微生物檢驗樣品處理程序一、微生物檢驗樣品處理程序概述

微生物檢驗樣品處理是確保檢驗結果準確性和可靠性的關鍵環(huán)節(jié)。規(guī)范的樣品處理程序能夠有效去除干擾物質，富集目標微生物，并降低污染風險。本程序適用于食品、環(huán)境、醫(yī)療等領域的微生物檢驗樣品，涵蓋樣品接收、前處理、保存、運輸及實驗室準備等步驟。

二、樣品接收與標識

（一）樣品接收

1.檢查樣品包裝是否完整，確認樣品未受污染。

2.核對樣品標簽信息，包括樣品名稱、編號、采集時間、來源等，確保與檢驗要求一致。

3.記錄樣品狀態(tài)，如溫度、外觀等，并填寫樣品接收記錄表。

（二）樣品標識

1.使用專用標簽注明樣品信息，包括實驗室編號、接收日期、處理狀態(tài)等。

2.確保標簽牢固粘貼，避免脫落或模糊。

3.對生物危險樣品，使用生物安全標識，并按相關規(guī)定處理。

三、樣品前處理

（一）樣品均質化

1.將樣品置于無菌均質袋或容器中。

2.根據樣品類型選擇合適的均質方法：

(1)固體樣品：采用高速攪拌機或拍擊式均質器，確保組織破碎均勻。

(2)液體樣品：充分混勻，避免沉淀。

3.均質時間根據樣品特性調整，一般5-10分鐘。

（二）樣品稀釋

1.使用無菌生理鹽水或緩沖液進行系列稀釋。

2.按以下步驟操作：

(1)取適量均質樣品（如10g或1mL）加入無菌稀釋液中。

(2)振蕩混勻，進行10倍梯度稀釋。

(3)記錄每個稀釋度樣品體積，確保后續(xù)接種量準確。

（三）富集培養(yǎng)（如需）

1.對于低含量微生物樣品，可進行富集培養(yǎng)。

2.常用富集培養(yǎng)基：

(1)營養(yǎng)肉湯：適用于一般細菌。

(2)選擇性培養(yǎng)基：針對特定微生物（如沙門氏菌）。

3.富集時間一般為18-24小時，溫度控制在30-37℃。

四、樣品保存與運輸

（一）樣品保存

1.未立即檢驗的樣品應冷藏保存（4℃），避免微生物生長。

2.液體樣品使用無菌密封容器，固體樣品用無菌袋包裹。

3.保存時間不超過24小時，特殊樣品按規(guī)程延長。

（二）樣品運輸

1.使用潔凈、密封的運輸箱，避免交叉污染。

2.生物危險樣品需添加吸附材料（如吸水紙），并使用專用運輸包。

3.運輸途中保持低溫（≤4℃），并記錄溫度變化。

五、實驗室準備

（一）環(huán)境要求

1.檢驗區(qū)域需清潔、通風，溫濕度適宜（溫度22-26℃，濕度50-60%）。

2.使用超凈工作臺或生物安全柜進行操作，避免空氣污染。

（二）器材準備

1.準備無菌器材：移液器、試管、培養(yǎng)皿、均質器等。

2.檢查培養(yǎng)基、試劑是否在有效期內，并按規(guī)范配置。

3.校準儀器，如滅菌鍋、培養(yǎng)箱、顯微鏡等。

（三）個人防護

1.佩戴無菌手套、實驗服，必要時佩戴護目鏡或面罩。

2.每處理一個樣品更換手套，避免交叉污染。

六、注意事項

（一）避免污染

1.所有操作需在無菌條件下進行，避免接觸非無菌表面。

2.使用一次性無菌耗材，減少污染風險。

（二）操作規(guī)范

1.嚴格遵守無菌技術，如火焰滅菌接種環(huán)、旋轉開蓋等。

2.記錄所有操作步驟，確?？勺匪菪浴?/p>

（三）廢棄物處理

1.污染器材需高壓滅菌后丟棄。

2.生物危險樣品按醫(yī)療廢物規(guī)范處理，避免泄漏。

**一、微生物檢驗樣品處理程序概述**

微生物檢驗樣品處理是確保檢驗結果準確性和可靠性的關鍵環(huán)節(jié)。規(guī)范的樣品處理程序能夠有效去除干擾物質，富集目標微生物，并降低污染風險。本程序適用于食品、環(huán)境、醫(yī)療等領域的微生物檢驗樣品，涵蓋樣品接收、前處理、保存、運輸及實驗室準備等步驟。規(guī)范的樣品處理是后續(xù)分離、鑒定和計數(shù)等檢驗操作成功的基礎，任何環(huán)節(jié)的疏忽都可能導致結果偏差甚至錯誤。因此，必須嚴格按照標準操作規(guī)程執(zhí)行。

