣本綜合得分<60分時，則藥敏分析服務(wù)將不承諾能在收到樣本后一個月內(nèi)完成。

附錄B（資料性）消化系統(tǒng)腫瘤類器官培養(yǎng)基B.1胃癌類器官培養(yǎng)基……。B.2結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基……。B.3肝癌類器官培養(yǎng)基……。B.4膽管癌類器官培養(yǎng)基……。B.5胰腺癌類器官培養(yǎng)基……。……。

附錄C（資料性）藥物敏感性試驗類器官成熟度評估

附錄D（資料性）類器官培養(yǎng)情況反饋表表D.1類器官培養(yǎng)質(zhì)控表癌種肝細胞癌培養(yǎng)天數(shù)15天第一代種植（第1天）（照片）類器官成型（第5天）（照片）類器官穩(wěn)定（第15天）（照片）是否傳代是否凍存第二代種植（第1天）類器官成型（第4天）類器官穩(wěn)定（第14天）總培養(yǎng)天數(shù)生長狀態(tài)形態(tài)特征其他藥篩前計數(shù)

表D.2類器官質(zhì)量評分變量分類評分標準*樣本評分培養(yǎng)前樣本評分≤40041~59660~798≥8010增殖速率較慢6適中8較快10培養(yǎng)天數(shù)>14天5≤14天10消化后細胞數(shù)量103~10415104~10520105~10630>10640消化后細胞活率<50%1050%~79%20≥80%30總分//說明：以上評分基于統(tǒng)計學多因素分析，分值設(shè)定以各變量權(quán)重為依據(jù)。評分低于60分時，類器官培養(yǎng)的時間需要延長，藥敏分析進度相應(yīng)延長。

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