**二、樣品接收與標識**

（一）樣品接收

1.**信息核對與記錄：**首先核對送檢單與樣品標簽上的信息是否一致，包括樣品名稱、唯一標識碼、送檢單位、樣品來源、采集日期/時間、檢驗項目要求等。確認無誤后，在送檢單上簽字確認接收時間。記錄樣品當前狀態(tài)，如外觀（顏色、氣味、是否有沉淀或異物）、包裝完整性、溫度等，并特別留意是否有泄漏或污染跡象。對于緊急樣品，優(yōu)先處理并記錄。

2.**包裝檢查：**評估樣品包裝是否適合微生物檢驗。檢查包裝材料是否密封完好、無破損、無裂縫。對于冷藏或冷凍樣品，檢查保溫容器和冰排是否完好，溫度是否符合保存要求。包裝損壞的樣品可能已受污染，需謹慎處理或拒收，并通知送檢方。

3.**初步評估：**根據送檢信息和包裝狀態(tài)，初步判斷樣品的潛在風險和檢驗難度，為后續(xù)處理提供參考。

（二）樣品標識

1.**專用標簽使用：**為每個接收的樣品立即粘貼一個全新的、耐候性好的專用標簽。標簽應包含實驗室內部賦予的唯一樣品編號，以及接收日期和時間。確保標簽粘貼牢固，不易脫落或模糊不清，最好使用不易被篡改的材質或方法（如不易撕掉的膠水、直接刻印在特定區(qū)域等）。

2.**補充信息標注：**在標簽上注明樣品類型（如：食品、水樣、空氣沉降物等）和主要成分（如：肉類、奶制品、土壤等），有助于后續(xù)識別。對于特殊樣品（如含有抑制劑、高鹽、高糖等），需在標簽上明確標注，以便在處理時采取相應措施。

3.**生物安全標識：**如果樣品具有潛在生物風險（如來自醫(yī)療機構、可能含有致病微生物），必須在標簽上添加明顯的生物安全警示標識（如生物危險符號），并按照相應的生物安全等級要求進行后續(xù)處理和儲存。標識應清晰、醒目。

**三、樣品前處理**

（一）樣品均質化

1.**環(huán)境準備：**在潔凈臺或生物安全柜內進行均質操作。打開紫外燈照射30分鐘進行空間滅菌，隨后開啟通風，準備進行無菌操作。

2.**器材準備：**準備好所需的無菌均質器（如高速拍擊式均質器、粘度均質器或攪拌器）、無菌容器（均質袋或均質杯）、移液器和無菌吸頭等。確保所有器材已滅菌。

3.**樣品取樣：**根據樣品量和檢驗要求，使用無菌取樣工具（如無菌勺、無菌鑷子、注射器等）從樣品中取足量的代表性樣品。通常取10g（固體）或10mL（液體）作為初始均質量，具體依據檢驗標準或樣品特性確定。

4.**均質方法選擇與操作：**

(1)**固體樣品（如肉類、蔬菜、土壤等）：**將取好的樣品放入無菌均質袋或均質杯中。對于較硬的樣品（如肉類），可先切割成小塊。使用拍擊式均質器時，根據設備說明設置合適的轉速和拍擊次數(shù)（通常建議100-300次拍擊，或遵循標準操作規(guī)程）。對于粘稠或易碎樣品，可先加入少量無菌生理鹽水或稀釋液輔助均質。對于需要保留氣調環(huán)境的樣品（如含CO2的食品），使用專門設計的均質袋和均質器。

(2)**液體樣品（如牛奶、飲料、水樣等）：**充分振搖混勻，確保無沉淀物沉降。若液體粘稠或含有固體顆粒，可使用高速攪拌器進行均質，或先通過濾膜過濾（根據檢驗目的選擇合適的濾膜孔徑，如0.45μm或0.22μm），取濾液進行后續(xù)檢驗。

(3)**半固體樣品（如奶油、果醬等）：**可先冷凍使樣品變硬，然后進行切割和拍擊式均質，或使用專門的食品均質機。

5.**均質效果確認：**均質后，取少量樣品在顯微鏡下觀察，確認樣品組織已充分破碎，無大塊殘留物?？赏ㄟ^傾倒或攪拌測試樣品的均勻性。

（二）樣品稀釋

1.**稀釋液選擇：**根據樣品基質和目標微生物特性，選擇合適的無菌稀釋液。常用稀釋液包括：無菌生理鹽水（0.9%NaCl）、BufferedPeptoneWater(BPW)、BufferedSalineWater(BSW)、MacConkeyBroth（用于選擇性分離）、RBCBroth（用于酵母菌計數(shù)）等。稀釋液應無菌、無抑制劑，并能在所需溫度下保持穩(wěn)定。

2.**無菌操作：**在潔凈臺或生物安全柜內進行稀釋操作。使用無菌移液器吸取定量的無菌稀釋液，加入無菌容器中。

3.**梯度稀釋：**將步驟（一）中均質好的樣品，按照一定的體積比加入到稀釋液中，進行系列稀釋。這是為了將樣品中的微生物濃度降低到適合平板計數(shù)或直接接種的范圍內。

(1)**計算稀釋倍數(shù)：**常用的稀釋比例是1:10。例如，取1mL樣品加入9mL稀釋液中，即為10倍稀釋。記錄每次稀釋所用的樣品體積（V1）和稀釋液體積（V2）。

(2)**操作步驟：**

a.使用無菌移液器精確吸取V1體積（如1mL、0.1mL、0.01mL等，根據系列稀釋計劃確定）的均質樣品。

b.加入到含有V2體積（如9mL、9.9mL、99mL）無菌稀釋液的無菌容器（如試管、離心管）中。

c.充分混勻，確保樣品與稀釋液完全混合?？赏ㄟ^顛倒混勻或使用渦旋振蕩器（設置合適時間，避免產生過多氣泡）。

d.將混合液進行下一輪稀釋（再次取V1體積加入V2體積稀釋液），如此重復，直至獲得適合檢驗的稀釋度范圍（通常平板計數(shù)范圍在30-300CFU/mL）。

(3)**記錄：**詳細記錄每一步稀釋的倍數(shù)、所用體積和操作時間。建議制作稀釋記錄表。

4.**檢驗適用性：**在進行最終接種前，可取不同稀釋度的樣品液進行無菌檢驗（如培養(yǎng)），初步判斷哪個稀釋度適用于目標微生物的檢出或計數(shù)。

（三）富集培養(yǎng)（如需）

1.**目的與適用性：**當樣品中目標微生物含量很低，或需要增加特定微生物（如致病菌）的數(shù)量以便于檢測時，進行富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)利用特定培養(yǎng)基的選擇性或營養(yǎng)性，促進目標微生物生長，同時抑制非目標微生物。

2.**培養(yǎng)基選擇：**

(1)**通用營養(yǎng)培養(yǎng)基：**如營養(yǎng)肉湯（NutrientBroth），適用于培養(yǎng)大多數(shù)需氧或兼性厭氧細菌，用于樣品的初步增菌。

(2)**選擇性培養(yǎng)基：**根據要檢測的特定微生物種類添加抑制劑和選擇性成分。例如：

-沙門氏菌選擇性增菌：使用TSB（TrypticSoyBroth）或RBC（RapidBrilliantGreenBroth）等。

-李斯特菌選擇性增菌：使用AYE（Acetate-YeastExtract）或SPS（SodiumPhosphateSucrosePeptone）增菌液。

-布魯氏菌選擇性增菌：使用含有BrucellaAgar的特定培養(yǎng)基。

(3)**特殊培養(yǎng)基：**根據目標微生物的特殊營養(yǎng)需求選擇，如厭氧菌使用的厭氧培養(yǎng)基。

3.**操作步驟：**

(1)將適量（通常為0.1mL-1mL，依據標準或樣品量）的樣品稀釋液或均質液接種到無菌的富集培養(yǎng)液中。

(2)置于適宜的溫度（通常為30-37℃）和條件下（如需氧、厭氧）培養(yǎng)。

(3)培養(yǎng)時間根據目標微生物的生長速度和檢驗要求確定，通常為18-48小時。某些快速生長的微生物可能需要更短時間，而某些慢生長微生物（如分枝桿菌）則需要更長時間。

(4)培養(yǎng)期間定期觀察，如渾濁度變化、沉淀形成、氣體產生等。

4.**后續(xù)處理：**富集培養(yǎng)結束后，根據檢驗目的，將培養(yǎng)液進行系列稀釋，然后進行平板劃線分離、傾注平板或直接接種到選擇性/鑒定培養(yǎng)基上，進行純培養(yǎng)或計數(shù)。

**四、樣品保存與運輸**

（一）樣品保存

1.**保存必要性：**對于無法立即檢驗的樣品，必須進行妥善保存，以維持樣品中微生物的狀態(tài)，防止其過度生長、死亡或發(fā)生變異。不當保存是導致檢驗結果不準確的主要原因之一。

2.**保存條件：**

(1)**冷藏（4℃）：**最常用的保存方法，適用于大多數(shù)需氧和兼性厭氧微生物。冷藏能顯著減緩微生物生長速度。樣品應盡快放入4℃冰箱，避免在室溫下放置過久。

(2)**冷凍（≤-20℃）：**對于需要長期保存或保存后仍需進行某些特殊檢驗（如DNA檢測）的樣品，應冷凍保存。冷凍能更有效地抑制微生物生長。建議使用無菌冷凍管或袋，并加入少量稀釋液防止結冰損傷細胞。

(3)**特定要求：**某些微生物（如厭氧菌）或特殊樣品（如含抗生素的樣品）可能有特殊的保存要求，需遵循相關標準。

3.**保存時間：**樣品保存時間應盡可能短，通常建議不超過24小時。若需延長保存時間，應記錄原因，并評估對檢驗結果可能產生的影響。超過建議保存期限的樣品，應通知送檢方并謹慎處理。

4.**防止交叉污染：**不同樣品應分開存放，避免直接接觸。冷藏或冷凍設備應定期清潔和除霜，確保存儲環(huán)境潔凈。

（二）樣品運輸

1.**運輸容器：**使用清潔、干燥、密封的運輸容器。對于易破碎樣品，應使用帶緩沖墊的容器。

2.**包裝要求：**

(1)**防漏：**確保容器密封良好，防止樣品在運輸過程中泄漏、污染環(huán)境或造成交叉污染。必要時，在容器外部包裹吸水材料（如吸水紙、無紡布）。

(2)**保溫：**對于需要冷藏或冷凍的樣品，使用保溫箱（如泡沫箱）并放置足量的冰排或干冰，確保在運輸過程中溫度保持在要求范圍內（如冷藏樣品維持在4℃以上，冷凍樣品維持在-20℃以下）。記錄樣品在運輸過程中的溫度變化（如有條件）。

3.**標識與信息：**運輸容器上應清晰粘貼包含樣品唯一標識、類型、保存條件要求的標簽。如涉及生物安全風險，需使用符合規(guī)定的生物安全標識和包裝級別。

4.**運輸方式：**選擇合適的運輸工具和方法，避免劇烈震動和曝露于極端溫度（除非是冷凍樣品）。確保運輸過程符合實驗室和樣品的特性要求。

**五、實驗室準備**

（一）環(huán)境要求

1.**區(qū)域選擇：**樣品處理應在潔凈度符合要求的區(qū)域進行，通常為生物安全實驗室的潔凈工作臺（ClassII或ClassIII）或生物安全柜（BSC）。處理潛在生物風險樣品時，應在相應生物安全等級的實驗室進行。

2.**環(huán)境控制：**維持相對穩(wěn)定的溫度（22-26℃）和濕度（40-60%）。保持環(huán)境清潔，定期進行消毒（如使用70-75%乙醇擦拭工作表面）。

3.**空氣流向：**確?？諝饬飨蚍蠈嶒炇以O計要求，通常為單向流，防止污染。工作前開啟通風，并照射紫外燈消毒（30分鐘），待燈管冷卻后再開始操作。

（二）器材準備

1.**無菌器材：**準備充足的無菌器材，包括：

(1)**容器：**無菌試管、離心管、培養(yǎng)皿、均質袋/杯、移液管、容量瓶等。檢查包裝完整性，確認為無菌。

(2)**工具：**無菌鑷子、無菌勺、接種環(huán)/針、移液器吸頭、渦旋振蕩器、拍擊式均質器等。

(3)**其他：**無菌濾膜、無菌生理鹽水/緩沖液、各種培養(yǎng)基（營養(yǎng)肉湯、選擇性培養(yǎng)基等）、染色劑（如革蘭氏染液）、顯微鏡等。

2.**培養(yǎng)基與試劑：**檢查所有培養(yǎng)基（固體、液體）是否在有效期內，包裝是否完好無破損。按照標準方法配置所需濃度和pH值。配置好的培養(yǎng)基需進行無菌檢查（如傾注法或涂布法接種無活力菌，培養(yǎng)觀察）。

3.**儀器校準：**確保所有相關儀器（如高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、顯微鏡、天平、移液器等）處于良好工作狀態(tài)，并按規(guī)定進行校準和驗證。特別是移液器和天平，其準確性對稀釋和稱量至關重要。

（三）個人防護

1.**著裝要求：**進入樣品處理區(qū)域必須穿戴實驗服，必要時佩戴潔凈工作帽和口罩。處理潛在生物風險樣品時，需根據風險等級穿戴相應的個人防護裝備（PPE），如手套（一次性或可重復使用）、護目鏡或面屏、防滲透實驗服、隔離鞋套或耐酸堿靴等。

2.**手部衛(wèi)生：**操作前后必須徹底清洗雙手，或使用含70-75%酒精的免洗手消毒液進行手部消毒。

3.**操作規(guī)范：**嚴格遵守無菌操作規(guī)程。如使用接種環(huán)等金屬器械，需在火焰上燒至紅熱進行滅菌。取用無菌物品時，避免觸碰非無菌區(qū)域。操作過程中盡量減少說話和移動，以降低氣溶膠傳播風險。處理完一個樣品后，及時更換手套，必要時更換實驗服或離開操作區(qū)域進行清潔。

**六、注意事項**

（一）避免污染

1.**源頭控制：**確保所有接觸樣品的器材、環(huán)境、操作均無菌。處理樣品前徹底清潔雙手和操作臺面。

2.**操作規(guī)范：**

(1)所有開口操作（如開蓋、傾倒）盡量在生物安全柜內進行，或采取其他無菌操作技術（如旋轉開蓋、使用無菌吸頭吸?。?。

(2)使用無菌容器接收樣品，避免樣品接觸外界環(huán)境。

(3)稀釋和接種時，避免樣品濺出。移液時使用移液器垂直加樣，避免產生氣泡或飛濺。

(4)不同樣品間操作需更換無菌器材，避免交叉污染。

(5)保持工作臺面整潔，物品擺放有序，避免混淆。

3.**環(huán)境控制：**定期清潔和消毒工作區(qū)域?？刂乒ぷ鲄^(qū)域的人員流動，減少人員走動。

（二）操作規(guī)范

1.**記錄完整：**詳細記錄樣品處理過程中的每一步操作，包括時間、操作內容、所用器材、稀釋倍數(shù)、觀察結果等。記錄應清晰、準確、不可篡改。保留所有原始記錄。

2.**遵循標準：**嚴格按照適用的國家或行業(yè)標準（如GB/T、ISO等）以及實驗室內部SOP進行操作。

3.**確認與復核：**對于關鍵步驟（如滅菌、培養(yǎng)溫度時間、稀釋計算等），應有檢查確認環(huán)節(jié)。重要樣品的處理可進行雙人復核。

（三）廢棄物處理

1.**分類收集：**將所有使用過的、可能被污染的廢棄物（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)物、手套、實驗服、吸水紙等）收集到符合規(guī)定的、有明確標識的廢棄物容器中。

2.**處理方法：**

(1)**一般廢棄物：**一次性高壓滅菌后，作為普通醫(yī)療或實驗室廢棄物處理。

(2)**潛在生物風險廢棄物：**必須先高壓滅菌（通常121℃，15分鐘以上），然后根據其風險等級和當?shù)匾?guī)定進行進一步處理（如化學消毒、特殊包裝后處置等）。

(3)**化學廢棄物：**如需使用化學試劑（非本次要求，但為完整性提及），需按化學廢棄物規(guī)定處理。

3.**容器處理：**廢棄物容器在使用前應進行檢查，使用后及時封口，并按規(guī)定移交給有資質的機構處理。處理過程需確保安全，防止泄漏和污染。

一、微生物檢驗樣品處理程序概述

微生物檢驗樣品處理是確保檢驗結果準確性和可靠性的關鍵環(huán)節(jié)。規(guī)范的樣品處理程序能夠有效去除干擾物質，富集目標微生物，并降低污染風險。本程序適用于食品、環(huán)境、醫(yī)療等領域的微生物檢驗樣品，涵蓋樣品接收、前處理、保存、運輸及實驗室準備等步驟。

二、樣品接收與標識

（一）樣品接收

1.檢查樣品包裝是否完整，確認樣品未受污染。

2.核對樣品標簽信息，包括樣品名稱、編號、采集時間、來源等，確保與檢驗要求一致。

3.記錄樣品狀態(tài)，如溫度、外觀等，并填寫樣品接收記錄表。

（二）樣品標識

1.使用專用標簽注明樣品信息，包括實驗室編號、接收日期、處理狀態(tài)等。

2.確保標簽牢固粘貼，避免脫落或模糊。

3.對生物危險樣品，使用生物安全標識，并按相關規(guī)定處理。

三、樣品前處理

（一）樣品均質化

1.將樣品置于無菌均質袋或容器中。

2.根據樣品類型選擇合適的均質方法：

(1)固體樣品：采用高速攪拌機或拍擊式均質器，確保組織破碎均勻。

(2)液體樣品：充分混勻，避免沉淀。

3.均質時間根據樣品特性調整，一般5-10分鐘。

（二）樣品稀釋

1.使用無菌生理鹽水或緩沖液進行系列稀釋。

2.按以下步驟操作：

(1)取適量均質樣品（如10g或1mL）加入無菌稀釋液中。

(2)振蕩混勻，進行10倍梯度稀釋。

(3)記錄每個稀釋度樣品體積，確保后續(xù)接種量準確。

（三）富集培養(yǎng)（如需）

1.對于低含量微生物樣品，可進行富集培養(yǎng)。

2.常用富集培養(yǎng)基：

(1)營養(yǎng)肉湯：適用于一般細菌。

(2)選擇性培養(yǎng)基：針對特定微生物（如沙門氏菌）。

3.富集時間一般為18-24小時，溫度控制在30-37℃。

四、樣品保存與運輸

（一）樣品保存

1.未立即檢驗的樣品應冷藏保存（4℃），避免微生物生長。

2.液體樣品使用無菌密封容器，固體樣品用無菌袋包裹。

3.保存時間不超過24小時，特殊樣品按規(guī)程延長。

（二）樣品運輸

1.使用潔凈、密封的運輸箱，避免交叉污染。

2.生物危險樣品需添加吸附材料（如吸水紙），并使用專用運輸包。

3.運輸途中保持低溫（≤4℃），并記錄溫度變化。

五、實驗室準備

（一）環(huán)境要求

1.檢驗區(qū)域需清潔、通風，溫濕度適宜（溫度22-26℃，濕度50-60%）。

2.使用超凈工作臺或生物安全柜進行操作，避免空氣污染。

（二）器材準備

1.準備無菌器材：移液器、試管、培養(yǎng)皿、均質器等。

2.檢查培養(yǎng)基、試劑是否在有效期內，并按規(guī)范配置。

3.校準儀器，如滅菌鍋、培養(yǎng)箱、顯微鏡等。

（三）個人防護

1.佩戴無菌手套、實驗服，必要時佩戴護目鏡或面罩。

2.每處理一個樣品更換手套，避免交叉污染。

六、注意事項

（一）避免污染

1.所有操作需在無菌條件下進行，避免接觸非無菌表面。

2.使用一次性無菌耗材，減少污染風險。

（二）操作規(guī)范

1.嚴格遵守無菌技術，如火焰滅菌接種環(huán)、旋轉開蓋等。

2.記錄所有操作步驟，確?？勺匪菪浴?/p>

（三）廢棄物處理

1.污染器材需高壓滅菌后丟棄。

2.生物危險樣品按醫(yī)療廢物規(guī)范處理，避免泄漏。

**一、微生物檢驗樣品處理程序概述**

微生物檢驗樣品處理是確保檢驗結果準確性和可靠性的關鍵環(huán)節(jié)。規(guī)范的樣品處理程序能夠有效去除干擾物質，富集目標微生物，并降低污染風險。本程序適用于食品、環(huán)境、醫(yī)療等領域的微生物檢驗樣品，涵蓋樣品接收、前處理、保存、運輸及實驗室準備等步驟。規(guī)范的樣品處理是后續(xù)分離、鑒定和計數(shù)等檢驗操作成功的基礎，任何環(huán)節(jié)的疏忽都可能導致結果偏差甚至錯誤。因此，必須嚴格按照標準操作規(guī)程執(zhí)行。

**二、樣品接收與標識**

（一）樣品接收

1.**信息核對與記錄：**首先核對送檢單與樣品標簽上的信息是否一致，包括樣品名稱、唯一標識碼、送檢單位、樣品來源、采集日期/時間、檢驗項目要求等。確認無誤后，在送檢單上簽字確認接收時間。記錄樣品當前狀態(tài)，如外觀（顏色、氣味、是否有沉淀或異物）、包裝完整性、溫度等，并特別留意是否有泄漏或污染跡象。對于緊急樣品，優(yōu)先處理并記錄。

2.**包裝檢查：**評估樣品包裝是否適合微生物檢驗。檢查包裝材料是否密封完好、無破損、無裂縫。對于冷藏或冷凍樣品，檢查保溫容器和冰排是否完好，溫度是否符合保存要求。包裝損壞的樣品可能已受污染，需謹慎處理或拒收，并通知送檢方。

3.**初步評估：**根據送檢信息和包裝狀態(tài)，初步判斷樣品的潛在風險和檢驗難度，為后續(xù)處理提供參考。

（二）樣品標識

1.**專用標簽使用：**為每個接收的樣品立即粘貼一個全新的、耐候性好的專用標簽。標簽應包含實驗室內部賦予的唯一樣品編號，以及接收日期和時間。確保標簽粘貼牢固，不易脫落或模糊不清，最好使用不易被篡改的材質或方法（如不易撕掉的膠水、直接刻印在特定區(qū)域等）。

2.**補充信息標注：**在標簽上注明樣品類型（如：食品、水樣、空氣沉降物等）和主要成分（如：肉類、奶制品、土壤等），有助于后續(xù)識別。對于特殊樣品（如含有抑制劑、高鹽、高糖等），需在標簽上明確標注，以便在處理時采取相應措施。

3.**生物安全標識：**如果樣品具有潛在生物風險（如來自醫(yī)療機構、可能含有致病微生物），必須在標簽上添加明顯的生物安全警示標識（如生物危險符號），并按照相應的生物安全等級要求進行后續(xù)處理和儲存。標識應清晰、醒目。

**三、樣品前處理**

（一）樣品均質化

1.**環(huán)境準備：**在潔凈臺或生物安全柜內進行均質操作。打開紫外燈照射30分鐘進行空間滅菌，隨后開啟通風，準備進行無菌操作。

2.**器材準備：**準備好所需的無菌均質器（如高速拍擊式均質器、粘度均質器或攪拌器）、無菌容器（均質袋或均質杯）、移液器和無菌吸頭等。確保所有器材已滅菌。

3.**樣品取樣：**根據樣品量和檢驗要求，使用無菌取樣工具（如無菌勺、無菌鑷子、注射器等）從樣品中取足量的代表性樣品。通常取10g（固體）或10mL（液體）作為初始均質量，具體依據檢驗標準或樣品特性確定。

4.**均質方法選擇與操作：**

(1)**固體樣品（如肉類、蔬菜、土壤等）：**將取好的樣品放入無菌均質袋或均質杯中。對于較硬的樣品（如肉類），可先切割成小塊。使用拍擊式均質器時，根據設備說明設置合適的轉速和拍擊次數(shù)（通常建議100-300次拍擊，或遵循標準操作規(guī)程）。對于粘稠或易碎樣品，可先加入少量無菌生理鹽水或稀釋液輔助均質。對于需要保留氣調環(huán)境的樣品（如含CO2的食品），使用專門設計的均質袋和均質器。

(2)**液體樣品（如牛奶、飲料、水樣等）：**充分振搖混勻，確保無沉淀物沉降。若液體粘稠或含有固體顆粒，可使用高速攪拌器進行均質，或先通過濾膜過濾（根據檢驗目的選擇合適的濾膜孔徑，如0.45μm或0.22μm），取濾液進行后續(xù)檢驗。

(3)**半固體樣品（如奶油、果醬等）：**可先冷凍使樣品變硬，然后進行切割和拍擊式均質，或使用專門的食品均質機。

5.**均質效果確認：**均質后，取少量樣品在顯微鏡下觀察，確認樣品組織已充分破碎，無大塊殘留物?？赏ㄟ^傾倒或攪拌測試樣品的均勻性。

（二）樣品稀釋

1.**稀釋液選擇：**根據樣品基質和目標微生物特性，選擇合適的無菌稀釋液。常用稀釋液包括：無菌生理鹽水（0.9%NaCl）、BufferedPeptoneWater(BPW)、BufferedSalineWater(BSW)、MacConkeyBroth（用于選擇性分離）、RBCBroth（用于酵母菌計數(shù)）等。稀釋液應無菌、無抑制劑，并能在所需溫度下保持穩(wěn)定。

2.**無菌操作：**在潔凈臺或生物安全柜內進行稀釋操作。使用無菌移液器吸取定量的無菌稀釋液，加入無菌容器中。

3.**梯度稀釋：**將步驟（一）中均質好的樣品，按照一定的體積比加入到稀釋液中，進行系列稀釋。這是為了將樣品中的微生物濃度降低到適合平板計數(shù)或直接接種的范圍內。

(1)**計算稀釋倍數(shù)：**常用的稀釋比例是1:10。例如，取1mL樣品加入9mL稀釋液中，即為10倍稀釋。記錄每次稀釋所用的樣品體積（V1）和稀釋液體積（V2）。

(2)**操作步驟：**

a.使用無菌移液器精確吸取V1體積（如1mL、0.1mL、0.01mL等，根據系列稀釋計劃確定）的均質樣品。

b.加入到含有V2體積（如9mL、9.9mL、99mL）無菌稀釋液的無菌容器（如試管、離心管）中。

c.充分混勻，確保樣品與稀釋液完全混合?？赏ㄟ^顛倒混勻或使用渦旋振蕩器（設置合適時間，避免產生過多氣泡）。

d.將混合液進行下一輪稀釋（再次取V1體積加入V2體積稀釋液），如此重復，直至獲得適合檢驗的稀釋度范圍（通常平板計數(shù)范圍在30-300CFU/mL）。

(3)**記錄：**詳細記錄每一步稀釋的倍數(shù)、所用體積和操作時間。建議制作稀釋記錄表。

4.**檢驗適用性：**在進行最終接種前，可取不同稀釋度的樣品液進行無菌檢驗（如培養(yǎng)），初步判斷哪個稀釋度適用于目標微生物的檢出或計數(shù)。

（三）富集培養(yǎng)（如需）

1.**目的與適用性：**當樣品中目標微生物含量很低，或需要增加特定微生物（如致病菌）的數(shù)量以便于檢測時，進行富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)利用特定培養(yǎng)基的選擇性或營養(yǎng)性，促進目標微生物生長，同時抑制非目標微生物。

2.**培養(yǎng)基選擇：**

(1)**通用營養(yǎng)培養(yǎng)基：**如營養(yǎng)肉湯（NutrientBroth），適用于培養(yǎng)大多數(shù)需氧或兼性厭氧細菌，用于樣品的初步增菌。

(2)**選擇性培養(yǎng)基：**根據要檢測的特定微生物種類添加抑制劑和選擇性成分。例如：

-沙門氏菌選擇性增菌：使用TSB（TrypticSoyBroth）或RBC（RapidBrilliantGreenBroth）等。

-李斯特菌選擇性增菌：使用AYE（Acetate-YeastExtract）或SPS（SodiumPhosphateSucrosePeptone）增菌液。

-布魯氏菌選擇性增菌：使用含有BrucellaAgar的特定培養(yǎng)基。

(3)**特殊培養(yǎng)基：**根據目標微生物的特殊營養(yǎng)需求選擇，如厭氧菌使用的厭氧培養(yǎng)基。

3.**操作步驟：**

(1)將適量（通常為0.1mL-1mL，依據標準或樣品量）的樣品稀釋液或均質液接種到無菌的富集培養(yǎng)液中。

(2)置于適宜的溫度（通常為30-37℃）和條件下（如需氧、厭氧）培養(yǎng)。

(3)培養(yǎng)時間根據目標微生物的生長速度和檢驗要求確定，通常為18-48小時。某些快速生長的微生物可能需要更短時間，而某些慢生長微生物（如分枝桿菌）則需要更長時間。

(4)培養(yǎng)期間定期觀察，如渾濁度變化、沉淀形成、氣體產生等。

4.**后續(xù)處理：**富集培養(yǎng)結束后，根據檢驗目的，將培養(yǎng)液進行系列稀釋，然后進行平板劃線分離、傾注平板或直接接種到選擇性/鑒定培養(yǎng)基上，進行純培養(yǎng)或計數(shù)。

**四、樣品保存與運輸**

（一）樣品保存

1.**保存必要性：**對于無法立即檢驗的樣品，必須進行妥善保存，以維持樣品中微生物的狀態(tài)，防止其過度生長、死亡或發(fā)生變異。不當保存是導致檢驗結果不準確的主要原因之一。

2.**保存條件：**

(1)**冷藏（4℃）：**最常用的保存方法，適用于大多數(shù)需氧和兼性厭氧微生物。冷藏能顯著減緩微生物生長速度。樣品應盡快放入4℃冰箱，避免在室溫下放置過久。

(2)**冷凍（≤-20℃）：**對于需要長期保存或保存后仍需進行某些特殊檢驗（如DNA檢測）的樣品，應冷凍保存。冷凍能更有效地抑制微生物生長。建議使用無菌冷凍管或袋，并加入少量稀釋液防止結冰損傷細胞。

(3)**特定要求：**某些微生物（如厭氧菌）或特殊樣品（如含抗生素的樣品）可能有特殊的保存要求，需遵循相關標準。

3.**保存時間：**樣品保存時間應盡可能短，通常建議不超過24小時。若需延長保存時間，應記錄原因，并評估對檢驗結果可能產生的影響。超過建議保存期限的樣品，應通知送檢方并謹慎處理。

4.**防止交叉污染：**不同樣品應分開存放，避免直接接觸。冷藏或冷凍設備應定期清潔和除霜，確保存儲環(huán)境潔凈。

（二）樣品運輸

1.**運輸容器：**使用清潔、干燥、密封的運輸容器。對于易破碎樣品，應使用帶緩沖墊的容器。

2.**包裝要求：**

(1)**防漏：**確保容器密封良好，防止樣品在運輸過程中泄漏、污染環(huán)境或造成交叉污染。必要時，在容器外部包裹吸水材料（如吸水紙、無紡布）。

(2)**保溫：**對于需要冷藏或冷凍的樣品，使用保溫箱（如泡沫箱）并放置足量的冰排或干冰，確保在運輸過程中溫度保持在要求范圍內（如冷藏樣品維持在4℃以上，冷凍樣品維持在-20℃以下）。記錄樣品在運輸過程中的溫度變化（如有條件）。

3.**標識與信息：**運輸容器上應清晰粘貼包含樣品唯一標識、類型、保存條件要求的標簽。如涉及生物安全風險，需使用符合規(guī)定的生物安全標識和包裝級別。

4.**運輸方式：**選擇合適的運輸工具和方法，避免劇烈震動和曝露于極端溫度（除非是冷凍樣品）。確保運輸過程符合實驗室和樣品的特性要求。

**五、實驗室準備**

（一）環(huán)境要求

1.**區(qū)域選擇：**樣品處理應在潔凈度符合要求的區(qū)域進行，通常為生物安全實驗室的潔凈工作臺（ClassII或ClassIII）或生物安全柜（BSC）。處理潛在生物風險樣品時，應在相應生物安全等級的實驗室進行。

2.**環(huán)境控制：**維持相對穩(wěn)定的溫度（22-26℃）和濕度（40-60%）。保持環(huán)境清潔，定期進行消毒（如使用70-75%乙醇擦拭工作表面）。

3.**空氣流向：**確?？諝饬飨蚍蠈嶒炇以O計要求，通常為單向流，防止污染。工作前開啟通風，并照射紫外燈消毒（30分鐘），待燈管冷卻后再開始操作。

（二）器材準備

1.**無菌器材：**準備充足的無菌器材，包括：

(1)**容器：**無菌試管、離心管、培養(yǎng)皿、均質袋/杯、移液管、容量瓶等。檢查包裝完整性，確認為無菌。

(2)**工具：**